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Idesia (Arica)

versión On-line ISSN 0718-3429

Idesia vol.34 no.1 Arica feb. 2016

http://dx.doi.org/10.4067/S0718-34292016000100006 

Volumen 34, Nº 1. Páginas 47-54 IDESIA (Chile) Enero-Febrero, 2016

ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN / RESEARCH PAPERS

Suplementos orgánicos para el cultivo in vitro del híbrido Laeliocattleya (Orchidaceae)

 

Organic supplement for in vitro propagation of the hybrid Laeliocattleya (Orchidaceae)

 

Letícia de Menezes Gonçalves1, Maria de Fátima P. S. Machado2, Paulina Ballesta3, Freddy Mora4*, Maria Auxiliadora Milaneze Gutierre5, Claudete Aparecida Mangolin2

1 Departamento de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Estadual de Roraima. Boa Vista, Roraima, Brasil.
2 Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Estadual de Maringá, Paraná, Brasil.
3 Departamento de Botánica, Universidad de Concepción, Concepción, Chile.
4 Instituto de Ciencias Biológicas, Universidad de Talca. 2 Norte 685, Talca, Chile. * Autor por correspondencia: fmora@utalca.cl
5 Departamento de Biologia, Universidade Estadual de Maringá, Maringá, Paraná, Brasil.


RESUMEN

El desarrollo de técnicas de micropropagación en orquídeas ofrece múltiples ventajas como la reproducción de genotipos superiores, raros, estériles o libres de enfermedades. El objetivo del presente trabajo fue evaluar el uso de suplementos orgánicos (agua de coco y pulpa de banana) en el crecimiento y desarrollo in vitro de plántulas del híbrido intergenérico Laeliocattleya (Hadrolaelia purpurata x Cattleya intermedia), comparando su respuesta con fitorreguladores de auxinas y citoquininas. Para ello se realizaron los siguientes cuatro experimentos: 1. Suplementos orgánicos comparados con diferentes concentraciones de kinetina (N6-furfuril amino purina; KIN) y ácido naftalenacético (ANA), 2. Suplementos orgánicos comparados con diferentes concentraciones de ácido 3-indolbutírico (IBA) y N6-benzyladenine (6BA), 3. Suplementos orgánicos comparados con diferentes concentraciones de IBA y KIN, y 4. Suplementos orgánicos comparados con diferentes concentraciones de ANA y 6BA. El suplemento orgánico de agua de coco fue estadísticamente superior al resto (P<0,01), para la variable número de hojas, en todos los experimentos realizados, con 7,3 hojas por plántula cultivada in vitro. En tanto que la adición de pulpa de banana mostró los mejores resultados en el número de raíces (P<0,01), para todos los experimentos en estudio, con un valor medio de 7,4 raíces. Se concluye que la adición de pulpa de banana o de agua de coco es conveniente para la producción de orquídeas híbridas por presentar un efecto positivo en el desarrollo de las plántulas, y por su costo reducido en relación con el uso de reguladores de crecimiento.

Palabras clave: pulpa de banana, agua de coco, fitohormonas, auxina, citoquinina.


ABSTRACT

The development of micropropagation techniques in orchid has many advantages such as the reproduction of elite, rare, sterile and/or disease-free genotypes. The aim of this study was to evaluate the use of organic supplements (coconut water and banana pulp) in the in vitro development of seedlings of Laeliocattleya (Hadrolaelia purpurata x Cattleya intermedia), comparing their response to plant growth regulators: auxins and cytokinins. For this, the following four experiments were carried out: 1. Organic supplements compared to different concentrations ofkinetin (N6-furfuryl aminopurine; KIN) and naphthaleneacetic acid (NAA), 2. Organic supplements compared to different concentrations of 3-indolebutyric acid (IBA) and N6-benzyladenine (6BA), 3. Organic supplements compared to different concentrations of IBA and KIN, and 4. Organic supplements compared with different concentrations ofANA and 6BA. Coconut water was statistically superior to the others (P <0.01) for the variable number of leaves, in all experiments performed with 7.3 leaves per seedling cultivated in vitro. While banana pulp showed the best results in the number of roots (P <0.01) for all experiments, with an average value of 7.4 roots. The addition of banana pulp and/or coconut water is suitable for the production of orchid hybrids, which present a positive effect on the development of seedlings. Its low cost is also a plus in relation to the use ofplant growth regulators.

Key words: banana, coconut water, phytohormones, auxin, cytokinine.


Introducción

Orchidaceae es una de las familias más amplias de las angiospermas y taxonómicamente la más especializada de las monocotiledóneas. Comprende cerca de 700 géneros y 35.000 especies distribuidas en todo el mundo (Rego-Oliveira et al., 2005), con una gran representatividad en Brasil. Debido a su gran diversidad morfológica y larga duración de flores, el comercio ornamental de las orquídeas se ha expandido notablemente en las últimas décadas. Las exportaciones brasileñas de flores llegaron a los 25 millones de dólares en 2004, con un crecimiento anual del 25%.

La propagación de plántulas de orquídea incluye métodos asexuales y sexuales. En los primeros, el agricultor puede dividir los cormos y raíces de las plantas para generar dos o más clones, mientras que el proceso de propagación vía semillas (sexual) es bastante más complejo. Las semillas son de tamaño pequeño y de endosperma reducido, por tanto la morfología de las semillas dificulta el proceso de germinación. No obstante, las semillas de orquídeas tienen una relación simbionte con hongos micorrícicos, los que mediante digestión enzimática proporcionan a las semillas compuestos orgánicos necesarios para la germinación (Pereira et al., 2005). Además, la germinación simbiótica no es necesaria si las semillas son traspasadas a un medio estéril provisto de nutrientes y una fuente de carbono.

El desarrollo de técnicas de micropropagación de orquídeas ofrece múltiples ventajas como la reproducción de genotipos superiores, raros, estériles o libres de enfermedades. Particularmente el cultivo de semillas de orquídea in vitro ha permitido reducir los tiempos de producción de plántulas, ya que algunas especies pueden llegar a la madurez (producción de flores) en menor cantidad de años. Una gran cantidad de especies de orquídeas han sido cultivadas in vitro, mediante diferentes técnicas y varios propósitos (Roy et al., 2007; Huan et al., 2004b; Johnson et al., 2007). La mayoría ha sido propagada mediante la formación de estructuras conocidas como protocorm-like body (PLB).

La composición del medio de cultivo es uno de los factores que determinan el éxito de generar y propagar plántulas. Todo medio está básicamente compuesto de macronutrientes, micronutrientes, vitaminas, aminoácidos y una fuente de carbono. En general, el medio C desarrollado por Knudson (1946) es el medio más aceptado para el cultivo in vitro de especies de orquídeas. La inducción de una ruta morfogénica específica (organogénesis, embriogénesis, callogénesis) es regulada por la composición del medio básico de cultivo y la adición de compuestos reguladores de crecimiento. Tradicionalmente la adición de auxinas y citoquininas ha sido utilizada para regular el crecimiento y desarrollo de tejidos vegetales. No obstante, el uso de estos compuestos es costoso, por tanto se han investigado sustitutos de origen natural que puedan ser una fuente de minerales, aminoácidos, vitaminas y azúcares (Vyas et al., 2009). De acuerdo con Arditti et al. (1982), la pulpa de banana puede mejorar el crecimiento de raíces y brotes de orquídea. Sin embargo, en este mismo estudio se observó que la germinación de semillas fue inhibida por la pulpa de banana, por tanto se concluyó que este suplemento es benéfico solo en fase de plántula. Gnasekaran et al. (2010) reportaron una máxima proliferación de PLB en Phalaenopsis violacea Tijsm. & Binn en un medio suplementado con pulpa de banana. El agua de coco es otro de los suplementos escogidos para el cultivo in vitro de diferentes especies de orquídeas, debido a que contiene mioinositol, citoquininas, nucleótidos y compuestos orgánicos. Huan et al. (2004) demostraron que un medio libre de reguladores de crecimiento, y suplementado con agua de coco, promueve la formación de PLB en el género Cymbidium, no obstante los PLB formados no fueron uniformes. Lo et al. (2004) reportaron que un medio Murashige-Skoog (MS; 1962) suplementado con agua de coco promueve el crecimiento de hojas en Cymbidium. En adición, la propagación in vitro de Epidendrum radicans Lindl. en medio MS suplementado con agua de coco y reguladores de crecimiento aumenta la sobrevivencia de plántulas en condiciones ex vitro (Pateli et al., 2003). A pesar de que la adición de estos suplementos ha generado resultados favorables para el cultivo in vitro de orquídeas, su aplicación aún es cuestionada debido que no existen reportes que esclarezcan la composición química de los suplementos naturales, y los efectos fisiológicos que estos generan en los tejidos celulares.

Debido a que el mercado de micropopagación de orquídeas es altamente competitivo, existe un interés económico por obtener mayor información respecto de las condiciones de cultivo que permitan optimizar y maximizar los procesos productivos. Este trabajo tuvo como objetivo examinar los efectos del uso de suplementos orgánicos en el crecimiento y desarrollo in vitro de plántulas del híbrido intergenérico Laeliocattleya (Hadrolaelia purpurata Lindl. (Chiron; Castro) x Cattleya intermedia Grah), comparando su respuesta con fitorreguladores, auxinas y citoquininas.

Materiales y métodos

Preparación de inóculos de Laeliocattleya

Se utilizaron plántulas del híbrido intergenérico Laeliocattleya (Hadrolaeliapurpurata Lindl. (Chiron; Castro) x Cattleya intermedia Grah), obtenidas del Laboratorio de Cultivo de orquídeas del Museo Dinámico Interdisciplinar de la Universidad Estatal de Maringá, Estado de Paraná, Brasil. Las plántulas, de seis meses de edad, se obtuvieron de semillas germinadas in vitro en medio Murashige-Skoog (MS; Murashige y Skoog, 1962) reducido a la mitad de su concentración, con 0,3% de carbón activado.

Tratamientos y preparación de medios de cultivo

Las plántulas de Laeliocattleya previamente germinadas in vitro se inocularon en Medio C de Knudson (Medio KC; Knudson, 1946). Este medio KC se suplementó con pulpa de Musa acuminata var. Cavendish (banana "nanica") y agua de coco (Cocos nucifera L.) y reguladores de crecimiento en combinaciones de auxinas y citoquininas. Los siguientes cuatro experimentos corresponden a las investigaciones realizadas en este estudio:

Experimento 1: Efecto de los suplementos orgánicos (agua de coco y pulpa de banana) en la inducción de brotes, raíces y hojas de Laeliocattleya, comparado con diferentes concentraciones de kinetina (N6-furfuril aminopurina; KIN) y ácido naftalenacético (ANA).

Experimento 2: Efecto de los suplementos orgánicos (agua de coco y pulpa de banana) en la inducción de brotes, raíces y hojas de Laeliocattleya, comparado con diferentes concentraciones de ácido 3-indolbutírico (IBA) y N6-benzyladenine (6BA).

Experimento 3: Efecto de los suplementos orgánicos (agua de coco y pulpa de banana) en la inducción de brotes, raíces y hojas de Laeliocattleya, comparado con diferentes concentraciones de ácido 3-indolbutírico (IBA) y kinetina (N6-furfuril aminopurina; KIN).

Experimento 4: Efecto de los suplementos orgánicos (agua de coco y pulpa de banana) en la inducción de brotes, raíces y hojas de Laeliocattleya, comparado con diferentes concentraciones de ácido naftalenacético (ANA) y N6-benzyladenine (6BA).

Los experimentos se realizaron en 50 mL de medio KC por frasco. El número de réplicas por tratamiento fue de cuatro, con 10 plántulas por réplica. El pH de todos los medios de cultivo se ajustó a 5,3, utilizando KOH 1N y HCl 50% v/v. Posteriormente se añadió agar (6,5 g L-1) y sacarosa (20 g L-1). Los medios de cultivo se autoclavaron por 20 min a una presión de 1 atm. Al término del periodo de experimentación (ocho meses) se verificaron los valores de pH finales alcanzados en el medio de las plántulas. La pulpa de banana se licuó con 50 mL de agua destilada, y fue añadida en medio KC hasta alcanzar un volumen de 1 L, mientras que el agua de coco se utilizó al 10% v/v. Después de la transferencia de las plántulas, las réplicas se mantuvieron en una sala climatizada, con temperatura de 25 ± 2°C y luz fluorescente continua.

Recolección de datos y análisis estadístico

Después de ocho meses de establecido el ensayo se midieron las variables número de hojas (NH), número de raíces (NR) y el número de brotes (NB). Los datos se analizaron estadísticamente utilizando la metodología de Modelos Lineales Generalizados, con el procedimiento GENMOD del programa SAS (SAS Institute Inc., 2007). Se asumió una distribución de Poisson para las variables NF y NR, y Binomial Negativa para NB, debido a superdispersión e inflación de ceros. En ambas distribuciones se asumió una función de ligación logarítmica (Myers et al., 2002; Uribe et al., 2011). El test de Chi-cuadrado se utilizó para verificar las diferencias específicas entre tratamientos, con la opción CONTRAST del procedimiento GENMOD.

Resultados

Se evidenciaron diferencias estadísticas significativas entre los tratamientos (P < 0.0001) en los cuatro experimentos, de acuerdo con el análisis de varianza del procedimiento de modelación lineal generalizada (Tabla 1). El criterio de información de Akaike (AIC) confirmó la significancia del efecto debido a los tratamientos aplicados en la inducción de número de hojas, raíces y brotes de Laeliocattleya. Los valores de delta AIC (es decir, los valores de AIC del modelo sin efectos de tratamiento menos el valor de AIC para el modelo con efecto de tratamientos) fueron siempre mayores que 10, confirmando la existencia de significativas diferencias entre los tratamientos.

Tabla 1. Resultado del análisis de modelación lineal generalizada de cada experimento de propagación in vitro de Laeliocattleya. Experimento 1: suplementos orgánicos (agua de coco y pulpa de banana) y diferentes concentraciones de kinetina y ácido naftalenacético. Experimento 2: suplementos orgánicos y diferentes concentraciones de ácido 3-indolbutírico y N6-benciladenina. Experimento 3: suplementos orgánicos y diferentes concentraciones de ácido 3-indolbutírico y kinetina. Experimento 4: suplementos orgánicos y diferentes concentraciones de ácido naftalenacético y N6-benciladenina.

P: probabilidad; AIC: Criterio de información de Akaike; χ2: test de Chi-cuadrado. Delta AIC: AIC modelo reducido (sin efectos de tratamiento) menos el valor de AIC para el modelo con efecto de tratamientos.

Las Tablas 2, 3, 4 y 5 muestran las diferencias puntuales entre los valores medios de cada tratamiento para cada experimento. El suplemento orgánico de agua de coco fue estadísticamente superior al resto, para la variable número de hojas de Laeliocattleya en todos los experimentos realizados, con 7,3 hojas por plántula cultivada in vitro. Este mismo suplemento evidenció las peores respuestas para el número de raíces por plántula. En tanto que el suplemento orgánico compuesto de pulpa de banana mostró los mejores resultados en el número de raíces, para todos los experimentos en estudio. Los niveles de brotes fueron siempre inferiores que 1, en promedio, en todos los experimentos, por lo que se descartaría como una variable relevante a considerar en esta etapa de multiplicación in vitro de Laeliocattleya.

Tabla 2. Diferencias entre tratamientos del experimento 1: suplementos orgánicos (agua de coco y pulpa de banana) y diferentes concentraciones de kinetina y ácido naftalenacético, expresadas en mg L-1.

NH: número de hojas; NR: número de raíces; NB: número de brotes; ANA: ácido naftalenacético; KIN: kinetina; COCO: agua de coco; BANANA: pulpa de banana.

Tabla 3. Diferencias entre tratamientos del experimento 2: suplementos orgánicos (agua de coco y pulpa de banana) y diferentes concentraciones de ácido ácido 3-indolbutírico y N6-benciladenina, expresadas en mg L-1.

NH: número de hojas; NR: número de raíces; NB: número de brotes; COCO: agua de coco; BANANA: pulpa de banana; 6BA: N6-benciladenina; IBA: ácido 3-indolbutírico.

Tabla 4. Diferencias entre tratamientos del experimento 3: suplementos orgánicos y diferentes concentraciones de ácido 3-indolbutírico y kinetina, expresadas en mg L-1.

NH: número de hojas; NR: número de raíces; NB: número de brotes; COCO: agua de coco; BANANA: pulpa de banana; IBA: ácido 3-indolbutírico; KIN: Kinetina.

Tabla 5. Diferencias entre tratamientos del experimento 4: suplementos orgánicos (agua de coco y pulpa de banana) y diferentes concentraciones de ácido naftalenacético (ANA) y N6-benciladenina (6BA), expresadas en mg L-1.

NH: número de hojas; NR: número de raíces; NB: número de brotes; COCO: agua de coco; BANANA: pulpa de banana; ANA: ácido naftalenacético; 6BA: N6-benciladenina.

Discusión

Los métodos de propagación convencionales de orquídeas (e.g. vía pseudobulbos) han demostrado ser lentos y poco confiables. Por este motivo, la producción de plantas in vitro ha aumentado en los últimos años, ya que representa una metodología apropiada para el cultivo de especies de orquídea. La adición de diferentes combinaciones de reguladores del crecimiento (ANA, IBA, 6BA y KIN), pulpa de banana y agua de coco a un medio KC, tuvo un efecto positivo en plántulas de Laeliocattleya luego de un mes de cultivo. Por ejemplo, plántulas cultivadas en medio KC sin combinaciones de reguladores o suplementos orgánicos, no desarrollaron brotes (NB).

Las respuestas morfogénicas (NH, NR y NB) variaron según el tipo de tratamiento. El número de hojas (NH) fue superior en plántulas cultivadas en un medio KC suplementado con agua de coco. Lo et al. (2004) observaron que un medio MS suplementado con agua de coco estimuló la formación de hojas en plántulas de Laeliocattleya y en otras especies de orquídeas. De acuerdo con Arditti et al. (1982), el agua de coco contiene ribósidos de zeatina, los que poseen un efecto similar a una citoquinina. Además, el número de raíces (NR) fue más bajo en plántulas que contenían agua de coco en su medio de cultivo. La presencia de citoquininas en el agua de coco podría inhibir la formación de raíces y estimular el crecimiento de partes aéreas y la proliferación de brotes (Trigiano y Gray, 2005). No obstante, los resultados del presente estudio demostraron que el número de hojas (NH) y brotes (NB) no fueron positivamente relacionados en los tratamientos probados. Los valores de NB obtenidos en medios suplementados con agua de coco son estadísticamente comparables a medios KC con combinaciones de ANA-KIN (1,01,0 mg L-1; 0,5-0,0 mg L-1; ANA-KIN 0,0-1,0 mg L-1) e IBA-6BA (0,5-0,5 mg L-1; 1,0-1,5 mg L-1); sin embargo, combinaciones de reguladores ANA-6BA e IBA-KIN tuvieron resultados superiores a los obtenidos con agua de coco. El efecto citoquininas en la formación de brotes ha sido descrito por Trigiano y Gray (2005). Por lo demás, una alta concentración de la citoquinina BAP (1,5 mg L-1) generó un mayor número de brotes en Dendrobium nobile Lindl., mientras que altas dosis de KIN generaron un mayor largo de los brotes (Asghar et al., 2013). En adición, Duan et al. (1996) verificaron que la utilización de BA en la propagación de Phalaenopsis spp. generó un aumento en el número de yemas por brotes, mientras que en Cymbidium aloifolium (L.), BA indujo la diferenciación de un mayor número de brotes (Nayak et al., 1998).

De acuerdo con los resultados, el agua de coco fue un notorio inductor del desarrollo de partes aéreas de las plántulas de Laeliocattleya. Sin embargo, plántulas cultivadas en medios suplementados con agua de coco reportaron los valores más bajos de número de raíces (NR), e incluso fueron estadísticamente inferiores a plántulas cultivadas en medios sin combinaciones de reguladores o suplementos orgánicos. Trigiano y Gray (2005) sostienen que las citoquininas poseen un efecto negativo en la formación de raíces in vitro. Reski (2006) encontró que, en medios con altas concentraciones de KIN, las células son incitadas a traspasar de la fase G1 a S, de modo que varias proteínas en G1 dejan de ser sintetizadas. Varias de estas proteínas están relacionadas con la diferenciación y especialización celular, por tanto la inhibición de su síntesis genera que las células no lleguen a estados de especialización como la formación de primordios radicales. En células meristemáticas de Datura innoxia Mill. y Daucus carota L., la fase G1 ocurre en un menor tiempo en medios suplementados con KIN, en cuanto a las fases S, G2 y M son inalteradas. Complementariamente se ha descrito que micro-RNA de interferencia pueden generar interferencia en la síntesis de las proteínas en G1 (Thore et al., 2006).

En el presente estudio el número de raíces fue superior en plántulas cultivadas en medio KC suplementado con pulpa de banana. Vyas et al. (2009) verificaron que la pulpa de banana (12,5%) en el cultivo de brotes de Dendrobium lituiflorum Lindl. induce a la multiplicación y alargamiento de raíces. Además se determinó que en Paphiopedilum spp. la pulpa de banana indujo el desarrollo de yemas caulinares, pero no raíces (Huang et al., 2001) . Esto prueba que depende de la especie es el efecto que tiene la pulpa de banana. La pulpa de banana además es recomendada en fase de plántulas para el desarrollo radicular (Shiau et al., 2002) , y no para germinación de semillas (Arditti et al., 1982). En adición, Stancato et al. (2008) determinaron en tres especies de orquídeas que la pulpa de banana estimuló el desarrollo de plántulas con mayor desarrollo y materia seca total. Los resultados del estudio indicaron que un medio KC suplementado con pulpa de banana generó mayor cantidad de raíces en contraste con cualquiera de los otros tratamientos a excepción de la combinación IBA-KIN, el que tuvo un efecto estadísticamente igual. En otras especies de orquídea como Satyrium nepalense D. Don., se ha determinado que IBA puede ser utilizado en forma independiente en un medio de cultivo y generar un alto porcentaje de enraizamiento (Mahendran y Narmatha-Bai, 2009). Se ha demostrado además que la aplicación ex vivo de la auxina IBA genera buenos resultados para enraizamiento de plantas, ya que incrementa el contenido endógeno de auxinas, y es bastante estable contra el catabolismo e inactivación por conjugación.

Las auxinas estimulan la formación de raíces, y también puede inhibir su crecimiento durante el cultivo si las concentraciones son muy altas. Esto se debe a que las auxinas estimulan la síntesis de etileno, el que inhibe el crecimiento vegetal (Triago y Gray, 2005). Los resultados indicaron que las plántulas de Laeliocattleya mantenidas en medio KC conteniendo altas concentraciones de IBA (sobre 0,5 mg L-1), en ausencia de citoquininas, se inhibe la formación de raíces y favorece el crecimiento de estructuras aéreas. Las auxinas NAA e IBA fueron igual de eficientes para promover el crecimiento de raíces usando las tres concentraciones usadas. Sin embargo IBA parece más efectiva que NAA para inducir formación de raíces, mientras que NAA fue más eficiente para inducir producción de partes aéreas. Por el contrario, en Cymbidium aloifolium altas concentraciones de NAA (5 mg L-1) han sido efectivas para inducir formación de raíces (Nayak et al., 1998), por tanto todo tratamiento debe ser optimizado de acuerdo con la especie. En relación con los efectos de las citoquininas, en los medios suplementados con KIN se desarrolló un mayor número de raíces (y hojas) que en medios suplementados con 6BA, no obstante estos valores no fueron estadísticamente superiores a los obtenidos en los medios control (ausencia de reguladores).

Conclusión

De los resultados obtenidos se desprende que la adición de pulpa de banana a un medio de cultivo KC in vitro puede reproducir los efectos de auxinas (IBA o ANA), e incluso obtener mejores respuestas en el desarrollo radicular de plántulas del híbrido Laeliocattleya, mientras que la adición de agua de coco a un medio de cultivo KC puede simular los efectos de citoquininas (6BA o KIN) en el desarrollo de brotes y hojas. El tratamiento de agua de coco fue superior a cualquier combinación de reguladores de crecimiento y suplementos, para la producción de hojas en plántulas Laeliocattleya en medio KC. A pesar de que el uso de reguladores es una técnica mayormente reproducible y exacta, desde un punto de vista comercial es más conveniente para los productores de orquídeas utilizar pulpa de banana y agua de coco debido al bajo costo en contraste a los reguladores auxinas y citoquininas.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a CAPES-Brasil (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) por su apoyo financiero.

Literatura Citada

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Fecha de Recepción: 26 Mayo, 2015. Fecha de Aceptación: 1 Diciembre, 2015.

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