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Introducción
Pseudomonas aeruginosa es un bacilo gramnegativo no fermentador de glucosa, aerobio estricto, reconocido como patógeno oportunista, que afecta principalmente a pacientes de Unidades de Cuidados Intensivos (UCIs), pacientes inmunodeprimidos y pacientes con fibrosis quística, ocasionando infecciones asociadas a la atención en salud (IAAS) y neumonía asociada a ventilación mecánica (NAVM)1,2.
Recientemente, P. aeruginosa resistente a carbapenémicos se ha incorporado a la lista de patógenos prioritarios de la Organización Mundial de la Salud (OMS), para investigación y desarrollo de nuevos antimicrobianos y ha sido catalogada con prioridad crítica3. De acuerdo al Ministerio de Salud (MINSAL)4, en Chile esta bacteria se ubica en el primer lugar como agente etiológico de NAVM en adultos y, en segundo lugar, en casos pediátricos3. Además, se informa su importante aislamiento de otros cuadros clínicos como infección urinaria en pacientes con catéter urinario permanente (CUP), en herida operatoria e infecciones del torrente sanguíneo, especialmente en pacientes inmunodeprimidos donde corresponde al segundo microorganismo más frecuentemente aislado4. Actualmente, el aislamiento de cepas de P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos, grupo de antimicrobianos que representan la última opción terapéutica, ha sido reconocido por la OMS como un serio problema a nivel global, que conlleva a infecciones con alta tasa de mortalidad, prolongadas estadías hospitalarias y elevados costos en el sistema de salud3.
La resistencia a carbapenémicos en P. aeruginosa puede estar mediada por múltiples mecanismos2. Sin embargo, la capacidad de sintetizar enzimas capaces de hidrolizar estos compuestos, denominadas carbapenemasas, constituye actualmente el mecanismo de resistencia más importante, debido a la capacidad de diseminación horizontal que pueden presentar los genes codificantes de estas enzimas.
En Chile, existe muy poca información acerca de la resistencia enzimática a imipenem y meropenem exhibida por cepas de P. aeruginosa5–7, y por esto, el objetivo de este estudio fue determinar el tipo de carbapenemasa en un grupo de aislados de P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos y la relación genética entre los aislados productores de carbapenemasas.
Metodología
Aislados bacterianos
Se incluyó 113 aislados de P. aeruginosa resistentes a imipenem y/o meropenem, obtenidos entre los años 1998 y 2019 en 12 hospitales de 9 ciudades de Chile: Antofagasta 21 (18,6 %), Santiago 34 (30,1 %), Concepción 11 (9,7 %), Talcahuano 7 (6,2 %), Temuco 23 (20,4 %), Puerto Montt 8 (7,1 %) y 9 aislados (8 %) provenientes de otras ciudades, que incluyen Talca, Lota y Los Ángeles.
Los aislados de P. aeruginosa fueron recuperados principalmente de heridas/abscesos (17%), tracto respiratorio (16%), catéter/sonda (11,8%), sangre/orina (11%), hisopado rectal (4,2%) y en 39,8% de los aislados no se tuvo acceso al origen de la muestra.
Susceptibilidad in vitro a los antimicrobianos
El comportamiento de los aislados a los antimicrobianos fue evaluado mediante la determinación, por dilución seriada en agar, de la concentración inhibitoria mínima (CIM) de imipenem (IPM), meropenem (MEM), amikacina (AMK), gentamicina (GEN), ciprofloxacina (CIP), cefotaxima (CTX) y piperacilina/tazobactam (PIP/TAZO), siguiendo las recomendaciones y puntos de corte propuestos por el Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2015, CLSI 2019)8,9. Se empleó como control la cepa P. aeruginosa ATCC 27853. El comportamiento frente a colistina se determinó mediante el método Colistín Agar-Spot test (CAST) propuesto por el Servicio de Antimicrobianos, INEI ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” de Argentina (2017)10.
Producción y genes de carbapenemasas
En los 113 aislados se investigó la producción de carbapenemasas por el método de Carba NP descrito por Dortet y cols. (2014)11. En aquellos aislados que presentaron una prueba fenotípica positiva se investigaron mediante reacción de polimerasa en cadena (RPC) los siguientes genes que codifican carbapenemasas: blaVIM, blaGES, blaKPC, blaIMP, blaGIM, blaSPM, blaNDM y blaOXA-48, de acuerdo al protocolo descrito por Poirel y cols.12. Los fragmentos de ADN amplificados se separaron en un gel de agarosa al 2% conteniendo 1x SafeView™ Plus (Applied Biological Material, Inc.) a 100 V durante 45 min en 0,5x de búfer TAE. Los productos de amplificación se enviaron a secuenciar a la compañía MacroGen Corp. U.S.A (9700 Great Seneca Highway, Rockville, MD 20850). Posteriormente, se realizaron análisis bio-informáticos comparando las secuencias obtenidas con aquellas informadas en la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI), utilizando la herramienta BLAST y el programa MEGA 5 y MEGA 6.
Tipificación molecular de los aislados productores de carbapenemasa
Se realizó tipificación molecular mediante macro-restricción del genoma bacteriano con la enzima de corte infrecuente SpeI (30 units/μL; Promega Corp., Madison, USA) y posterior separación de los fragmentos producidos por electroforesis de campo pulsado (PFGE, del inglés pulsed-field gel electrophoresis) de acuerdo al protocolo de Jordan y Dalmasso (2015)13. La cepa Salmonella serovar Braenderup H9812 (ATCC BAA 664) se digirió con XbaI (10 units/μL; Thermo Scientific, Massachusetts, E.U.A.) y se usó como estándar de tamaño. El análisis de los geles se realizó con el programa BioNumerics v. 6.611 (AppliedMaths, Inc., Austin, TX, E.U.A.) comparando los patrones de corte mediante el coeficiente de Dice y construyendo el dendograma de las cepas por UPGMA (del inglés unweighted pair-group method with arithmetic means). Los parámetros de análisis utilizados fueron: tolerancia 1,5% y optimización 1%. Las cepas se clasificaron como “genéticamente relacionadas” cuando presentaron un valor mayor o igual a 80% de relación entre ellas; y como “clonales” cuando presentaron 100% de identidad.
Resultados
En 61 de los 113 aislados, el test Carba NP fue positivo, indicando la producción de alguna carbapenemasa y en 52 de ellos no se detectó la producción de estas β-lactamasas. Los aislados se separaron en tres grupos: productores de VIM (n: 29), productores de KPC (n: 32) y no productores de carbapenemasas (n: 52). El gen blaKPC fue amplificado en 32 aislados (52,5%) y el gen blaVIM en 29 (47,5%), y en ninguno de ellos se detectó la co-portación de ambos genes.
La resistencia a los antimicrobianos ensayados se muestra en la Tabla 1. Se puede observar que el porcentaje de aislados resistentes a IPM es mayor en aquellos productores de alguna carbapenemasa, con un valor de CIM mayor en los productores de KPC (2-1.024 μg/mL). En cambio, el porcentaje de aislados resistentes a MEM es elevado en los tres grupos (> 86%) y nuevamente la CIM a este carbapenémico es más elevada en los aislados KPC (+) (8-1.024 μg/mL). Respecto de los otros antimicrobianos ensayados, la resistencia a CIP es elevada y similar, tanto en los aislados productores como no productores de carbapenemasas (> 90%), con valores de CIM90 que variaron entre 32 y 128 μg/mL. Para AMK se presenta el menor porcentaje de aislados resistentes (20,8-36,7%) en los tres grupos estudiados y para GEN sólo se observó un elevado porcentaje de resistencia (75%) en los aislados VIM (+). Se observó un elevado porcentaje de aislados resistentes a TPZ en el grupo KPC (+) (76,7%); en cambio, en los aislados VIM (+) la resistencia alcanzó sólo a 14,3%; sin embargo, en este grupo el porcentaje de aislados con susceptibilidad intermedia alcanzó a 64,3%. La resistencia a CAZ fue mayor entre los aislados productores de carbapenemasas, con 64,3% para aislados VIM (+) y 83,3% para aislados KPC (+). En los aislados no productores de carbapenemasas, la resistencia a esta cefalosporina sólo alcanzó a 37,5%. Al ensayar el colistin agar-spot test, todos los aislados fueron no resistentes a colistina (CIM ≤ 3 μg/mL). El análisis molecular de los genes de carbapenemasas indica que la variante producida por los aislados productores de KPC corresponde al alelo blaKPC-2 y para los aislados productores de VIM a blaVIM-2.
Tabla 1 Actividad de agentes antibacterianos sobre aislados hospitalarios de Pseudomonas aeruginosa resistentes a carbapenémicos
| Cepas VIM (+) | ||||
| Antibacterianos | Rango CIM | CIM50 | CIM90 | % cepas R |
| GEN | ≤ 1 - > 1.024 | > 128 | 1.024 | 75,0 |
| AMK | 4 - > 256 | 32 | > 256 | 35,7 |
| CIP | 2 - > 128 | 32 | 128 | 100,0 |
| CAZ | ≤ 8 – 128 | 32 | 64 | 64,3 |
| TPZ | 8 – 256 | 32 | 128 | 14,3 |
| lPM | 2 – 256 | 16 | 256 | 89,7 |
| MEM | 4 – 128 | 64 | 128 | 96,6 |
| Cepas KPC (+) | ||||
| Antibacterianos | Rango CIM | CIM50 | CIM90 | % cepas R |
| GEN | 2 - > 128 | 8 | 64 | 23,3 |
| AMK | ≤ 2 > 256 | ≤ 16 | 128 | 36,7 |
| CIP | ≤ 4 - > 128 | 32 | 64 | 93,3 |
| CAZ | 8 – 256 | 32 | 64 | 83,3 |
| TPZ | ≤ 8 - > 256 | 256 | > 256 | 76,7 |
| lPM | 2 – 1.024 | 256 | 256 | 93,8 |
| MEM | 8 – 1.024 | 256 | 256 | 100,0 |
| Cepas sin carbapenemasa | ||||
| Antibacterianos | Rango CIM | CIM50 | CIM90 | % cepas R |
| GEN | 2 - > 1.024 | ≤ 8 | > 128 | 27,1 |
| AMK | ≤ 2 - > 256 | ≤ 16 | 128 | 20,8 |
| CIP | 2 - > 128 | 4 | 32 | 100,0 |
| CAZ | ≤ 2 - > 1.024 | 16 | 64 | 37,5 |
| TPZ | ≤ 8- 256 | 32 | 128 | 27,1 |
| lPM | 2- 256 | 8 | 64 | 53,8 |
| MEM | 2 – 256 | 16 | 128 | 86,5 |
GEN: gentamicina; AMK: amikacina; CIP: ciprofloxacina; CAZ: ceftazidima; TPZ: piperacilina/tazobactam; IPM: imipenem; MEM: meropenem; CIM: concentración inhibitoria mínima (µg/mL); CIM50: CIM que inhibe 50 % de las cepas; CIM90: CIM que inhibe 90 % de las cepas.
La tipificación molecular (PFGE) de 36 aislados de P. aeruginosa productores de carbapenemasas (Figura 1) da cuenta que mayoritariamente existe policlonalidad en este grupo de aislados obtenidos en los hospitales de Chile. Se observan 7 clústeres que agrupan a 21 cepas, aisladas en hospitales de Santiago, Temuco y Puerto Montt, y en sólo uno de ellos (clúster VI) hay dos cepas productoras de KPC que corresponde a un clon aislado en la ciudad de Temuco (P372 y P383), que se relaciona en 83% con un aislado productor de la misma carbapenemasa, proveniente de la ciudad de Santiago (P345). Los clústeres IV y V, a su vez, se subdividen en sub-clústeres con identidad mayor a 82% y compuestos por aislados productores de KPC, provenientes principalmente de Temuco.
Figura 1 Dendrograma de aislados de Pseudomonas aeruginosa productores de carbapenemasas provenientes de hospitales de Chile, usando SpeI y PFGE. HRA: Antofagasta; HCUCH, HES, HCPUC: Santiago; HRDT: Talca; HDT: Temuco; HPM: Puerto Montt. Se usó 80% de similitud para definir cepas genéticamente relacionadas. I-VII: clústeres de cepas relacionadas genéticamente.
Discusión
La importancia de P. aeruginosa como patógeno causante de IAAS está ampliamente documentada en el mundo y también en Chile1–4, más aún si se está frente a una emergencia y diseminación de aislados productores de carbapenemasas, que son ampliamente resistentes a muchos antimicrobianos, con excepción de colistina14. El principal mecanismo de resistencia a carbapenémicos en P. aeruginosa, descrito hasta la fecha, se basa en la impermeabilidad de la membrana externa debido a la pérdida o inactivación de la porina OprD en combinación con la producción de alguna β-lactamasa del tipo AmpC, clase A o clase D; siendo también la desregulación de bombas de expulsión un importante mecanismo de resistencia a carbapenémicos en esta especie de bacilo gramnegativo no fermentador de glucosa15. Sin embargo, la resistencia también puede estar mediada por la adquisición de elementos genéticos móviles que codifican la producción de β-lactamasas del tipo carbapenemasas14, las que se han diseminado ampliamente en Enterobacterales y también en P. aeruginosa y Acinetobacter baumannii durante los últimos 10 años16. La distinción entre estos mecanismos de resistencia tiene importantes implicaciones para el control de infecciones17. Por esta razón, los resultados obtenidos en este trabajo son importantes, ya que en Chile es escasa la información acerca de los mecanismos enzimáticos de resistencia a carbapenémicos involucrados en la resistencia a IPM y MEM en P. aeruginosa. En Chile, el primer hallazgo de una carbapenemasa en Pseudomonas fue descrito en 2004 en una cepa de P. fluorescens productora de la metalo-β-lactamasa (MBL) VIM-2, aislada de hemocultivo18. Más aún, hasta hace unos años era el único tipo de carbapenemasa descrito en aislados de P. aeruginosa, recuperados de muestras clínicas en Chile5. Los resultados de esta investigación dan cuenta que en los hospitales de Chile ha habido un aumento de aislados productores de carbapenemasas, ya que en 54% de las cepas fue positivo el test de Carba NP, lo que fue confirmado por RPC al amplificar los genes que codifican para KPC y VIM. Esta frecuencia es mayor que la informada en estudios previos realizados en Latinoamérica6 y en un estudio más reciente realizado con cepas aisladas en Perú entre 2014 y 2015, se informa que sólo 10% de ellas son productoras de carbapenemasas, y todas ellas correspondieron a una MBL que no fue identificada19. Por otra parte, además se puede evidenciar que la presencia del gen blaKPC, el más comúnmente identificado en bacilos gramnegativos en Chile7, ha comenzado a desplazar al gen blaVIM, que era el que habitualmente se describía en aislados de P. aeruginosa recuperados en hospitales de Chile5 y también del mundo20,23. Sin embargo, no se encontró aislados que co-portaran simultáneamente ambos genes, como se ha descrito previamente para cepas de P. aeruginosa aisladas en Chile21–23. Ninguno de los otros genes investigados amplificó en los aislados del estudio, dando cuenta que la diversidad de carbapenemasas en P. aeruginosa es aún limitada en Chile, una situación que difiere de lo informado para Latinoamérica6. El estudio molecular de las variantes alélicas de las carbapenemasas permitió afirmar que éstas corresponden a VIM-2 y KPC-2, concordando con lo que mayoritariamente se ha descrito para Latinoamérica y el mundo6,14. Es importante destacar que el porcentaje de aislados no productores de alguna carbapenemasa no es despreciable (46%), lo que es especialmente importante porque las infecciones causadas por este grupo de aislados podrían ser tratadas con combinaciones como ceftolozano/tazobactam, ya que se ha demostrado que ceftolozano (cefalosporina antipseudomonas) no se ve afectada por mecanismos como la pérdida de la porina OprD y la sobre-expresión de las bombas de expulsión24.
Al analizar la resistencia a carbapenémicos, se pudo comprobar que la CIM de IPM y MEM fue mayor en los aislados productores de carbapenemasas que aquellos no productores, con valores de CIM50/90 de 256 μg/mL, para aislados KPC (+), lo que está en concordancia con un estudio realizado en Estados Unidos de América, que informa la misma situación para enterobacterias16, aunque en ese trabajo los valores de CIM de estos carbapenémicos eran más bajos. Estos hallazgos dan cuenta que la producción de carbapenemasas otorga grados más elevados de resistencia. Desde el punto de vista clínico, una alternativa para el tratamiento de infecciones producidas por P. aeruginosa productoras de KPC es la combinación ceftazidima/avibactam; sin embargo, el gran problema para el laboratorio, y por ende para el médico clínico, son aquellos aislados que son productores de metalo- β-lactamasas, como la enzima tipo VIM, que son resistentes a la combinación ceftazidima/avibactam25. De ahí la importancia de poder determinar qué tipo de carbapenemasa es la que está sintetizando el aislado resistente al carbapenémico y no sólo determinar la producción de una carbapenemasas por la prueba fenotípica Carba-NP. En general esta prueba fenotípica tiene un elevado rendimiento con una sensibilidad y especificidad de 98% cuando se estudió en P. aeruginosa26, como también se observó en este trabajo, y tiene un rendimiento más bajo en A. baumannii, por la producción de carbapenemasas del grupo OXA, que ha ido mejorando con diferentes variantes del método. En general, el mayor problema es la detección de OXA-48 que epidemiológicamente es importante en Enterobacterales en España27, por ejemplo, pero poco informada hasta ahora en Chile28.
Por otra parte, la diseminación del mecanismo de resistencia a carbapenémicos, mediado por carbapenemasas en P. aeruginosa, es lo que más preocupa, debido a su creciente prevalencia y su naturaleza fácilmente transmisible. Esto último debido a que los genes que las codifican se transportan en elementos genéticos móviles, que también portan genes de resistencia a otros agentes antibacterianos, otorgándoles el carácter de cepas multi-resistentes a los antimicrobianos29. Todas las cepas fueron no resistentes a colistina, lo que está en concordancia con muchos estudios que informan una elevada susceptibilidad a esta polimixina entre las cepas de P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos, con valores de susceptibilidad por sobre 90% de las cepas6.
El estudio de tipificación molecular de los aislados productores de carbapenemasas da cuenta que existe policlonalidad entre ellas, distinguiendo 7 clústeres con sólo dos cepas clonales en el grupo productor de KPC. No existe relación genética entre aislados productores de KPC y VIM y los clústeres están formados por un solo tipo de aislados (productor de KPC o productor de VIM). Por otra parte, sólo en dos clústeres se agruparon aislados de dos ciudades (Temuco y Santiago), lo que podría indicar que las cepas relacionadas genéticamente se distribuyen mayoritariamente sólo en el hospital de origen. Esta policlonalidad también había sido observada en trabajos previos5,6 que describen la producción de VIM en cepas de P. aeruginosa provenientes de un hospital de Santiago de Chile. La policlonalidad de los aislados encontrados en este estudio podría también ser evidencia que la diseminación de las carbapenemasas entre los aislados de P. aeruginosa recuperados en Chile está mediada principalmente por transferencia horizontal de genes (THG), más que por diseminación de un clon productor de estas enzimas.
Aunque estos resultados nos permiten evidenciar el aumento de aislados de P. aeruginosa productores de carbapenemasas y dar cuenta que probablemente la emergencia de aislados KPC (+) sea producto de la adquisición de elementos genéticos móviles por transferencia horizontal genética (THG), desde Klebsiella pneumoniae, que es la Enterobacteriaceae que con mayor frecuencia se ha descrito produciendo este tipo de enzimas en Chile, es necesario continuar estudios que diluciden cómo está ocurriendo la dinámica de la diseminación de carbapenemasas en este importante patógeno causante de IAAS.
