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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.126 n.7 Santiago jul. 1998

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98871998000700013 

ARTÍCULOS DE REVISIÓN

La terapia génica y sus aplicaciones

Enrique Daniel Austin-Ward, Cecilia Villaseca G.

 Gene therapy and its applications

 
Gene therapy consists in the introduction of genes in cells of the human organism. It allows the treatment of not only monogenic diseases (those in which one gene is altered, such as rare enzymatic diseases), but also of diseases in which there is an acquired gene alteration such as AIDS and cancer, and diseases in which several genes and the environment interact, such as diabetes and coronary artery disease. In the few years of development of this therapy several clinical trials have been approved, that, along with experimental research, are offering promising results. In this new field of modern medicine, specially in experiments related to genetic manipulation of germinal cells, ethical aspects have great importance.
(Key-words: Gene therapy; Genetics, medical; Germ cells)
 
 

La terapéutica ha procurado incidir en la historia natural de las enfermedades desde un punto de vista sintomático, fisiopatológico y etiológico, siendo probablemente esta última aproximación la más efectiva y la más deseada. En una gran cantidad de enfermedades que poseen un factor genético involucrado, la etiología está en la presencia de uno o varios genes dañados o mal funcionantes1. Los genes están hechos de ADN y se encuentran en el núcleo de la célula a un nivel de resolución molecular. Éstos controlan el medio interno de la célula, las interacciones con otras células y con el medio ambiente en general por medio de proteínas que son transcritas en respuesta a estímulos. Mínimas alteraciones en su estructura, a veces tan pequeñas como una mutación o cambio en uno sólo de los nucleótidos (moléculas que forman el ADN) que los constituyen, pueden producir graves daños metabólicos o estructurales. Un tipo de terapia que tratara de corregir estos problemas tendría que identificar cuál es el gen afectado causante de la patología y realizar algún tipo de microcirugía molecular para corregir el defecto, no sólo en una, sino que en los millones de células que constituyen un individuo, o a lo sumo en el órgano o sistema en que se expresa este gen. Todas estas consideraciones hacían prácticamente imposible hasta hace poco un abordaje de estas patologías a ese nivel.
Con el advenimiento del proyecto Genoma Humano, se espera secuenciar los 50.000 a 100.000 genes que se ha estimado que existen2. Hasta ahora sólo se han secuenciado aproximadamente un 20% de los mismos. Sin embargo, los que ya se tienen se encuentran disponibles en bibliotecas de genes fabricadas a partir de técnicas de la ingeniería genética y se pueden obtener inclusive por medio de catálogos comerciales. Estas mismas técnicas de ingeniería genética, que incluyen entre sus herramientas a las enzimas de restricción (enzimas que pueden cortar el ADN a modo de microtijeras), están siendo utilizadas para realizar la reparación de defectos genéticos por medio de la sustitución de los genes dañados o ausentes por genes normales. La terapia génica (TG) es el conjunto de procedimientos que permiten la introducción de genes sanos o normales dentro de las células de un organismo, mediante las llamadas Tecnologías de Transferencia de Genes3.
Esta aproximación es completamente revolucionaria en la terapéutica, ya que hasta hace relativamente poco tiempo el material genético de los seres humanos era inaccesible a algún tipo de corrección o tratamiento.
Compañías farmacéuticas y centros de investigación de Europa, Estados Unidos y Japón ya han apostado a esta nueva posibilidad. De hecho, a principios de los 90 se incluía a grandes compañías como Sandoz, Ciba Geigy y Rhone Poulenc Rorer. En 1992, el mercado correspondiente fue estimado en 1,2 billones de dólares. Estimaciones más recientes4 alcanzan los 45 billones de dólares para el año 20154.

Tipos de terapia génica
Existen, en teoría, dos tipos de TG: la Terapia Génica de Células Somáticas y la Terapia Génica de Células Germinales5, aunque sólo la primera está siendo desarrollada actualmente.
La TG somática busca introducir los genes a las células somáticas (esto es, todas las células del organismo que no son gametos o sus precursores), y así eliminar las consecuencias clínicas de una enfermedad genética heredada o adquirida. Las generaciones futuras no son afectadas porque el gen insertado no pasa a ellas.
La TG germinal sólo existe como posibilidad, pues no se cuenta con la tecnología necesaria para llevarla a cabo. Además ha sido proscrita por la comunidad científica y por organismos internacionales por sus implicaciones éticas, las cuales discutiremos más adelante. La TG germinal trataría las células del embrión temprano, los óvulos, los espermatozoides o sus precursores. Cualquier gen introducido en estas células estaría presente no sólo en el individuo, sino que sería transmitido a su descendencia.
 
Aspectos que debe procurar la Tecnología de Transferencia de Genes (TTG)
¿Cómo hacer que el gen deseado llegue hasta el núcleo de las células de un organismo vivo y se exprese en el momento y lugar precisos? Ésta es la pregunta clave de la TG, y toda la futura perfección que pueda alcanzar depende casi por completo de la resolución de este problema. La TTG debe:
1.- Suministrar una transferencia génica eficiente y precisa.
2.- Garantizar una expresión génica persistente y bien regulada.
3.- Procurar una adecuada localización subcelular y un procesamiento adecuado del producto génico (proteína)6.
Como hemos dicho, un gen es un fragmento de ADN. Los genes normales que se utilizan para reemplazar los genes defectuosos se pueden obtener a partir de bibliotecas de genes en las cuales se encuentran almacenados, como ya hemos dicho. Estos genes pueden ser llevados a la célula por medio de los llamados vehículos o "vectores", denominados así por su similitud con los agentes biológicos que transmiten enfermedades. El término vector anteriormente se utilizaba sólo para designar a los plasmidios o a los virus modificados que se utilizaban como vehículos que transportaban el gen deseado a una célula. El mismo ha pasado a ser un término genérico que involucra los diversos medios, ya sean biológicos, químicos o físicos, por medio de los cuales se puede hacer llegar el gen a la célula, y así se emplea en diversos textos y publicaciones7, 8, aunque algunos prefieren reservar el término vector para los vehículos biológicos propiamente dichos. Es por eso que hablamos de métodos de transferencia o vectores virales y no virales, los cuales pueden cumplir su cometido tanto en células extraídas del paciente que se va a tratar, modificadas in vitro y luego reimplantadas (técnicas ex vivo), o directamente en el paciente (técnicas in vivo).
Los vectores virales9 se basan en el principio de que los virus son fragmentos de ADN o ARN encapsulados que ingresan a las células y dirigen la maquinaria celular para sus propósitos de reproducción. Estos virus están formados por varios genes y pueden ser modificados por ingeniería genética, extrayéndoseles aquellos que les confieren sus características dañinas e intercambiándose por el o los genes deseados, sin que pierdan la capacidad de encapsularse, pero sí la de autorreproducirse en el individuo. Se cultivan y se purifican en medios celulares especiales hasta que se verifica su inocuidad10. En el fondo, los vectores virales son virus modificados con los cuales literalmente se infecta al individuo. Estos virus irán a una gran cantidad de células del organismo, depositando su material genético en el núcleo, el cual posteriormente se expresará como proteínas. Los principales vectores virales son los retrovirus y los adenovirus. Fueron los primeros en ser utilizados porque se conocía bastante bien su constitución y su comportamiento. Sin embargo, cada tipo de virus podría constituirse, con las modificaciones pertinentes, en un vector viral, y hay muchos otros que están siendo utilizados en los protocolos de experimentación11.
Los métodos de transferencia no virales fueron desarrollados como alternativa12, 13, debido a ciertos inconvenientes que presentan los vectores virales (ver adelante). Entre los principales encontramos los liposomas y el DNA desnudo, entre otros. Los liposomas son microesferas compuestas por una membrana lipídica que rodea un medio acuoso interno. Hay dos tipos: los liposomas catiónicos, que están cargados positivamente y que interactúan con el ADN (de carga negativa) para formar un complejo estable. Este complejo puede entrar a las células luego de su administración endovenosa. Entre los más usados está la lipofectina. Por otro lado, los liposomas con carga negativa no forman complejos con el ADN, sino que lo atrapan, formando una cápsula alrededor. Entre sus ventajas está que pueden llevar grandes fragmentos de ADN, potencialmente tan largos como el tamaño de un cromosoma, a diferencia de los vectores virales, que sólo pueden llevar un ADN de longitud más bien pequeña.
El ADN desnudo consiste en inyectar directamente plásmidos de ADN, es decir, constructos de ADN confeccionados por ingeniería genética, los cuales se ha visto presentan cierto grado de expresión en los diversos tejidos luego de su administración.
 
Aplicaciones de la terapia génica
La TG involucra la manipulación genética del organismo humano, y por lo tanto podría ser utilizada, en principio, en cualquier enfermedad que haya surgido por la modificación de un factor genético, ya sea de tipo heredado, como las enfermedades monogénicas con patrón de herencia mendeliano (vg deficiencia en adenosín deaminasa [ADA], hipercolesterolemia familiar, fibrosis quística, hemofilia A), como las enfermedades con herencia multifactorial (en las que hay una influencia de los genes y el ambiente, como en la hipertensión, la diabetes y la enfermedad coronaria) o de tipo adquirido (cáncer, SIDA, artritis). También podría utilizarse en el mejoramiento de los procesos de curación y regeneración tisular, y en el tratamiento de enfermedades neurológicas degenerativas como la enfermedad de Parkinson y de Alzheimer14.
Aunque esta lista a primera vista parece excesiva, lo cual podría hacer parecer a la terapia génica como sospechosa panacea, en cada uno de los grupos que hemos mencionado hay numerosos experimentos en animales (fase preclínica) y estudios clínicos que arrojan resultados prometedores, anunciando así una verdadera era de la terapéutica. La mayoría de los protocolos clínicos son de fase I. Éstos consisten en determinar cuál es la máxima dosis de un nuevo medicamento tolerada por los pacientes15.
El primer protocolo clínico aprobado por la FDA para el uso de la TG fue el utilizado en el tratamiento de la deficiencia en adenosín deaminasa (ADA)16, la que provoca un trastorno de la inmunidad, en 1990. En estos pacientes no se ha podido retirar el tratamiento enzimático exógeno necesario para su supervivencia, sino sólo disminuirlo a la mitad17, y se ha detectado la persistencia en la expresión del gen aún después de cuatro años de iniciado el protocolo18. Aunque no se haya logrado la completa curación  de los pacientes  (que consistiría en retirar todo el aporte enzimático exógeno) este constituye un  hecho inédito en la historia terapéutica.
Con respecto a la terapia génica de otras enfermedades monogénicas tenemos que en protocolos de tratamiento para la fibrosis quística, utilizando adenovirus administrados al tracto respiratorio en forma de aerosol, ha habido también mejoría parcial de los pacientes, presentándose la respuesta inmune del huésped y una baja eficiencia de los vectores como el principal impedimento en estos tipos de terapia19.
En casos de hemofilia B ha habido corrección completa en perros durante 5 meses20, y de la hemofilia A también en animales de experimentación durante 2 semanas, tiempo que dura la expresión de los genes transducidos que posteriormente se apagan21.
Un paciente de 29 años con hipercolesterolemia familiar, sin receptores funcionantes para lipoproteínas de baja densidad (LDL), fue tratado con transfusión en la vena cava inferior de hepatocitos modificados por medio de vectores ex vivo. En este caso la hipercolesterolemia fue parcialmente corregida durante los 18 meses siguientes, con una disminución de la relación LDL/HDL, la cual descendió de 10 a 5. Además, no hubo progresión de su enfermedad coronaria durante ese lapso22.
En las enfermedades genéticas con herencia multifactorial, las interacciones entre genes y ambiente son muy complejas, como lo demuestra el caso de la hipertensión arterial23, lo que podría dificultar aún más los esfuerzos para desarrollar una TG efectiva. Sin embargo, varios experimentos demuestran que sería posible incidir en uno o varios puntos del mecanismo fisiopatológico de estas enfermedades complejas. En la enfermedad coronaria, por ejemplo, luego de un infarto agudo al miocardio tratado con angioplastia puede haber un 30 a 40% de reestenosis, condicionada por la proliferación de la íntima de los vasos sanguíneos y la migración de plaquetas. Se ha visto que el óxido nítrico disminuye la proliferación de la íntima, pero por aterosclerosis o por efectos mecánicos se pierden las células endoteliales que poseen sintetasa del óxido nítrico. Ahora bien, se ha visto que en modelos de ratas con injurias a la carótida en las cuales se transfecta este gen, disminuye la proliferación de la íntima luego de un incremento en la producción de óxido nítrico24.
Asimismo, en experimentos de diabetes en ratones ob/ob deficientes en leptina y que exhiben obesidad y DMNID, al ser infectados con adenovirus modificados con el gen normal presentan disminución de la ingesta y en el peso, así como de la glicemia, mientras dura la expresión25.

Terapia génica en el tratamiento del cáncer26, 27
Tradicionalmente las aproximaciones al tratamiento del cáncer involucraban la destrucción de las células cancerosas con agentes quimioterapéuticos, radiación o cirugía. La TG es una cuarta estrategia que en algunos casos ha logrado disminuciones en el tamaño de los tumores sólidos que alcanzan entre un 50% y un 100%28, 29. Más de la mitad de los estudios clínicos para la TG están dirigidos al cáncer, en casi todos los sistemas.
Los principales métodos que utiliza la TG del cáncer son:
1. Aumento de la respuesta inmune celular antitumoral (terapia inmunogénica). Está basada en la habilidad del sistema inmune para montar un ataque contra el cáncer. Consiste en "educar"a las células del sistema inmune que han sido removidas del paciente, para que "adopten"características que les permitan destruir a las células cancerosas del paciente cuando le son posteriormente reinyectadas.
2. Introducción de genes activadores de drogas dentro de las células tumorales o terapia de genes suicidas. Consiste en la introducción selectiva de genes que codifican para la susceptibilidad a drogas que de otra manera no serían tóxicas. Esto lleva a la producción de enzimas (como por ejemplo la HSV-tk [Herpex simplex virus timidina kinasa]) que convierten prodrogas (vg ganciclovir, 5-fluorocitocina) en metabolitos citotóxicos que destruyen a las células tumorales en proliferación.
3. Normalización del ciclo celular. Consiste en la inactivación de oncogenes mutados, como el ras, o en la reexpresión de antioncogenes o genes supresores de tumor inactivos como el p53.
4. Manipulación de las células de la médula ósea. Es utilizada principalmente en la terapia génica de desórdenes hematológicos, y consiste en transferir a las células progenitoras hematopoyéticas genes de quimioprotección (genes de multirresistencia a drogas, los cuales permiten administrar dosis más altas de quimioterápicos) o de quimiosensibilización, entre otros.
5. Incremento del efecto circundante o "bystander effect". Este efecto se ha observado en la terapia de genes suicidas, en que, aunque sólo se infectan con los vectores 1 de 10 células, las células tumorales que no son infectadas también mueren. Se piensa que por procesos de comunicación intercelular (gap junctions), las células con la información letal transmitirían señales a sus vecinas que desencadenan el fenómeno de apoptosis o muerte celular programada. Se están investigando en detalle los mecanismos por medio de los cuales se produce este efecto, y la manera de incrementarlo.
6. Uso de ribozimas y tecnología antisentido o "antisense". Las ribozimas son ARN con actividad catalítica30 que actuarían incrementando la degradación del ARN recién traducido, disminuyendo proteínas específicas no deseadas, factor que a veces se asocia a alteraciones tumorales. La tecnología antisentido se refiere a oligonucleótidos de ARN que no tienen actividad catalítica, sino que son complementarios a una secuencia génica31. Estos oligonucleótidos podrían actuar por diferentes mecanismos:
a. Bloqueo del procesamiento (splicing) del ARN. El ARN que ha sido transcrito del DNA, antes de ser traducido a proteína muchas veces debe sufrir modificaciones para originar un RNA maduro. Bloqueando este procesamiento podemos impedir que se produzca una proteína nociva.
b. Impedimento del transporte del complejo RNA-antisense al citoplasma.
c. Bloqueo del inicio de la traducción.

Hay numerosos protocolos de aplicación de estas técnicas a la práctica clínica. Entre ellos tenemos un estudio clínico fase I de un grupo de pacientes con melanoma maligno, en el cual se modificaron células del melanoma con gen interferón-gamma, inactivadas y criopreservadas para utilizarse en forma de vacuna. Se administraron dosis crecientes de células una vez cada dos semanas a 13 pacientes para observar su respuesta inmune y los beneficios de la misma. Ocho de ellos presentaron algún tipo de respuesta inmune. En 2 pacientes que lograron una respuesta inmune significativa hubo regresión tumoral, y otros 2, con menor respuesta, presentaron resolución transitoria de nódulos32.

Terapia génica en el tratamiento del SIDA18, 33
El HIV, causante de esta enfermedad, trastorna el dogma central de la biología debido a la transcripción reversa de su RNA genómico y su integración al azar del ADN viral producido en el ADN del huésped, haciendo al provirus un rasgo heredable de la célula, que se mantiene mientras ésta exista. Esto, aunado al hecho de la excepcional plasticidad genética del HIV, proporciona un gran reto para la terapia génica, siendo, despúes del cáncer, el tópico que agrupa el mayor número de ensayos.
Objetivos:
1. Detener la replicación del HIV dentro de las células infectadas.
2. Impedir que el virus infecte a las células sanas.
Varias de las estrategias que se han utilizado involucran la manipulación de los monocitos y de las células CD4 o linfocitos T ayudadores, que son los más afectados por el virus. Como vectores se han utilizado frecuentemente los virus del HIV modificados que tienen un trofismo natural por las células CD4, pero que no se multiplican en ellas.
Estrategias:
1. Producción de vacunas anti HIV por medio de la introducción de moléculas del virus para entrenar al sistema inmune a que reconozca los virus y los elimine. Esto tendría que ser realizado antes de que el paciente cayera en el estado de inmunosupresión.
2. La utilización de anticuerpos que actúan intracelularmente y que impiden el ensamblaje de las partículas virales.
3. La terapia con genes suicidas, similar a la utilizada en la terapia del cáncer (ver arriba).
4. La introducción de genes que produzcan ribozimas que degraden el RNA viral.
5. La introducción de genes con mutaciones dominantes negativas, es decir, genes que produzcan proteínas similares a las virales, pero defectuosas, de manera que al involucrarse en la estructura y en las reacciones malogren el mecanismo viral de producir daño.

Limitaciones técnicas que confronta actualmente la terapia génica
Quedan aún muchos detalles técnicos que perfeccionar en la TG, esto en parte debido a nuestro desconocimiento del genoma y de sus mecanismos de regulación. Faltan por secuenciar la mayoría de los genes y también determinar cómo estos genes interactúan entre sí. Este conocimiento es crítico si se desea intervenir apropiadamente en este microambiente. Uno de los principales problemas de la técnica que resta por superar es el del perfeccionamiento de los métodos de distribución de los genes terapéuticos a las células. A menudo, los genes introducidos en los pacientes no alcanzan a las células apropiadas. Recordemos que los vectores virales son derivados de los virus que se encuentran en la naturaleza, y por lo tanto muchos de ellos infectan a las células del cuerpo de manera inespecífica. Esto puede ser un serio impedimento si se desea que el gen se exprese en una determinada proporción en un determinado órgano o tejido específico. En muchos casos la transfección tiene una eficiencia muy baja, que no es la suficiente para alcanzar el objetivo terapéutico (obtener una determinada cantidad del producto génico deseado).
Al mismo tiempo, los virus presentan la dificultad de que depositan su carga de ADN al azar dentro del ADN, lo cual puede ser nocivo si interfiere con un gen que esté funcionando normalmente, pues podría provocar la activación de oncogenes, con la consiguiente transformación cancerosa de la célula. Habría que determinar también cuánto puede tolerar la célula que se le aumente su cantidad de ADN (el cual se va incrementando cuando se introducen los nuevos genes) para que, a pesar de este aumento, pueda seguir funcionando normalmente.
Otro problema que se ha detectado es que muchas veces los genes introducidos funcionan pobremente o se apagan después de un tiempo. Esto se ha relacionado con la respuesta inmulógica que desencadenan los vectores virales, que haría que el sistema inmune eliminara las células que éstos han "infectado"con el gen normal.
Un aspecto importante sobre el cual son muy estrictos los organismos responsables de dar las autorizaciones para los estudios clínicos es el de garantizar la inocuidad de los virus utilizados. Este cuidado es absolutamente comprensible y necesario, tomándose en cuenta que los virus utilizados provienen muchas veces de virus patógenos. Buscar los mejores métodos para garantizar esta inocuidad es objeto de activa investigación.
Una dificultad que también se ha planteado son los costos de los protocolos clínicos, pues hasta ahora éstos son demasiado elevados para emplearlos como procedimientos de rutina34. Se espera que, como ha ocurrido con otras áreas de la tecnología, estos costos bajen al masificarse los productos.
Varias de las dificultades que hemos mencionado implican que es necesario un mejor conocimiento sobre la regulación de la expresión génica, y sobre cómo garantizar la estabilidad de los genes introducidos. Los cromosomas artificiales, los cuales han sido recientemente desarrollados y que se encuentran en una fase de experimentación preliminar, constituirán, en la medida en que puedan ser perfeccionados, como lo señalan sus propios creadores, una alternativa a esta última dificultad35 ya que pueden mantener una muy buena estabilidad durante sucesivas divisiones celulares.

Limitaciones éticas de la TG
Éstas están relacionadas en gran parte con la posibilidad del desarrollo de la terapia de células germinales, la cual ha originado grandes controversias, ya que al transmitirse los cambios efectuados en ellas a las siguientes generaciones se afecta el patrimonio genético de la especie humana, y un error de juicio y/o tecnológico pudiera tener muy malas e imprevisibles consecuencias. Por este motivo, este tipo de terapia ha sido totalmente proscrita por diferentes organismos internacionales (OMS, UNESCO y Consejo de Europa, entre otros)36, 37.
Como ante toda novedad, la terapia génica tiene partidarios entusiastas que, tal vez de una manera poco realista, ven en ella poco menos que el control de las enfermedades, y, por otro lado, grandes detractores. En todo caso, si se llegan a superar todos las dificultades técnicas, la TG puede redefinir la práctica de la medicina el próximo siglo, considerando sobre todo que desde hace sólo unos 8 años es que se tienen los primeros protocolos. Aunque hasta la fecha no se haya curado por completo a ningún paciente con este tipo de terapia, las perspectivas son atrayentes y vale la pena seguir explorándola como posibilidad, pero dentro de límites éticos.
Concebida en un principio para tratar enfermedades metabólicas raras, en la actualidad se espera que la terapia génica pueda incidir en la cura de enfermedades como el cáncer, la enfermedad coronaria y otras que hemos mencionado. No se puede dudar que es un nuevo y largo camino a recorrer, que seguramente traerá muchas satisfacciones a la práctica de la medicina, probablemente en un futuro no muy lejano.

 

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Agradecimientos
Al Dr. Ricardo Cruz-Coke por la revisión y sugerencias al manuscrito, así como también a los Dres. Carlos Valenzuela, Lucía Cifuentes y Mónica Acuña por facilitar el acceso a información.
 

Recibido el 14 de octubre, 1997. Aceptado en versión corregida el 5 de mayo, 1998.
Servicio de Genética, Departamento de Medicina, Hospital Clínico Universidad de Chile, y
Servicio de Genética, Hospital Roberto del Río. 

Correspondencia a: Dr. Enrique Daniel Austin-Ward. Servicio de Genética, Departamento de Medicina, Hospital Clínico Universidad de Chile. Santos Dumont 999, Santiago, Chile. Fonofax: 6788513.

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