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Parasitología latinoamericana

versión On-line ISSN 0717-7712

Parasitol. latinoam. v.61 n.3-4 Santiago dic. 2006

http://dx.doi.org/10.4067/S0717-77122006000200006 

 

Parasitol Latinoam 61: 133 - 137, 2006 FLAP

ARTÍCULO ORIGINAL

 

Comparación de métodos de lisis y extracción de ADN de trofozoítos de Giardia lamblia

COMPARISON OF LYSIS METHODS AND DNA EXTRACTION OF GIARDIA LAMBLIA TROPHOZOITES

 

NORA B. MOLINA*, DANIELA POLVERINO*, MARTA C. MINVIELLE*, MARÍA APEZTEGUÍA**, MARIO AGUILAR*** Y JUAN A. BASUALDO*

* Cátedra de Microbiología y Parasitología. Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de La Plata. Argentina.
** Comisión de Investigaciones Científicas de la Provincia de Buenos Aires. Argentina.
*** Instituto de Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Ciencias Exactas. Universidad Nacional de La Plata. Argentina.

Dirección para correspondencia


The efficiency of lysis procedures and DNA purification treatments of Giardia lamblia trophozoites were evaluated regarding the breaking-up efficiency, quantity and pureness of DNA, processing time and costs. Five lysis methods (distilled water and heating; distilled water, heating and proteinase K; buffer D Lysis; buffer E lysis, and commercial kit), and three DNA purification methods (phenol:chloroform:isoamilic, Chelex 100 and commercial kit) were tested. The obtained data were statistically analyzed. The buffer E lysis and Chelex combination was simple and economic method which produced high DNA performance with low pureness. Commercial kit was simple and expensive method which generated low yields of DNA with appropriate purity level for molecular analysis.

Key words: Giardia lamblia, DNA extraction, lysis.

RESUMEN

Se evaluó la eficiencia de procedimientos de lisis y tratamientos de extracción de ADN de trofozoítos de Giardia lamblia respecto a la eficiencia de ruptura, cantidad y pureza de ADN, además de los tiempos de procesamiento y costos. Se testearon cinco métodos de lisis (agua destilada y calor; agua destilada, calor y proteinasa K; buffer de lisis D; buffer de lisis E y un kit comercial) y tres métodos de purificación de ADN (fenol:cloroformo: isoamílico; Chelex 100 y un kit comercial). Los datos obtenidos se analizaron estadísticamente. La combinación de buffer de lisis E y Chelex fue un método simple y económico, que produjo alto rendimiento de ADN con baja pureza. Ella técnica comercial fue un método simple, más costoso que produjo bajas cantidades de ADN con un nivel de pureza apropiado para estudios moleculares.


INTRODUCCIÓN

Giardia lamblia (sinónimos: G. intestinalis, G. duodenalis) es el protozoo intestinal productor de diarrea no bacteriana diagnosticado con más frecuencia en todo el mundo, afectando prin-cipalmente a niños de países desarrollados y en desarrollo1,2. El diagnóstico convencional se realiza por observación microscópica o por detección de antígenos o anticuerpos. Ambos métodos tienen sus limitaciones3. El desarrollo de métodos moleculares ha creado la necesidad de implementar técnicas simples y eficientes de extracción de ADN.

El aislamiento de ADN de alto peso molecular, intacto y con el menor número de contaminantes es esencial para la aplicación de técnicas moleculares tales como RFLP (polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción), hibridización, PCR (reacción en cadena de la polimerasa), PFGE (electroforesis en gel de campo pulsante) , Southern blot, ADN microarrays y construcción de biblioteca genómica4.

Existe abundante bibliografía sobre la extracción y purificación de ácidos nucleicos de protozoos5-11. No obstante, los protocolos standards y métodos comerciales disponibles en la actualidad no presentan patrones de rendimiento homo-géneos12. En consecuencia, es fundamental determinar el sistema de extracción y purificación de ácidos nucleicos más adecuado para cada tipo de muestra.

Para optimizar la metodología de extracción de ADN, se compararon distintos procedimientos de lisis y purificación de ácidos nucleicos. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la eficiencia de cinco protocolos de lisis y tres métodos de purificación de ADN de trofozoítos de G. lamblia.

MATERIAL Y MÉTODOS

Parásitos: Se partió de un cultivo en fase exponencial de una línea clonal de trofozoítos de G. lamblia (GS/M-83-H7) en medio TYI-S-33 modificado cedido gentilmente por el Dr. Pablo Pérez del Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos, CIDCA). Los parásitos se desprendieron de la superficie mediante la incubación en hielo por 10 min. Los trofozoítos fueron cosechados mediante centrifugación a 1.000 g por 3 min a 4º C13 y lavados una vez con PBS frío. El pellet fue resuspendido en solución fisiológica estéril y se realizó el recuento de trofozoítos en Cámara de Neubauer, por triplicado. Los parásitos se fraccionaron en viales con 109 trofozoítos cada uno y se conservaron a -80º C hasta su utilización. Cada vial se descongeló rápidamente, se centrifugó a 5.000 g por 5 min. El sobrenadante fue removido y el pellet se resuspendió en 200 ml de solución fisiológica estéril. A cada alícuota de trofozoítos se le realizó el recuento en Cámara de Neubauer antes y después de cada procedimiento de ruptura5.

Lisis de Trofozoitos: Cada alícuota con 200 ml de trofozoítos se procesó para la ruptura de los mismos mediante cinco métodos. Cada protocolo se realizó por triplicado y las muestras se conservaron a -20º C hasta la purificación de ADN.

En el método 1, se mezcló la alícuota de trofozoítos con agua destilada (AD) en partes iguales y se hirvió durante 45 min. En el método 2, se procedió de igual forma que en el método 1 y posteriormente se le adicionó proteinasa K (1 mg/ml), se incubó a 60ºC durante 24 h y luego se hirvió por 15 min. En el método 3, los trofozoítos se mezclaron 1:1 con buffer de lisis D (NaCl 0,15 M, EDTA 100 mM, SDS 0,5%, proteinasa K 1 mg/ml), se incubaron a 60ºC por 24 h y se hirvieron 15 min14. En el método 4, se mezclaron 1:1 con buffer de lisis E (Tris-HCl 100 mM, EDTA 100 mM, SDS 2%, NaCl 0,2 M, Mercaptoetanol 1mM, proteinasa K 1 mg/ml), se incubaron a 60ºC por 24 h y se hirvieron 15 min15. Para el método 5, se utilizó el miniKit Qiagen® de spin-columns (QIAamp DNA stool minikit, Cat. 51504).

Purificación de ADN: Los trofozoítos lisados por los métodos 1 al 4, fueron sometido a dos procesos de purificación de ADN:

A) Purificación con solventes orgánicos (fenol: cloroformo: alcohol isoamílico) (25:24:1), precipitación con etanol absoluto y acetato de sodio (0,3 M), lavado en etanol 70% y disolución con agua (100 µl)16.
B) Resina Chelex 100 (Biorad®). Cada muestra se mezcló con igual volumen de una suspensión acuosa de resina Chelex 100 al 5% y se realizó un ciclo de calentamiento: 98º C 10 min en el termociclador (Techne Thechgene)6. El sobrenadante fue precipitado en etanol absoluto y resuspendido en agua (100 µl).

Con los trofozoítos lisados por el método 5 se continuó la extracción según protocolo del fabricante (QIAamp DNA stool minikit).

La eficiencia de los protocolos de lisis se evaluó sobre la base de los porcentajes de ruptura celular de cada tratamiento. Los métodos de purificación de ADN fueron evaluados analizando la concentración de ADN obtenido por Absorbancia a 260 nm (Espectrofotómetro Shimadsu, UV-visible) y la pureza se evaluó según el cociente 260/280.

Análisis estadístico: Para comparar el porcentaje de lisis entre los diferentes métodos se utilizó Análisis de Varianza de un factor y Bonferroni. Para identificar los métodos de extracción que presentaron diferencias se utilizó Análisis de Varianza de dos factores y Bonferroni. El método 5 se analizó por contrastes.

RESULTADOS

Las técnicas de ruptura de trofozoítos evaluadas en este trabajo difirieron entre sí en la eficiencia de lisis y en el tiempo requerido para procesar cada muestra. Estos tiempos y los porcentajes de ruptura se muestran en la Tabla 1. El análisis estadístico de los porcentajes de lisis reveló que los métodos 3, 4 y 5 no presentaron diferencias entre sí. Los métodos 1 y 2 fueron significativamente menores que los demás (p = 0,000).


Cuando se compararon los 2 métodos depurificación de ADN, el protocolo de la resina Chelex mostró el mayor rendimiento de ADN, independientemente del método de lisis utilizado. Las concentraciones de ADN obtenidas con la combinación de los métodos de lisis 1 al 5 y los métodos de purificación se muestran en la Figura 1.


 

Figura 1. Comparación de la concentración de ADN de trofozoitos de Giardia lamblia obtenido según la combinación del método de lisis y purificación de ADN. Los valores son medias de tres muestras con sus desvíos standards. 1: Agua destilada y calor, 2: Agua destilada, calor y proteinasa K, 3: Buffer D y proteinasa K, 4: Buffer E y proteinasa K, 5: kit comercial. * estado.

La pureza se evaluó sobre la base de los cocientes de absorbancias 260/280 (Tabla 2). El método 5 difirió del método 1 (p = 0,002), del método 2 (p = 0,044) y del método 3 (p = 0,002). No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los métodos de la resina Chelex + buffer E y el QIAamp DNA stool minikit.


El protocolo de purificación con fenol demandó aproximadamente 2 días, la técnica con Chelex, una hora y el kit comercial requirió 3 horas de proceso. El análisis de los costos reveló que cualquier combinación de métodos de lisis y purificación analizados en este trabajo tuvo un valor inferior a 2 dólares/muestra, excepto el QIAamp DNA stool minikit cuyo costo fue de 9 dólares/muestra.

DISCUSIÓN

En este estudio se compararon cinco protocolos de lisis y tres de purificación de ADN de trofozoítos de G. lamblia respecto a la eficiencia de ruptura, cantidad y pureza de ADN. Se realizó, además, un análisis de tiempos y costos de procesamiento de los métodos empleados.

Respecto a la eficiencia de lisis, los métodos 1 y 2 permitieron procesar las muestras en menos de 1 h aunque presentaron los menores porcentajes de ruptura. Los métodos 3, 4 y 5 mostraron altos porcentajes de lisis pero los tiempos de procesamiento difirieron ampliamente desde 30 min a 24 h. Por lo tanto, para procesar un gran número de muestras en cortos tiempos, las mejores opciones fueron el método 1 (AD y calor) y el 5 (QIAamp DNA stool minikit). En relación a los costos, evidentemente el método 1 fue más económico aunque su rendimiento de lisis resultó inferior al 5.

Los tres protocolos de purificación realizados (Chelex, Solventes orgánicos y QIAamp DNA stool minikit) difirieron en cantidad y pureza de ADN, tiempos de procesamiento y costos.

La técnica de Resina Chelex mostró la mayor eficiencia de recuperación de ADN con un coeficiente 260/280 mayor de 1,0. Su uso redujo la manipulación de las muestras, minimizando las posibles contaminaciones accidentales durante la extracción de ADN. Presentó la ventaja de ser una técnica económica, sencilla y rápida.

El procedimiento comercial tuvo bajo rendimiento de ADN con elevado índice de pureza. Fue el protocolo más costoso pero su tiempo de realización fue breve. Su principal limitación fue el volumen inicial de muestra a diferencia de los otros métodos que permitirían partir de mayores volúmenes de muestra.

La purificación con solventes permitió obtener cantidades de ADN intermedias entre los otros dos métodos. A diferencia del kit comercial, es un procedimiento económico. Nuestro análisis concuerda con el de otros17, concluyendo que la extracción con solventes orgánicos requiere mayor tiempo y manipulación, siendo tedioso el procesamiento de un gran número de muestras.

En la bibliografía consultada12 se reportan resultados variables, donde se observa mayor recuperación de ADN de semen utilizando un kit comercial (QIAamp tissue Kit, Qiagen®) respecto a la purificación con fenol. Así se ha reportado que el kit comercial utilizado (Instagene Matrix®) para la extracción de ADN de T. cruzi tuvo la menor recuperación y el menor índice de pureza, comparado con los métodos del Salting out y el de CTAB (Bromuro de Cetiltrime-tilamonio) seguido de extracción con solventes18. También se han evaluado distintos protocolos de purificación de ADN de tejidos y concluyeron que el método de Chelex es seguro, simple, más efectivo y económico que los otros métodos, incluído el kit comercial QIAamp DNA minikit (Qiagen®)19. Por otra parte, también se ha reportado una mayor recuperación de ADN al procesar muestras plasmáticas mediante el método de KingFisher respecto al Kit QIAamp DNA Midi reagent set (Qiagen®)20. Todos estos resultados son difíciles de comparar con los obtenidos por nuestro grupo de trabajo debido a la diversidad de las muestras procesadas y a la utilización de diferentes kits comerciales. Otros investigadores trabajando con E. coli publicaron que el rendimiento promedio de ADN fue menor con el kit QIAamp DNA stool minikit (Qiagen®) que cuando utilizaron Heat Lysis protocol21. Sin embargo, los cocientes 260/280 para el kit fueron mayores que para el otro método, coincidiendo con nuestros resultados.

Todos los métodos de lisis ensayados reportaron un porcentaje de lisis mayor al 90%. Los tres protocolos de purificación realizados (resina Chelex, Solventes orgánicos y QIAamp DNA stool minikit) difirieron en cantidad y pureza de ADN, tiempos de procesamiento y costos.

En conclusión, la lisis de trofozoítos de G. lamblia con el método 4 (buffer E) y la purificación de ADN con resina Chelex resultó un método simple, económico que permitió recuperar grandes cantidades de ADN con bajo índice de pureza. El QIAamp DNA stool minikit fue un método simple, más costoso que produjo bajas cantidades de ADN con un nivel de pureza apropiado para estudios moleculares.

 

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Agradecimientos: Este trabajo fue financiado por la Universidad Nacional de La Plata y la Comisión de Investigaciones Científicas de la Provincia de Buenos Aires.

Correspondencia a: Juan A. Basualdo: Cátedra de Microbiología y Parasitología. Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de La Plata. Argentina. 60 y 120 s/n, CP 1900, La Plata, Argentina., E-mail: jabasua@atlas.med.unlp.edu.ar, Tel.: +54-221-425-8987; Fax: +54-221-425-8987.

 

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