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Revista chilena de infectología

versión impresa ISSN 0716-1018

Rev. chil. infectol. v.23 n.3 Santiago sep. 2006

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182006000300004 

  Rev Chil Infect 2006; 23 (3): 220-225

Microbiología clínica

 

Variantes genéticas de Mycobacterium tuberculosis aisladas de pacientes de la Xa Región de Chile

Genetic variants of Mycobacterium tuberculosis isolated from patients of the Xth Region of Chile

 

Marcos Mancilla E., Alexis Martínez H., Christian Palavecino B., Germán Rehren S., Pedro Lucero L., Gloria León R. y Ana-M Zárraga O.

Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile Facultad de Ciencias, Instituto de Bioquímica (MME, AMH, CPB, GRS, GLR, AZO)
Hospital Clínico Regional Valdivia, Chile Laboratorio Central (PLL)

Dirección para correspondencia


The emergence of new virulent and drug resistant strains of Mycobacterium tuberculosis has forced researchers to focus on the worldwide geographical distribution of the genetics variants of this pathogen. Mycobacterium bovis, a close related pathogen, contributes with human tuberculosis and therefore, it is particularly important in countries with significant bovine tuberculosis prevalence. Spoligotyping is currently one of the most widely used strategies for genotyping members of the M. tuberculosis complex. In this work, of a total of 41 isolates, 25 were from different patients from the Xth Region from Chile. These isolates formed 15 clusters of spoligotypes. Twenty four percent of the spoligotypes corresponded to the worldwide distributed spoligotype 53 (SpolDB4). A significant number of spoligotypes were identical to profiles found in Brazil followed by Argentina and Spain. Although the patients where from rural areas, no cases of zoonosis were observed. To establish the geographical distribution, persistence and routes of dissemination of the pathogen, a greater number of epidemiologicaly relevant isolates are being analyzed using the MIRUs-VNTRs.

Key words: Tuberculosis, genotyping, spoligotyping, Mycobacterium tuberculosis, epidemiology.

Resumen

La aparición de nuevas cepas de Mycobacterium tuberculosis de mayor virulencia y que presentan resistencia a los fármacos antituberculosos ha orientado la investigación al registro de la distribución geográfica mundial de las distintas variantes genéticas del patógeno. Mycobacterium bovis, un patógeno estrechamente relacionado, contribuye con la tuberculosis en humanos y por tanto, es de importancia en países que presentan alta prevalencia de tuberculosis animal. El análisis de espoligotipos es actualmente la estrategia más utilizada para tipificar genéticamente los miembros del complejo M. tuberculosis. En este trabajo, 25 aislados de un total de 41, provenientes de distintos pacientes de la Xa Región de Chile, formaron 15 grupos de espoligotipos. Un 24% correspondió al espoligotipo 53, de amplia distribución mundial. Un número importante de perfiles fueron idénticos a los encontrados en Brasil, seguido de Argentina y España. Aunque los pacientes eran de zonas rurales, no se detectó casos de zoonosis. Para establecer en forma más precisa el número y tipo de variantes genéticas presentes en nuestro país, nuestro laboratorio ha iniciado el análisis de un mayor número de cepas caracterizadas epidemiológicamente con técnicas más sensibles como MIRUS-VNTR.

Palabras claves: Tuberculosis, genotipificación, espoligotipificación, Mycobacterium tuberculosis, epidemiología.


Introducción

La tuberculosis es considerada una enfermedad re-emergente a nivel mundial debido al aumento en la prevalencia de variantes genéticas con resistencia a fármacos1-3, así como al incremento de pacientes con infección por VIH/SIDA que desarrollan tuberculosis3-6. La OMS estima que un tercio de la población mundial está infectada, presentándose entre 8 y 10 millones de nuevos casos por año7.

El agente etiológico es Mycobacterium tuberculosis, miembro del complejo Mycobacterium tuberculosis, al cual pertenecen además M. bovis, M. africanum, M. microti y M. canetti. Mycobacterium africanum produce la tuberculosis humana en África, M. microti la tuberculosis en ratas silvestres y M. canetti también es capaz de producir la tuberculosis en humanos8. La especie M. bovis ha sido subdividida recientemente en M. bovis subsp. bovis, resistente a pirazinamida (PZA) y M. bovis subsp. caprae, sensible a PZA9-11.
Mycobacterium bovis infecta al bovino y a una variedad de animales domésticos y silvestres. En el hombre, la infección por M. bovis se produce vía ingestión de productos crudos contaminados como la leche, o por inhalación de gotas en suspensión. En consecuencia, la población más expuesta es los agricultores y personal de mataderos y frigoríficos. La única forma de distinguir la tuberculosis bovina de la humana causada por M. tubeculosis, es mediante el cultivo y tipificación bacteriana, ya que ambas patologías no se pueden diferenciar clínica ni radiológicamente. A estas especies se suman al menos otras sesenta micobacterias oportunistas, no tuberculosas, capaces de causar enfermedades en humanos12.

En Chile, la incidencia de tuberculosis humana en el año 2004 fue de 16 casos por 100.000 habitantes, de acuerdo a la Organización Mundial de la Salud13, observándose en los últimos años una disminución en el coeficiente de declinación de la tasa de morbilidad14. Para entrar en una etapa avanzada de saneamiento se requiere de la identificación de las variantes genéticas de M. tuberculosis prevalentes en el país, cuya distribución a la fecha es desconocida. De esta forma será posible dilucidar las condiciones de permanencia y diseminación del patógeno, así como detectar el surgimiento de cepas multi-resistentes a los fármacos antituberculosos. En el ámbito clínico, el conocimiento de las variantes genéticas también es útil, ya que permite identificar brotes, infecciones exógenas, recaídas o fracasos de tratamiento, además de problemas de contaminación en el laboratorio.

Se han descrito diferentes marcadores genéticos de utilidad para el estudio del polimorfismo genético de aislados de M. tuberculosis. Entre éstos, la secuencia de inserción IS6110 ha sido una de las más utilizadas, por encontrarse en un número variable de copias entre las cepas de una misma especie. Sin embargo, la ausencia de este elemento en algunas variantes de M. tuberculosis, sumado a la complicación técnica de este procedimiento, cuestionan su utilidad como marcador para estudios genéticos moleculares15,16.

La técnica de spoligotyping (spacer oligonucleotide typing), basada en la presencia o ausencia de alguna de las 43 secuencias espaciadoras localizadas en la región de las repeticiones directas (DR) de M. tuberculosis17-19, es utilizada en el mundo como herramienta en investigaciones epidemiológicas y desarrollo de programas de prevención. Este procedimiento es ventajoso por cuanto permite rastrear y comparar rápidamente el genotipo con los existentes en la base de datos internacional SpolDB320.

El objetivo de este trabajo se centró en la identificación de los perfiles de espoligotipos de cepas chilenas de M. tuberculosis aisladas en la Xª Región geográfico-administrativa.

Material y Método

Aislados de micobacterias: Se analizó un total de 41 aislados clínicos de M. tuberculosis, provenientes del Laboratorio Central del Hospital Clínico Regional Valdivia. Estos aislados se obtuvieron a partir de esputo de 25 pacientes, cultivados en medio Löwenstein-Jensen.

Extracción de ADN genómico micobacteriano: La extracción de ADN genómico de M. tuberculosis, se realizó en base al protocolo descrito anteriormente21,22. Brevemente, las bacterias fueron lisadas en tampón conteniendo lisozima/proteinasa K/SDS seguido de una extracción orgánica, precipitación y lavado con etanol. El ADN finalmente se resuspendió en agua estéril y se almacenó a -20 ºC.

Identificación por RPC IS6110: Los ADNs extraídos fueron identificados utilizando el Mycobacterium PCR kit®, que incluye los reactivos necesarios para amplificar la secuencia IS6110 (BIOSONDA S.A., Chile, http://www.biosonda.cl). Los ciclos de amplificación incluyen una denaturación inicial a 94 ºC por 5 min, seguida de 30 ciclos de denaturación a 94 ºC por 1 min, apareamiento a 50 ºC por 1 min, extensión a 72 ºC por 1 min y extensión final a 72 ºC por 7 min. El producto de RPC esperado es de 181 pares de bases.

Spoligotyping: Las secuencias espaciadoras, presentes en el locus DR de cada aislado, se amplificaron por RPC utilizando los partidores biotinilados DRa (5'-GGTTTTGGGTCTGACGAC) y DRb (5'- CCGAGA GGGGACGGAAAC), incluidos en el sistema de spoligotyping (ISOGEN. Holanda, http://www.isogen.nl) y 10 ng del ADN genómico purificado, siguiendo las instrucciones del proveedor. Los productos fueron capturados por hibridación reversa sobre membrana de nylon conteniendo, inmovilizados, los oligonucleótidos correspondientes a cada secuencia espaciadora presente en el locus DR. La señal de hibridación se detectó por quimioluminiscencia, según las instrucciones del fabricante (DNA Detector® http://www.kpl.com).

Análisis de datos: Previo a la comparación con los perfiles de la base internacional de datos Spo1DB320, cada espoligotipo fue convertido al formato "octal", basado en el protocolo descrito por Dale et al (2001)23. El análisis de los perfiles de espoligotipos se realizó utilizando el programa GelCompar II (Applied Maths, Bélgica, http://www.applied-maths.com). Para el análisis de "clustering" se aplicó el método de UPGM24,25. Finalmente, los datos fueron convertidos a código binario para la comparación en SpolDB3 y en SpolDB426.

Controles: En el spoligotyping y en el análisis de los datos se incluyeron dos cepas de referencia: M. tuberculosis H37Rv, que se caracteriza por la ausencia de los espaciadores 20, 21 y del 33 al 36; M. bovis BCG, caracterizada por la ausencia de los espaciadores 39 a 4315,18.

Resultados

Las cepas incluidas en este estudio provinieron principalmente de pacientes varones, sobre 30 años de edad, vírgenes al tratamiento. Cada cepa mostró una morfología y crecimiento concordante con M. tuberculosis. Todas fueron ácido alcohol resistentes y formaron colonias no cromogénicas, visibles después de 4 a 6 semanas de incubación. Además, todos los aislados fueron caracterizados por RPC, generando el fragmento de 181 pares de bases, correspondiente al producto de amplificación de IS6110.

El perfil genético de cada cepa fue determinado utilizando la técnica de spoligotyping. La cepa certificada de M. tuberculosis, H37Rv, utilizada como control, presentó el perfil esperado, caracterizado por la ausencia de los espaciadores 20, 21 y del 33 al 36. Como control se utilizó además, la cepa certificada BCG, la cual presentó el perfil concordante con el de M. bovis26, caracterizado por la ausencia de los espaciadores 39 al 43 (Figura 1, panel B).

Figura 1. Espoligotipos de cepas de M. tuberculosis aisladas en el Hospital Clínico Regional Valdivia. Los perfiles de espoligotipos se compararon en base a las secuencias espaciadoras compartidas. Panel A. dendograma. Panel B: perfiles de espoligotipos. Panel C: antecedentes epidemiológicos.

El análisis de spoligotyping arrojó, del total de 41 aislados analizados, un total de 15 grupos (clusters) con perfiles de espoligotipos diferentes. El perfil encontrado con mayor frecuencia correspondió al espoligotipo 53 (Tabla 1). Este perfil es de amplia distribución internacional, encontrándose en Argentina, Brasil, E.U.A., Europa, África, Asia y Australia. Destaca un número importante de perfiles idénticos a los encontrados en Europa (Nº 106, 42, 20, 60, 33, 37, 53, 1560) y E.U.A. (ST 1277, 42, 20, 194, 211, 37 y 2). Las cepas chilenas comparten además, los espoligotipos 1277, 42, 291, 53, 2, 106, 20, 60, 194 con cepas de Brasil y los perfiles 1277, 42, 33, 291, 53 y 2 con Argentina, (Tabla 1). El perfil nombrado internamente con el código st10 no mostró identidad con los perfiles registrados en SpolDB3 ni en SpolDB4, designándose como ND (no determinado) (Figura 1, panel A).


Discusión

La implementación de procedimientos rápidos, sensibles y específicos para la identificación de M. tuberculosis y sus variantes genéticas, es clave para entrar en una etapa de erradicación y adecuada vigilancia de la enfermedad. En este estudio se presentan los perfiles genéticos de espoligotipos de las cepas de M. tuberculosis aisladas en la Xa Región de Chile.

La técnica de spoligotyping ha sido ampliamente utilizada en el concierto internacional para apoyar programas epidemiológicos en tuberculosis humana17,23. Una ventaja importante de esta metodología es que permite analizar, de manera simultánea, un número importante de cepas. Una segunda ventaja es la disponibilidad de las bases de datos internacionales, SpolDB3 y SpolDB417,25, las cuales contienen la colección más completa y actualizada de los espoligotipos de M. tuberculosis encontrados en distintos países. A la fecha, SpolDB3 registra 11.708 perfiles de espoligotipos, de los cuales 817 son compartidos y representativos de 90 países17. Comparativamente, SpolDB4 incluye 39.295 perfiles representativos de 141 países, de los cuales 1.939 son compartidos25. Una de las cepas de mayor distribución mundial es la perteneciente a la familia Beijing, asociada a resistencia a fármacos anti tuberculosos e importantes brotes de tuberculosis27.

En este estudio no se encontraron perfiles de espoligotipos concordantes con los perfiles generados por cepas de la familia Beijing.

La variante genética de M. tuberculosis encontrada con mayor frecuencia en este trabajo (24%), correspondió al espoligotipo internacional 53. Esta cepa se ha encontrado en Argentina, Brasil, África, Asia, Australia y Europa. Un número importante de las cepas encontradas en la Xª Región comparten perfiles idénticos con cepas encontradas en Brasil y Argentina28 (Figura 1, Tabla 1). El análisis comparativo de los octales muestra además, que de los 15 clusters identificados, 8 corresponden al perfil que caracteriza a las cepas de la familia latinoamericana LAM. Éstas presentan la numeración "6 0" en posición 7 y 8 respectivamente, de los 15 dígitos correspondientes al octal.

En el plano mundial, 3,1% de los casos de tuberculosis en humanos son causados por M. bovis31. Se ha informado de una relación directa entre la infección de M. bovis en el ganado y el desarrollo de la enfermedad en la población humana31. Recientemente, se detectó 35 casos de zoonosis en pacientes de Nueva York, E.U.A., debidos al consumo de queso fresco proveniente de México32. En Chile no se registran casos de zoonosis. Sin embargo, la prevalencia de tuberculosis bovina, medida en rebaños lecheros, con al menos un animal reaccionante, alcanza al 56% en las regiones Vª y Región Metropolitana, mientras que en las regiones VIIIª a Xª, esta frecuencia desciende a 5,11% (Dr. Alejandro Rivera, Servicio Agrícola y Ganadero, SAG). En consecuencia, estos registros indican la necesidad de mantener una vigilancia permanente de zoonosis. Según se observa en la Figura 1, en este trabajo no se encontraron perfiles coincidentes con M. bovis.

El perfil asignado en este trabajo con el código st10 es nuevo, ya que a la fecha no muestra identidad con perfiles descritos en la base de datos internacional. Estas cepas se caracterizan por presentar sólo los espaciadores 1 al 8 y 12 al 20. Resultados en progreso en nuestro laboratorio, utilizando los marcadores genéticos para multilocus, MIRUs (Mycobacterial Interspersed Repeat Units)29, entregarán una visión más precisa respecto al número y tipo de variantes genéticas de M. tuberculosis. La ventaja de estas secuencias deriva de su alta estabilidad en el genoma, con una variabilidad estimada en seis años30.

Actualmente, el programa nacional de control de tuberculosis humana en Chile ha logrado posicionarnos entre los países que tienen controlada esta patología. Sin embargo, el surgimiento de cepas resistentes a fármacos anti-tuberculosos y de mayor virulencia, así como el aumento en el desplazamiento y en la edad promedio de la población, exigen la incorporación de técnicas moleculares que otorguen mayor sensibilidad y poder discriminatorio. Esto involucra además, la aplicación de estrategias adecuadas para el registro y trazabilidad de las muestras, lo que permitirá asociar cada perfil genético de M. tuberculosis a una localidad geográfica determinada. De esta forma será posible establecer los nichos de permanencia y rutas de diseminación del patógeno.

Agradecimientos

A Christophe Sola y Nalin Rastogi del Instituto Pasteur, sede Guadaloupe, por el análisis de los resultados en las bases de datos SpolDB3 y SpolDB4 y revisión crítica del texto. A Patricio Bórquez, Jefe del Laboratorio Central del Hospital Clínico Regional Valdivia, por su contribución al inicio de esta investigación. A Francisco Saldías por su apoyo al desarrollo de este trabajo.

 

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Financiamiento: FONDEFD02I1111

Recibido: 17 noviembre 2005
Aceptado: 23 abril 2006

Correspondencia a:
Ana María Zárraga O.
anamariazarraga@uach.cl.

 

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