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Introducción
El ataque de insectos a granos y alimentos como harinas, galletas y pastas, es una de las principales causas de pérdida de estos productos cuando se encuentran en almacenamiento. El daño producido por estas plagas está asociado a la reducción del peso, deterioro del poder y energía germinativa de las semillas, disminución del valor comercial, contaminación por los residuos corporales y de su metabolismo, y la aparición de hongos (Alonso et al., 2009).
En el control de los insectos plaga en la agroindustria, los insecticidas ha sido los más utilizados debido a su rápida acción en reducir las poblaciones; sin embargo, los productos químicos dejan residuos tóxicos que afectan la salud de consumidores, así como también promueven la aparición de resistencia genética, cuando su uso es indiscriminado (Devine et al., 2005). Es por ello que diversas investigaciones han evaluado alternativas ecológicas de control como el uso de metabolitos secundarios (MS) contenidos en extractos vegetales (EV) (Olivero et al., 2009; Lima et al., 2013; Pino et al., 2013; Priya et al., 2016).
Los metabolitos secundarios son compuestos sintetizados por las especies vegetales durante su desarrollo, sin embargo las plantas expuestas a condiciones adversas como el ataque de herbívoros y de microorganismos como virus, bacterias, hongos; competencia por espacio, luz y nutrientes u otro tipo de estrés biótico o abiótico (salinidad, temperatura, entre otros), tienden a aumentar la concentración de los MS (Sepúlveda et al., 2004; Celis et al., 2008).
Entre los principales grupos de MS se encuentran los terpenos, compuestos fenólicos, glicósidos y alcaloides (Avalos y Pérez 2009), los cuales pueden estar contenidos en aceites esenciales (AE), extractos acuosos (EA), extractos etanólicos (EE) o polvos vegetales (PV). Estos extractos pueden tener efecto insectistático o repelente ya que son capaces de inhibir el desarrollo de los insectos al afectar su alimentación (atracción o fagodepresión), el sistema nervioso (desorientación), el comportamiento reproductivo (inhibición de la oviposición) y/o produciendo mortalidad cuando resultan altamente tóxicos (Sepúlveda et al., 2003; Celis et al., 2008; Pino et al., 2013).
El orégano silvestre (Lippia origanoides K.) y la citronela (Cymbopogon citratus D.C) son especies vegetales utilizadas como potenciadores de sabor y con fines medicinales, que han sido estudiadas por el efecto que producen en insectos plaga como T. castaneum y Sitophilus zeamais (Mots.) (Olivero et al., 2009; Lima et al., 2013). Entre los metabolitos registrados para L. origanoides se encuentran los terpenos, alcaloides, cetona monoterpenica, flavonoides y fenilpropanoides (Castañeda et al., 2007), mientras que para C. citratus se han señalado los terpenos, alcaloides y compuestos fenólicos (Avoseh et al., 2015).
La especie Rhyzopertha dominica F., conocida como barrenador de los granos, se encuentra distribuida alrededor del mundo y es considerada la principal plaga del trigo, el maíz y el arroz almacenado (Alonso et al., 2009). Este insecto ha desarrollado resistencia a insecticidas (Schlipalius et al., 2002; Rajendran y Gunasekaran, 2002), por lo cual diversas investigaciones han evaluado los EV como alternativas para su control (Reyes et al., 2012; Khaliq et al., 2014; Priya et al., 2016). En este sentido, la presente investigación se condujo con la finalidad de evaluar la efectividad de los EV foliares de orégano silvestre y citronela sobre R. dominica, una de las especies más perjudiciales en granos y productos almacenados.
Materiales y Métodos
Colecta y cría de R. dominica
Los adultos del barrenador fueron obtenidos de granos de maíz infestado proveniente de crías del Laboratorio de Biología y Fisiología Poscosecha del programa de Ingeniería Agroindustrial de la Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado, Lara, Venezuela. Se seleccionaron grupos de 50 adultos de R. dominica no sexados y de edades mezcladas, los cuales se colocaron sobre 250 gramos de maíz amarillo en envases de 500 ml de capacidad, tapados con un trozo de tela de organdí sujetada con una banda de goma para permitir la ventilación. Este procedimiento se repitió hasta completar 3 kg de maíz infestado, con la finalidad de garantizar un suministro permanente de adultos.
Los insectos se mantuvieron en los frascos por 3 semanas para permitir su reproducción y oviposición. Posteriormente, los adultos parentales fueron removidos de los envases para esperar la emergencia de los individuos que conformaron la primera generación (F1), los cuales fueron aislados con 2 o 3 semanas de edad y usados en las pruebas biológicas.
Obtención de los extractos etanólicos de Lippia origanoides y Cymbopogon citratus.
Se colectaron hojas frescas y aparentemente sanas de orégano silvestre y citronela, de plantas ubicadas en el campo experimental del Posgrado de Agronomía de la UCLA; las mismas fueron secadas bajo sombra, se molieron en una licuadora convencional Oster® y se maceraron en frascos de vidrio con etanol (96%) durante 24 horas. Posteriormente, el solvente fue separado por destilación, utilizando un rotavapor Brinkmann y el extracto crudo fue envasado en frascos estériles ámbar y almacenados bajo refrigeración a 8 ± 2 °C, hasta su utilización en los análisis fitoquímicos y aplicación en los experimentos.
Determinación de metabolitos secundarios en los extractos etanólicos de Lippia origanoides y Cymbopogon citratus
Determinación cualitativa
La determinación de alcaloides, fenoles y flavonoides en los EE foliares de orégano silvestre y citronela, se realizó por cromatografía de capa fina utilizando la metodología de Marcano y Hasegawa (2002). Para ello, se usaron dos cromatofolios de sílica gel (Merk® 6,5 cm de largo x 2,5 cm de ancho) y en cada uno de ellos se colocaron dos gotas (20 uL) del EE correspondiente a 1 cm de uno de sus extremos, utilizando una micropipeta. Seguidamente, los cromatofolios se colocaron en cámaras cromatográficas que contenían el eluyente específico para cada grupo de MS a separar: n-butanol + ácido acético + agua (9:2:1), agua + ácido acético (9:1) y benceno + ácido acético + agua (12:7:2). Para el revelado de las cromatografías se consideró el color naranja intenso como indicativo de alcaloides, mientras que la presencia de fenoles fue mostrada por una coloración parda oscura cuando se rocía cloruro férrico al 1%, y para flavonoides el color blanco fluorescente, respectivamente.
Los aceites esenciales se determinaron por el olor característico que confieren estos MS a cada EE evaluado, mientras que las saponinas se determinaron mezclando 1 ml de cada extracto con 1 ml de agua destilada, seguidamente se tomó 1 ml de la mezcla y se colocó en un tubo de ensayo para agitar vigorosamente hasta la formación de espuma. La persistencia de ésta, luego de 15 min, fue considerada como positiva para saponinas y su contenido fue valorado de acuerdo a los rangos señalados por Cuellar et al., (1999): 0 mm (negativo); 0,1 - 5 mm (muy bajo); 5,1 - 9 (bajo); 9,1 - 14 (moderado) y mayor de 14 mm (alto).
Determinación cuantitativa
Las corridas de cromatografía hechas para la determinación cualitativa fueron usadas para la cuantificación de los grupos de MS utilizando la metodología descrita por Vásquez et al. (2008). Para ello, se marcó el área ocupada por el MS en el cromatofolio de silica gel y con ayuda de un perforador se extrajeron tres secciones: el área conocida (AC) (MS + sílica + solvente), el área desconocida (AD) (espacio restante del área recorrida por el metabolito: MS + sílica + solvente, la cual se raspo y peso), y el área testigo (ACt) (cromatofolio testigos con sílica + solvente los cuales se perforaron y rasparon). Cada una de las muestras se pesó en una balanza analítica Ohaus AdventureTM N° AR2140, y los datos fueron introducidos en la siguiente ecuación:
Donde MS representa a alcaloides, fenoles o flavonoides, respectivamente, y 20 |ol el volumen del extracto que se agregó a cada cromatofolio.
Efecto de los extractos etanólicos de Lippia origanoides y Cymbopogon citratus sobre Rhyzopertha dominica
Se seleccionaron granos de maíz enteros, aparentemente sanos, sin grietas y limpios, se pesaron en una balanza electrónica KERNMR, Modelo EMB220-1, para conformar muestras de 20 g. Seguidamente, cada una se colocó en una bandeja plástica y se asperjaron con 1 ml del tratamiento correspondiente (EE de orégano o citronela a concentraciones de 40, 60, 80, 85 y 95%) y un testigo, para el cual solo se agregó agua, y se esperó por un periodo de 5 min para permitir la impregnación de los granos con el extracto.
Una vez impregnados, se colocaron en envases de plástico de 120 g de capacidad y se introdujeron 20 adultos de R. dominica, no sexados y con edades comprendidas entre 2 a 3 semanas. Cada envase se selló con una tapa que tenía un orificio (2 cm de diámetro) cubierto con un trozo de tela organdí para permitir la ventilación, y se observaron cada 24 horas hasta completar 96 horas. En cada observación, los envases fueron destapados para contar la cantidad de insectos vivos (con movilidad) o muertos (detención completa de movimiento y/o comportamiento y movimiento descoordinados). Los adultos de R. dominica vivos, fueron retornados al envase con granos de maíz tratado, mientras que los considerados como muertos se aislaron en nuevos envases con granos de maíz no tratado y se mantuvieron en observación por 24 horas, para comprobar la muerte de los mismos. Cuando éstos permanecían vivos, fueron regresados al envase con el tratamiento correspondiente.
Cada tratamiento fue replicado 5 veces y cada repetición estuvo conformada por dos unidades experimentales. Se siguió un diseño completamente al azar con arreglo factorial 2x5, donde el primer factor correspondió a los EE y el segundo a las cinco concentraciones evaluadas. El efecto insecticida de los extractos etanólicos sobre adultos de R. dominica, se consideró como una relación directa con el porcentaje de insectos muertos.
El porcentaje de mortalidad fue corregido de acuerdo a la fórmula de Abbott (1925), la cual describe:
Donde Pc representó el porcentaje de mortalidad corregido, Pexp el porcentaje de mortalidad experimental, y Pcont el porcentaje de mortalidad control.
Análisis de datos
Los datos de porcentaje de mortalidad fueron sometidos a análisis de varianza y posteriormente a pruebas de medias según Tukey utilizando el paquete estadístico Statistix versión 10.0. Los porcentajes de mortalidad fueron transformados a arcoseno ya que estos presentaron una distribución binomial.
Resultados y Discusión
Determinación y cuantificación de los grupos de metabolitos secundarios en los extractos etanólicos de orégano silvestre (Lippia origanoides) y citronela (Cymbopogon citratus)
Se evidenció la presencia de alcaloides, fenoles, flavonoides, aceites esenciales y saponinas en los EE de orégano y citronela, y se determinó que estos grupos de MS se encontraban menos concentrados en el primero que en el segundo (Tabla 1). Estos resultados coincidieron con los señalados por Alvarado et al. (2011), Sivira et al. (2011) y Fernández et al. (2016) quienes detectaron la presencia de estos MS en las mismas especies vegetales. Sin embargo, contrario a estos resultados, Bolívar et al. (2009) no reportaron la presencia de saponinas en el EE de orégano silvestre.
Tabla 1 Metabolitos secundarios encontrados en los extractos etanólicos de Lippia origanoides y Cymbopogon citratus
La presencia de estos grupos de MS en los extractos evaluados, permite asociarlos con los mecanismos de defensa contra insectos, ya que los alcaloides tienen la capacidad de bloquear neuroreceptores intermediarios y canales iónicos (Sepúlveda et al., 2003) y los fenoles intervienen en el desarrollo y obstrucción de las vías respiratorias del insecto (Sepúlveda et al., 2003; Celis et al., 2008). Por su parte, los flavonoides inhiben el transporte de electrones en las mitocondrias generando una reducción del consumo de oxígeno que provoca convulsiones y muerte (Celis et al., 2008), mientras que las saponinas tienen efecto disuasorio de alimentación, retraso en el desarrollo y disminución de la reproducción en los insectos (De Geyter et al., 2007).
Diversas investigaciones han indicado que los MS presentes en L. origanoides y C. citratus pueden actuar como barreras protectoras contra insectos al obstruir sus vías respiratorias por olores tóxicos en sus aceites esenciales, así como también pueden tener efecto disuasorio de la alimentación y/o causar la muerte (Antolinez et al., 2008; Acevedo et al., 2013).
Efecto de los extractos etanólicos de Lippia origanoides y Cymbopogon citratus sobre la mortalidad de adultos de R. dominica
Las concentraciones de los EE de orégano y citronela (40, 60, 80, 85 y 95%) produjeron un efecto significativo sobre la mortalidad en adultos de R. dominica mostrando diferencias entre ellas (P < 0,01) (Tabla 2). La Figura 1 muestra que la mortalidad del barrenador incrementó a medida que aumentó la dosis, no obstante el porcentaje de mortalidad producido al 95%, ligeramente superó el 50% de la población estudiada. El efecto de los EE al 80 y 85% no fue significativamente diferente (P < 0,01) con valores de mortalidad de 45 y 44%, respectivamente. Los porcentajes más bajos de mortalidad se ubicaron en 25,75 y 10,5% a las dosis de 60 y 40%, respectivamente.
Tabla 2 ANOVA del efecto de las concentraciones de los extractos etanólicos de Lippia origanoides y Cymbopogon citratus sobre el porcentaje de mortalidad de adultos de R. dominica
* Significativo a P < 0,05; ** Significativo a P < 0,01. ns: no significativo.
C.V. 24.45
Figura 1 Mortalidad (%) promedio de adultos de R. dominica ante el efecto de las concentra ciones de los extractos etanólicos de Lippia origanoides y Cymbopogon citratus (Promedios con la misma letra no difieren estadísticamente, Tukey P < 0,01)
En el ANOVA (Tabla 2) también se indican diferencias significativas (P < 0,05) en la interacción entre los factores concentración por extracto, para la variable porcentaje de mortalidad de R. dominica, la cual se afectó en forma directa con el incremento de las concentraciones de los EE de orégano y citronela (Figura 2). El mayor porcentaje de mortalidad del barrenador (65%) fue producido por el EE de citronela al 95%, el cual fue significativamente diferente del producido por el orégano (48,5%) a la misma dosis. El efecto de ambos EE al 80 y 85% fue también significativamente diferente (P < 0,01) entre ambos extractos, y siempre mayor en citronela que en orégano.
Figura 2 Mortalidad (%) promedio de adultos de R. dominica ante el efecto de los extractos etanólicos de orégano y citronela, evaluados a cinco concentraciones. (Promedios con la misma letra no difieren estadísticamente, Tukey P < 0,01)
A la dosis de 60%, la mortalidad presentó diferencias estadísticas, siendo mayor para el orégano (35,5%) que para citronela (16%). Las concentraciones de 60, 80 y 85% del EE de orégano no registraron diferencias significativas en el porcentaje de mortalidad, mientras que la dosis de 40% de ambos extractos mostró la mortalidad más baja de las dosis evaluadas.
Resultados similares fueron obtenidos por Gandhi y Pillai (2011) cuando aplicaron hojas pulverizadas de granada (Púnica granatum (L.)) y curry (Murraya koenigii L.) sobre granos de trigo (79% - 65%) y arroz (79%) ofrecido a R. dominica, respectivamente, argumentando que las diferencias se debieron a la protección que brindó el grano de trigo al insecto. De igual forma, Khaliq et al. (2014) señalaron que la mortalidad del barrenador incrementó de 40,19 hasta 50,36% en la medida que la dosis del extracto de acetona de berberia (Nerium oleander L.) aumentó de 5 a 15%, mientras que Priya et al. (2016) obtuvieron porcentajes de mortalidad de 53 y 58% utilizando extractos de frutos de Zanthoxyulum rhetsa Roxb.
El efecto insecticida producido por los EE de orégano y citronela sobre adultos de R. dominica, están asociados con la toxicidad ocasionada por los MS de ambos extractos, los cuales pudieron inducir inanición y/o asfixia del insecto. Adicionalmente, se deduce que la mayor cantidad de alcaloides, fenoles, flavonoides y saponinas del EE de citronela, pudo contribuir a que este extracto mostrara mayor efectividad en producir mortalidad. Al respecto, Ileke y Bulus (2012) mencionaron que los extractos pueden producir muerte por toxicidad de contacto o inducir asfixia por olores tóxicos y obstrucción de espiráculos, así como también pueden inhibir la locomoción, y en consecuencia reducir la capacidad para buscar alimento.
