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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.127 n.12 Santiago dic. 1999

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98871999001200005 

Emergencia de resistencia a
macrólidos en Streptococcus
pyogenes

Emergence of macrolide resistant
Streptococcus pyogenes strains

Claudia Vinagre del P, Marcela Cifuentes D,
Francisca Valdivieso R, Alicia Ojeda S1, Valeria Prado J.

Background: Diseases produced by Streptoccocus pyogenes are still a problem in Chile, as in the rest of the world. It exhibits in vitro susceptibility to different antimicrobials, but penicillin continues to be the treatment of choice. Alternative drugs have been developed for allergic patients, such as erythromycin, new macrolides and cephalosporins. Nevertheless, resistant strains are appearing due to the indiscriminate use of macrolides. Aim: To assess present antimicrobial susceptibility of S Pyogenes strains isolated from chilean patients. Material and Methods: The susceptibility to penicillin, macrolides, clindamycin, cephalotin and vancomycin of 153 S Pyogenes strains, obtained from different health centers of the Metropolitan Region and isolated between 1996 and 1998, was assessed using the Kirby-Bauer method. Agar dilution minimal inhibitory concentration was then determined to macrolide resistant strains. Results: All strains were susceptible to penicillin. There was a 7.2% cross-resistance to macrolides. Conclusions: These results confirm that S Pyogenes resistance to macrolides has increased considerably in the Metropolitan Region of Chile during the last years.
(Key Words: Antibiotics; Antibiotics, Macrolide; Bacterial Infections; Gram-Positive, Bacterial Infections)

Recibido el 7 de julio, 1999. Aceptado en versión corregida el 16 de agosto, 1999.
Unidad de Microbiología Oriente, Programa de Microbiología, ICBM, Facultad de Medicina,
Universidad de Chile. Santiago de Chile.
1Tecnólogo Médico

Las enfermedades producidas por el estreptococo betahemolítico grupo A o Streptoccocus pyogenes, continúan siendo un problema frecuente en Chile y en el resto del mundo1,2. A comienzos de la década de los ochenta se pensó que las complicaciones no supurativas de la infección estreptocócica, como la enfermedad reumática y la glomerulonefritis aguda, se encontraban en retirada. La aparición de brotes de estas enfermedades y el aumento en la incidencia de enfermedades invasivas graves, ha renovado el interés en este agente2,3.

A pesar de que S pyogenes es sensible a una variada gama de antimicrobianos4, la penicilina sigue siendo el tratamiento de elección, ya que no se ha observado un cambio importante en la susceptibilidad in vitro de S pyogenes a ella5,6. Sin embargo, es importante considerar investigaciones que revelan fallas de la penicilina en la erradicación bacteriológica del S pyogenes de la faringe, en cifras de hasta 30%7,8, situación que se considera indispensable para la prevención de la enfermedad reumática.

En el último tiempo se han desarrollado drogas alternativas, para pacientes alérgicos a penicilina o que no responden a ella; entre las que se encuentran la eritromicina, los nuevos macrólidos claritromicina y azitromicina y las cefalosporinas. Todos ellos han demostrado, en diversos estudios clínicos, ser una alternativa terapéutica con eficacia similar a la penicilina en pacientes con infecciones por S pyogenes6,9-11. Sin embargo, el uso indiscriminado de algunos de ellos ha llevado en algunas comunidades a la aparición de cepas resistentes. Es así como se describen, en diversos países, cifras de resistencia a eritromicina que van de 0,5% a 60%5,12,13.

Dentro de los mecanismos de resistencia descritos para los macrólidos destaca como más importante la alteración en el sitio blanco, el que se encuentra en el ribosoma 50S. Hay algunas bacterias capaces de producir una enzima metilasa dependiente del gen erm, de origen plasmidial o cromosomal, que transforma el sitio de acción de macrólidos, lincosámidas y estreptogramina B. Como resultado de esto, la bacteria se hace resistente a esos tres grupos de antimicrobianos (fenotipo conocido como MLS). Las enzimas pueden ser de tipo constitutivo o inducible, en este último caso en ausencia del macrólido la enzima no se produce. En términos prácticos, una vez adquirida la capacidad genética de producir la enzima metilasa, todos los macrólidos deben considerarse como no activos13-16.

Debido al aumento en el uso de los nuevos macrólidos observado en nuestro país, los efectos reportados en el extranjero frente al mismo fenómeno y los antecedentes nacionales que muestran la presencia de resistencia de cepas de S pyogenes a los macrólidos, consideramos de suma importancia determinar cuál es la susceptibilidad actual de S pyogenes en nuestro medio.

MATERIAL Y MÉTODO

Cepas: se estudiaron 153 cepas de Streptococcus pyogenes aisladas de procesos infecciosos, en diferentes hospitales, consultorios y servicios de salud del área metropolitana, entre los años 1996 y 1998. Se incluyeron 57 cepas aisladas en 1996, 26 en 1997 y 70 en 1998. La fuente de aislamiento de estas cepas fue: infecciones faríngeas 63, infecciones de piel y tejidos blandos 50, infecciones invasivas (hemocultivos, endometritis, neumonias) 12, otras secreciones 28.

Aislamiento e identificación de la cepa: se realizó siembra con tórula en placas de agar sangre de cordero al 5% incubándose durante 18-24 h a 37°C en CO2. A aquellas colonias con fenotipo de estreptococo (puntiformes, de 1 a 2 mm, blanquecinas), que presentaban betahemólisis y eran cocáceas grampositivas en cadena, se les realizó la prueba de catalasa. La identificación de S pyogenes se realizó en base a los siguientes criterios: catalasa negativo y susceptibilidad a la bacitracina. Una vez identificadas, las cepas fueron almacenadas a -70°C hasta el estudio de sensibilidad in vitro.

Clasificación de la resistencia: a) Se determinó la susceptibilidad in vitro mediante la técnica de difusión en agar de Kirby Bauer17. Se preparó un inóculo a partir de 4-5 colonias, se sembraron en caldo Mueller-Hinton, realizándose una incubación que permitió llevarlas a la turbidez equivalente a 0,5 Mc Farland. Posteriormente se sembró en placa de agar Mueller-Hinton suplementado con 5% de sangre de cordero y se colocaron los discos impregnados con los siguientes antimicrobianos: penicilina (10 mof), clindamicina (2 mg), eritromicina (15 mg), azitromicina (15 mg), claritromicina (15 mg), roxitromicina (15 mg), cefalotina (30 mg) y vancomicina (30 mg). Se utilizó cefalotina como representante de todas las cefalosporinas de primera generación (cefradina, cefalexina, cefaclor y cefadroxilo). Después de 18-42 h de incubación se midieron los halos de inhibición y, para la interpretación, se aplicaron los puntos de corte y el esquema de clasificación en categorías (susceptible, resistencia intermedia y resistente) recomendados por la NCCLS. Se utilizó como control una cepa de Streptococcus pneumoniae ATCC 49619.

b) Se determinó la concentración inhibitoria mínima (CIM) de eritromicina, azitromicina, claritromicina y roxitromicina, por el método de dilución en agar, a un total de 34 cepas, que fueron aquellas que resultaron resistentes o presentaron resistencia intermedia a uno o más macrólidos mediante la técnica de difusión en agar de Kirby Bauer. Se utilizaron diluciones seriadas en rangos de concentración entre 4 y 0,06 mg/ml para eritromicina, claritromicina y roxitromicina, y entre 8 y 0,125 mg/ml para azitromicina. Cada antimicrobiano (droga pura con potencia conocida), fue disuelto y diluido, siguiendo las recomendaciones de cada fabricante. Se utilizó agar Mueller-Hinton, suplementado con 5% de sangre de cordero, como medio base. El inóculo bacteriano fue ajustado a una densidad entre 105-106 UFC/ml; la siembra se realizó con el replicador múltiple de Steers, incubándose las placas en aerobiosis, durante 18-24 h a 37°C.

La CIM, definida como la concentración más baja de cada antibiótico capaz de inhibir completamente el crecimiento visible (99% de la población bacteriana) de las cepas de S pyogenes en estudio18, fue leída luego de completar el período de incubación. Los puntos de corte para determinar resistencia según NCCLS 1998 fueron los siguientes: eritromicina y claritromicina ³1 mg/ml; azitromicina y roxitromicina ³2 mg/ml. Se utilizó como control una cepa de Streptococcus pneumoniae ATCC 49619.

RESULTADOS

En nuestro estudio se analizó un total de 153 cepas aisladas en los años 1996, 1997 y 1998, realizándose un tamizaje inicial para diferentes antimicrobianos mediante la técnica de Kirby Bauer; confirmándose luego las cepas resistentes a macrólidos por medio de la determinación de la CIM.

Por la técnica de difusión en agar (Tabla 1), el 100% de las cepas estudiadas fue sensible a cefalotina y vancomicina. Un 0,6% resultó únicamente resistente a clindamicina, correspondiendo dicha cepa a una muestra de secreción faríngea. El 1,9% que presentó resistencia intermedia a dicho antimicrobiano estaba conformado por cepas aisladas de piel y tejidos blandos (una de ellas) y las dos restantes a partir de infecciones invasivas. No se observaron cepas resistentes a penicilina; sin embargo 11,8% presentó resistencia intermedia a este antimicrobiano, 50% de las cuales habían sido aisladas de procesos faringoamigdalianos. Con respecto a macrólidos, no se observó uniformidad en los niveles de resistencia para estos cuatro antimicrobianos, obteniéndose el porcentaje más elevado de resistencia (7,8%) frente a eritromicina.

Tabla 1. Resultado de la susceptibilidad in
vitro
, mediante la técnica de Kirby-Bauer.
de 153 cepas de S pyogenes aisladas
entre 1996-1998


Antibiótico Cepas   Cepas con resistencia
  Resistentes Intermedia
  n %   n %
 
Penicilina 0 0,0   18   11,8  
Cefalotina 0 0,0   0 0,0
Vancomicina 0 0,0   0 0,0
Clindamicina 1 0,6   3 1,9
Azitromicina 8 5,2   8 5,2
Claritromicina 9 5,9   9 5,8
Roxitromicina 10   6,5   7 4,5
Eritromicina 12   7,8   16   10,4  

La Tabla 2 señala los resultados obtenidos al determinar la CIM de eritromicina y nuevos macrólidos para las cepas que fueron resistentes o presentaron resistencia intermedia frente a uno o más macrólidos con la técnica de difusión en agar de Kirby Bauer (34 cepas); observándose 7,2% de resistencia frente a todos los macrólidos. Es importante señalar que aquellas cepas que presentaron resistencia intermedia con el método de difusión en agar resultaron sensibles al determinar la CIM. De las 15 cepas resistentes a uno o más macrólidos por la técnica de Kirby Bauer, sólo 11 fueron resistentes mediante la técnica de dilución en agar, observándose resistencia cruzada a los cuatro macrólidos en estudio. La fuente de aislamiento de las cepas resistentes fue piel y tejidos blandos en 8 de ellas y faringoamigdalitis en las 3 restantes.

Tabla 2. Determinación cuantitativa de la
susceptibilidad in vitro (CIM) de 34 cepas de
S pyogenes resistentes o con resistencia
intermedia por Kirby Bauer


Antibiótico
CIM mg/ml
CIM 90 mg/ml n cepas
 
Rango
  resistentes
          por CIM

Eritromicina <0,06   - >4
0,125
11
Claritromicina <0,06   - >4 0,06 11
Roxitromicina <0,06   - >4 0,25 11
Azitromicina <0,125- >8 0,25 11

A partir de 1997 se detectó un brusco aumento en la proporción de cepas resistentes a macrólidos, de 1,8% a 11,5%, manteniéndose estos valores en niveles similares en 1998, como se muestra en la Tabla 3.

Tabla 3. Variaciones en la susceptibilidad
in vitro a macrólidos en cepas de S pyogenes
entre 1996 y 1998

Año Cepas Cepas resistentes
  estudiadas a macrólidos
  n % n %

1996 57 37,2 1   1,8
1997 26 17,0 3 11,5
1998 70 45,8 7 10,0
         
Total 153   100      11     7,2

En relación al patrón de determinantes de resistencia presentes en cada cepa se observó que, de las 153 cepas estudiadas: 124 eran sensibles a todos los antimicrobianos; 11 resistentes a los cuatro macrólidos presentando una de ellas, además, resistencia intermedia a la penicilina. A parte de esta última cepa mencionada, otras 17 presentaron resistencia intermedia a este antimicrobiano, la que se encontraba asociada en 2 de ellas a resistencia intermedia frente a clindamicina. Se observó sólo una cepa resistente exclusivamente a clindamicina.

DISCUSIÓN

Desde mediados de los años ochenta, un aparente resurgimiento de las enfermedades de tipo invasivo provocadas por el estreptococo betahemolítico del grupo A, así como de la fiebre reumática y las complicaciones no supurativas de las infecciones por este microorganismo, ha sido comunicado en Estados Unidos y diferentes países de Europa5,13. Las razones no son claras, sugiriéndose diferentes alternativas, dentro de las cuales se plantea la posibilidad de un cambio sustancial en la susceptibilidad de S pyogenes a los antimicrobianos comúnmente utilizados.

Los resultados de susceptibilidad obtenidos en el presente estudio frente a cefalosporinas, vancomicina y clindamicina, concuerdan con trabajos que revelan una ausencia de cepas de S pyogenes resistentes a los dos primeros antimicrobianos, y niveles de resistencia a clindamicina que se han mantenido constantes desde 1990 en cifras que van del 0,0% al 4,3%4,5.

Nuestro estudio reveló que la susceptibilidad in vitro de S pyogenes a penicilina se ha mantenido, así como ha sido señalado además por diversos autores4-6. Sin embargo, llama la atención el porcentaje no despreciable (11,8%) de cepas con resistencia intermedia, siendo la mitad de ellas aisladas de procesos faringoamigdalianos, hecho que podría explicar en parte los informes que revelan fallas en la erradicación bacteriológica del microorganismo desde la faringe. Las razones de este fenómeno, aun utilizando las dosis adecuadas de penicilina y por el tiempo recomendado, no han sido aclaradas y obedecen aparentemente a un fenómeno de co-patogenicidad, que se refiere a la inactivación de la penicilina por acción de betalactamasas producidas por la flora comensal de la faringe7.

Eritromicina, un antimicrobiano bacteriostático, representa una alternativa frente a infecciones por S pyogenes que no responden a penicilina o bien en pacientes alérgicos a ella. Actualmente se dispone además de nuevos macrólidos como la claritromicina, azitromicina y roxitromicina, que poseen ventajas farmacodinámicas y menores efectos colaterales gastrointestinales al compararlos con eritromicina19, por lo que son utilizados ampliamente. Información sobre la venta de macrólidos en Chile en los últimos años indica que fueron comercializadas 1.689.045 unidades en 1997 y 1.729.874 unidades en 1998, registrándose el mayor aumento en las ventas de eritromicina y destacándose la aparición de nuevas formas comerciales de claritromicina (comunicación personal Dra. V Prado).

Estudios realizados en nuestro país, entre los años 1990 y 1992, revelaban una sensibilidad de 100% en cepas de S pyogenes frente a eritromicina y nuevos macrólidos6. Esta situación se mantuvo hasta el año 1996, cuando una resistencia de 10% fue comunicada para eritromicina (Palavecino y cols, 1997. XIV Congreso Chileno de Infectología). Antecedentes comunicados en el Congreso Chileno de Infectología, realizado en 1998, revelaron una resistencia de 13,5% de S pyogenes frente a eritromicina, en cepas aisladas entre 1995 y 1997 (Libro Resúmenes, 1998).

En nuestro estudio, el porcentaje de resistencia encontrado para macrólidos fue de 7,2%, que es bajo si se compara con lo descrito en países como Japón, Finlandia o Australia, donde los porcentajes fluctúan entre 54 y 60%5. Sin embargo, los porcentajes de resistencia reportados en España y otros países de Europa son similares a lo observado por nosotros4. Llama la atención el notable aumento en la resistencia entre un año y otro (1,8% en 1996, 11,5% en 1997 y 10% en 1998), lo que concuerda con la información que revela un aumento en el número de unidades de macrólidos comercializadas en esos años. No obstante, hay que considerar el hecho de que el número de cepas estudiadas en cada año, tanto en el presente estudio como en otros realizados en nuestro país, es más bien pequeño, por lo que los porcentajes de resistencia son susceptibles de variar en los años estudiados, así como también entre los diferentes trabajos.

A pesar que la resistencia a eritromicina y clindamicina están frecuentemente asociadas (fenotipo MLS)15,16, nosotros detectamos sólo una cepa de S pyogenes resistente a clindamicina. Aun así, debido al mecanismo de resistencia inducible15, es posible que clindamicina no presente efectividad clínica contra esta cepa, aun cuando sea activa in vitro. Otra posibilidad a considerar es que las cepas analizadas en nuestro estudio posean fenotipo M, el que ha sido recientemente descrito en cepas de S pyogenes de Finlandia, Australia y Norte América. Estas cepas presentan resistencia a macrólidos pero mantienen la susceptibilidad a clindamicina y estreptogramina B, ninguna de ellas posee el determinante erm y su mecanismo de resistencia no se relaciona con modificación en el sitio activo sino, que aparece como un fenómeno mediado por una bomba de eflujo activo aparentemente diferente al sistema de eflujo descrito para cepas de estafilococo resistentes a eritromicina20,21.

Queremos destacar el hecho que entre los antimicrobianos recomendados por la NCCLS para ser estudiados en forma primaria para S pyogenes, no se incluyen a las lincosamidas (ej. clindamicina) principalmente porque la resistencia a eritromicina era considerada como resistencia cruzada con este antimicrobiano (fenotipo MLS). La reciente descripción de cepas de S pyogenes que poseen fenotipo M cobra importancia frente a casos de infecciones invasivas severas por cepas de estreptococo betahemolítico grupo A resistentes a macrólidos en pacientes que no pueden ser tratados con antibióticos betalactámicos5,20. Por esto consideramos necesario mantener, en nuestro medio, una vigilancia acerca de la susceptibilidad in vitro de las cepas de S pyogenes incluyendo clindamicina, penicilina y macrólidos, al mismo tiempo que tratar de disminuir el consumo indiscriminado de estos últimos. Más aún, de acuerdo a los resultados obtenidos en nuestro estudio, cepas de S pyogenes provenientes tanto de piel como de tejidos blandos debiesen ser estudiadas con mayor acuciosidad, ya que aquellas cepas resistentes a macrólidos fueron aisladas mayoritariamente de dichas regiones.

Correspondencia a: Dra. Claudia Vinagre del P. Martín de Zamora 4681 Dpto. 46. Teléfono: 2285765. Fax: 2045460. E-mail: gtomasel@chilesat.net

Agradecimientos
Agradecemos la generosa colaboración de la Dra. Nancy Henríquez, Dr. Velimir Mihalic, Dra. Beatriz Lynch, Dra. Lorena Portes, Alicia Ojeda y Marisol Giglio, quienes nos aportaron cepas de S pyogenes.

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