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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.128 n.1 Santiago ene. 2000

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872000000100002 

Partículas lipoproteicas
LpA-I, LpA-I: A-II y LpB en
enfermedad coronaria

Lipoprotein particles LpA-I, LpA-I: A-II
and LpB in patients with coronary
artery disease

Carlos Calvo M, Alfonso Olmos C, Natalia Ulloa M,
Alejandra Bustos A, Lorena Toledo B, Daniel Durán S,
Rina Naveas

Background: High density lipoproteins are an heterogeneous population of particles. Two main subpopulations have been identified, one contains Apo A-I and Apo A-II and is denominated LpA-I:A-II and another one contains only Apo A-I and is denominated LpA-I. Aim: To measure the concentrations of these particles in patients with stable coronary artery disease. Patients and Methods: Serum lipids, A-I and B apolipoproteins, LpA-I, LpA-I:A-II and LpB particles were measured in 73 men aged 33 to 82 years with angiographically documented coronary artery disease (CAD) and 33 control subjects aged 39 to 76 years. LpA-I, LpA-I:A-II and LpB were measured by a noncompetitive enzyme linked immunoassay using previously characterized monoclonal antibodies against ApoA-I, ApoA-II and apoB. Results: Patients with CAD had significantly higher mean levels of LDL cholesterol than the control group (p= 0.038). The mean concentration of LpA-I particles in patients with CAD was significantly lower (p= 0.031) than in control subjects, while the concentration of LpA-I:A-II particles was significantly higher (p=0.016). The percentage of coronary stenosis correlated negatively with LpA-I and positively with LpA-I:A-II. The best relative risk (RR) indicator in these patients was LDL-cholesterol. The relative risk increases 2.5 fold when LpA-I falls below the cut-off level. Likewise, the relative risk increases 3-fold when LpA-I:A-II raises over the cut-off level. Conclusions: Our findings indicate that the quantification of LpA-I and LpA-I:A-II particles might allow a more accurate evaluation of the CAD risk than HDL cholesterol. LpA-I might represent the antiatherogenic fraction of HDL. (Rev Méd Chile 2000; 128: 9-16)
(Key Words: Coronary disease; Cholesterol; Lipoproteins; Lipoproteins, HDL cholesterol

Recibido el 9 de marzo, 1998. Aceptado en versión corregida el 11 de noviembre, 1999.
Departamento de Bioquímica Clínica e Inmunología, Facultad de Farmacia, Departamento
de Medicina Interna, Facultad de Medicina, Departamento de Ingeniería Matemática,
Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas, Universidad de Concepción, Concepción, Chile.
Trabajo Financiado por Proyecto FONDECYT # 1951127.

La aterosclerosis y su principal manifestación clínica, la enfermedad coronaria, constituye la principal causa de muerte en Chile1.

Reconociendo la participación de múltiples factores en la génesis de la aterosclerosis y en el desarrollo de sus complicaciones clínicas, existe consenso en que las dislipoproteinemias aparecen como el factor etiopatogénico más destacado2.

Los métodos actualmente existentes para el fraccionamiento de las diferentes lipoproteínas se basan en criterios fisicoquímicos tales como la densidad de hidratación y la movilidad electroforética, que ha conducido a la nomenclatura de VLDL, LDL y HDL o pre-beta, beta y alfa lipoproteína. La mayoría de los estudios clínicos y epidemiológicos llevados a cabo en los últimos años reposan sobre este concepto que ha servido de base a la clasificación de las dislipidemias. Sin embargo, trabajos recientes han puesto en duda su validez, demostrando una alta heterogeneidad de las lipoproteínas según las clasificaciones actuales3.

Diversos estudios epidemiológicos han demostrado la existencia de una correlación directa entre los niveles de colesterol de LDL y el riesgo de cardiopatía coronaria4,5. Sin embargo, resultados sobre fraccionamiento de LDL por inmunoprecipitación han demostrado la existencia de tres tipos de lipoproteínas que contienen apoB. La más importante (LpB) contiene apoB como único constituyente proteico; una fracción menor contiene apoB asociada con apoC-III o apoE (LpB:C-III, LpB:E)6. De igual forma, existen múltiples evidencias que confirman una relación inversa entre el colesterol-HDL y el desarrollo de la enfermedad coronaria7,8 y que ha conducido a la hipótesis que niveles altos de HDL constituyen un factor protector de enfermedad aterosclerótica. Recientemente, se ha establecido que las HDL están constituidas por una población heterogénea de partículas, identificándose al menos dos principales subpoblaciones, una que contiene apoA-I y apoA-II, denominada LpA-I:A-II y otra que contiene apoA-I pero no apoA-II, denominada LpA-I9.

En nuestro laboratorio se ha logrado producir y caracterizar una serie de anticuerpos monoclonales dirigidos contra diferentes apolipoproteínas humanas, lo que ha permitido aislar diversas partículas lipoproteicas mediante inmunoafinidad secuencial. Del mismo modo, estos anticuerpos en forma individual o en mezcla, han hecho posible la estandarización de enzima-inmunoensayos para la cuantificación de estas partículas en plasma10-14.

El objetivo del presente estudio es evaluar la asociación entre los niveles de lipopartículas (LpAI, LpAI:AII y LpB) y enfermedad coronaria mediante un estudio de caso-control en un grupo de hombres no diabéticos con distinto grado de estenosis coronaria documentado angiográficamente.

MATERIAL Y MÉTODO

Muestra. Se seleccionaron 73 pacientes de sexo masculino de edades entre 33 y 82 años (59,0 ± 9,2), con coronariopatía confirmada angiográficamente. El criterio de selección fue la presencia de más de 50% de estenosis en una o más ramas del árbol coronario. El valor promedio de estenosis para este grupo fue de 82,2 ± 11,8%. Se excluyeron del estudio pacientes que presentaban historia de cirugía coronaria o angioplastia coronaria, pacientes con enfermedad valvular, diabetes mellitus, insuficiencia renal o hepática concomitante, disfunción tiroidea, pacientes que habían sufrido infarto al miocardio en las seis semanas previas al estudio y aquellos con terapia de hipolipemiantes. Para descartar diabetes mellitus se consideró ausencia de historia previa y glicemias de ayuno inferior a 140 mg/dl repetidas. La coronariografía fue realizada por la técnica de Judkins15. Los datos clínicos se obtuvieron del examen médico evaluándose además antecedentes familiares de cardiopatía coronaria, hipertensión, tabaquismo, peso, estrato socioeconómico, consumo de medicamentos, alcohol, cafeína y la presencia de otras enfermedades.

Grupo control: se constituyó con 33 hombres de edad comparable (55,2 ± 9,7) en los cuales mediante angiografía se demostró desde 0% hasta un máximo de 40% de estenosis en alguna rama del árbol coronario. El valor promedio de estenosis para este grupo fue de 12,0 ± 15,3%. Se excluyeron del estudio sujetos diabéticos, hipertensos y portadores de otras patologías que modifican el perfil lipídico al igual que sujetos bajo terapia hipolipemiante.

Las muestras de sangre de los sujetos con 12 h de ayuno se colectaron en la mañana del día de realización de la coronariografía usando EDTA (1 mg/ml) como anticoagulante. El plasma se separó inmediatamente por centrifugación a 1500 x g durante 15 min. Para la evaluación del perfil lipídico el plasma se conservó a 4°C hasta el momento del análisis el cual fue realizado dentro de las 24 h. Las muestras para la medición de las partículas lipoproteicas fueron alicuotadas y conservadas a -80°C.

El presente estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Concepción.

Cuantificación de partículas lipoproteicas. Las partículas LpA-I totales se cuantificaron mediante un enzima-inmunoensayo (ELISA) no competitivo tipo "sandwich" que utiliza un anticuerpo monoclonal dirigido contra la apoA-I (AO5), como anticuerpo de captura y otro anticuerpo monoclonal contra apoA-I (6B9), previamente biotinilado, como sistema de revelado. Ambos anticuerpos reconocen a la apo A-I tanto en partículas LpA-I como LpA-I:A-II. Para construir la curva de calibración se utilizó un suero valorado para lipopartículas LpA-I totales donado por JC Fruchart, Instituto Pasteur de Lille, Francia.

Las lipopartículas LpA-I:A-II se cuantificaron mediante un ELISA no competitivo tipo "sandwich" utilizando un anticuerpo monoclonal dirigido contra la apo A-I contenida en las lipopartículas LpA-I:A-II (FF9B10) como anticuerpo de captura y un anticuerpo monoclonal que reconoce selectivamente a la apo A-II (3F5) conjugado a peroxidasa, como sistema de revelado. Para la calibración se usó un suero valorado de la misma procedencia.

Las lipopartículas que contienen sólo apoA-I (LpA-I) se calcularon por diferencia entre la concentración de LpA-I total y LpA-I:A-II.

Las partículas LpB se cuantificaron mediante un ELISA no competitivo tipo "sandwich" que utiliza dos anticuerpos monoclonales anti apoB-100 (4A6E3 y 6A10B10) como anticuerpos de captura y un anticuerpo monoclonal anti apoB (2D9) conjugado a biotina como sistema de revelado. En la curva estándar se utilizó como antígeno suero valorado para apoB. Los coeficientes de variación intra e inter ensayo para las lipopartículas variaron entre 4 y 10%, respectivamente.

Colesterol total, colesterol-HDL, triglicéridos, apoB y apoA-I se midieron utilizando un kit comercial de Boehringer Mannheim. El colesterol-LDL se estimó a partir de la fórmula de Friedewald16 cuando los triglicéridos totales no excedieron de 400 mg% y en caso contrario, colesterol-LDL fue cuantificado mediante el kit específico. Para la determinación de cada uno de estos parámetros se realizó control de calidad interno, utilizando un suero control comercial Boehringer Mannheim.

Análisis estadístico. Para establecer el grado de significancia de los promedios de colesterol total, colesterol-HDL, colesterol-LDL, apoA-I y apoB entre ambos grupos, se aplicó la prueba t-Student. En el caso de los triglicéridos se utilizó la prueba de Mann-Whitney. Con el objeto de establecer el grado de significancia entre los parámetros LpA-I, LpA-I:A-II y LpB observado en los pacientes con enfermedad coronaria y en los sujetos controles, se estableció la distribución de la población mediante la prueba de chi cuadrado de Bondad de ajustes y luego se compararon los promedios de LpB y LpA-I:A-II mediante la prueba t-Student y los promedios de LpA-I mediante la prueba de Mann Whitney. Además, se realizó un estudio de correlación entre los distintos parámetros analizados y el grado de estenosis coronaria. Todos estos análisis se realizaron con el sofware GraphPad Prism 2.0.

Los odds ratio (OR) para los parámetros estudiados se calcularon utilizando el Software ORINTA17 y considerando como "cut-off" el punto del análisis de correlación que corresponde a 50% de estenosis coronaria.

RESULTADOS

En la Tabla 1 se muestran los valores promedio, desviación estándar y significado estadístico de los parámetros colesterol total, triglicéridos, colesterol-HDL, colesterol-LDL, apoA-I y apoB, en pacientes con enfermedad coronaria y en sujetos controles. Los pacientes con enfermedad coronaria muestran una concentración promedio de colesterol-LDL significativamente mayor que los sujetos controles. Aunque los promedios de colesterol total, triglicéridos y apoB muestran una tendencia hacia valores más altos en los sujetos enfermos, estas diferencias no fueron significativas. De la misma forma, los pacientes presentan menores concentraciones promedio de colesterol-HDL y apoA-I, pero con diferencias no significativas.

Tabla 1. Niveles de lípidos y apoliproteínas en pacientes
con enfermedad coronaria y en sujetos controles

 
Pacientes
Controles
p
 
(n = 72)
(n = 34)
 

 
Promedio ± DS (mg/dL)
 
Colesterol Total 224,3 ± 52,5 205,7 ± 38,0 0,067¥
Triglicéridos 183,8 ± 93,4 172,1 ± 94,8 0,352§
Colesterol-HDL 39,4 ±   9,3 43,3 ± 14,0 0,089¥
Colesterol-LDL 147,8 ± 48,6 128,0 ± 36,5 0,038¥
Apo A-1 121,5 ± 40,6 122,7 ± 25,5 0,874¥
Apo B 125,6 ± 31,9 114,3 ± 21,0 0,062¥

Significancia estadística calculada mediante t-Student no pareado (¥) o Mann-Whitney (§)

El estudio de la distribución de lipopartículas en las poblaciones estudiadas demostró que LpA-I:A-II y LpB poseen un comportamiento Gaussiano en ambos grupos, en tanto que LpA-I presentó una distribución sesgada en ambos grupos. La Tabla 2 muestra las concentraciones promedio de lipopartículas LpA-I, LpA-I:A-II y LpB. Se observa que los pacientes presentan una concentración promedio de LpA-I significativamente inferior al grupo control y en cambio una concentración promedio de LpA-I:A-II significativamente superior a la del grupo control.

Tabla 2. Concentración plasmática de lipopartículas LpA-I, LpA-I: A=II y LpB,
en pacientes con enfermedad coronaria y en sujetos controles

 
Pacientes
Controles
p
 
(n = 70)
(n = 33)
 

 
Promedio ± DS (mg/dL)
 
LpA-1 27,0 ± 36,6 42,6 ± 41,5 0,031§
LpA-I:A-II 81,9 ± 19,8 72,0 ± 18,4 0,016¥
LpB 152,1 ± 46,0 147,0 ± 28,1 0,559¥

Significancia estadística calculada mediante t-Student no pareado (¥) o Mann-Whitney (§)

La diferencia estadística más significativa entre los pacientes con enfermedad coronaria y el grupo control correspondió a los valores de LpA-I:A-II (p=0,016), seguido por LpA-I (p=0,031) y colesterol-LDL (p=0,038).

En las Figuras 1a y 1b se muestra la correlación entre la concentración de lipopartículas LpA-I, LpA-I:A-II y el porcentaje de estenosis en las poblaciones estudiadas (casos y controles). Las partículas LpA-I presentaron una correlación moderadamente negativa (r= -0,24; p=0,016); en cambio las partículas LpA-I:A-II mostraron una correlación moderadamente positiva con el grado de estenosis (r=+0,27; p=0,005). No se observó correlación significativa entre LpB y porcentaje de estenosis.

FIGURA 1. Análisis de correlación entre lipopartículas Lp A-I (a) o Lp A-I:A-II (b) y el porcentaje de estenosis. La línea punteada marca en el eje de las ordenadas la concentracion de cada parámetro correspondiente al 50% de estenosis y que definimos como punto de corte o "cut-off".

En la Tabla 3 se muestran los OR e intervalos de confianza para el riesgo de enfermedad coronaria asociado a niveles de lípidos y lipopartículas. Para esto se utilizó el "cut-off" determinado según se especifica en la metodología y que se establece en la tabla para cada parámetro. Los OR demuestran que los sujetos con colesterol total elevado presentan un riesgo relativo de sufrir enfermedad coronaria 2,5 veces mayor. El riesgo relativo aumenta alrededor de 4 veces cuando el colesterol LDL se encuentra elevado. Los niveles bajos de colesterol HDL no permiten establecer un riesgo diferencial entre las poblaciones estudiadas; sin embargo, la cuantificación de subpoblaciones de HDL (LpA-I y LpA-I:AII) permitió evidenciar que los sujetos con niveles bajos de LpA-I poseen un riesgo 2,5 veces superior y que los sujetos con niveles elevados de LpA-I:A-II presentan un riesgo relativo alrededor de 3 veces superior.

Tabla 3. OR e intervalos de confianza para el riesgo de enfermedad coronaria
asociado a niveles de lípidos y lipopartículas

Parámetro
Cut-off§
OR
95% IC
c2 p
 
(mg/dl)
           

Colesterol total <216 2,47 1,05 -   5,81 4,41 0,036
Colesterol-LDL <138 4,06 1,62 - 10,18 9,56 0,002
Colesterol-HDL ³41 1,17 0,51 -   2,68 0,13 0,710
LpA-I ³34 2,47 1,05 -   5,81 4,46 0,035
LpA-I:A-II £77 3,04 1,31 -   7,07 6,92 0,008

§ cut-off determinado como se establece en métodos, indicando el límite de aceptabilidad para cada parámetro

DISCUSIÓN

Diversos procedimientos están siendo desarrollados hoy en día para identificar individuos con riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares18. Existen múltiples evidencias acerca de la importancia de los lípidos, lipoproteínas y apolipoproteínas19 y especial importancia se le ha atribuido a la relación directa entre los niveles de colesterol-LDL y el riesgo de enfermedad coronaria como a la relación inversa entre el colesterol-HDL y el riesgo coronario20,21. Sin embargo, el análisis de las lipoproteínas en base a sus propiedades fisicoquímicas debe ser considerado con cautela ya que ellas no constituyen especies homogéneas, sino más bien corresponden a una mezcla heterogénea de partículas que difieren en su composición apolipoproteica como en la expresión de epítopes en la superficie de la partícula lipoproteica22. En el presente estudio el uso de anticuerpos monoclonales ofreció enormes ventajas ya que permitió la identificación de subpoblaciones de lipopartículas que no pueden ser distinguidas por los métodos convencionales.

El modelo angiográfico usado en este estudio permitió determinar con alto grado de certidumbre la existencia o ausencia de lesiones coronarias, a diferencia de los estudios clínicos donde la definición de caso control no puede asegurarse totalmente.

Los valores de "cut-off" definidos como el punto de concentración que corresponde al 50% de estenosis, para los parámetros convencionales (colesterol total, colesterol-HDL, colesterol-LDL), son muy cercanos a los valores de corte actualmente considerados para la clasificación de las dislipidemias, lo que apoya la validez de nuestro criterio para establecer el "cut-off" de las partículas en estudio.

El hecho que los niveles de apo B fueran más altos en los pacientes coronarios que en los sujetos control, confirma que la elevación del colesterol-LDL corresponde a un aumento en el número de partículas de LDL. Las partículas LpB en cambio, no mostraron relación a lo observado con el colesterol-LDL. Este hecho sugiere que el aumento de partículas LDL detectado en pacientes con coronariopatía podría ser a expensas de partículas del tipo LpB:C-III y LpB:E, a las cuales se les atribuye un mayor poder aterogénico que a las partículas LpB23. Es preciso señalar que el ELISA utilizado en este estudio pudiera haber detectado selectivamente la subpoblación de partículas LpB (sólo con apoB) ya que en los esquemas de inmunización para la producción de anticuerpos monoclonales contra apoB se usó como inmunógeno una fracción de densidad entre 1.025-1.050 g/ml, la cual contiene muy bajo porcentaje de partículas del tipo LpB:C-III y LpB:E23. El hecho de que el riesgo relativo de enfermedad coronaria aumentara alrededor de 4 veces cuando el colesterol-LDL se encuentra elevado por sobre los niveles de "cut-off", confirma la importancia de este parámetro como factor de riesgo cardiovascular.

Los niveles de colesterol-HDL fueron levemente menores en el grupo de pacientes coronarios que en los sujetos control, mientras la concentración de apoA-I permaneció prácticamente igual en ambos grupos. Este resultado sugiere que los niveles inferiores de colesterol-HDL corresponderían más bien a una disminución en el contenido de colesterol de las HDL y no a una disminución en el número de partículas de HDL. Lo anterior no descarta una redistribución en el contenido de lipopartículas LpA-I y LpA-I:A-II.

En efecto, un aspecto importante de destacar es el hallazgo de niveles significativamente menores de lipopartículas LpA-I, acompañado de mayores niveles de lipopartículas LpA-I:A-II en los pacientes coronarios respecto a los sujetos controles, aún cuando la concentración de apoA-I total fuera casi la misma en los dos grupos. Este nivel menor de partículas LpA-I se correlacionó inversamente con el porcentaje de estenosis; en cambio, las partículas LpA-I:A-II mostraron una correlación positiva con el grado de estenosis. Estos resultados concuerdan en parte con lo reportado por otros autores24 quienes encontraron menores concentraciones de LpA-I pero iguales concentraciones de LpA-I:A-II en pacientes con enfermedad coronaria, en relación a un grupo control. En otro estudio realizado en un grupo de pacientes previo a bypass coronario se demostró que tanto las concentraciones de LpA-I como de LpA-I:A-II fueron más bajas en los pacientes que en los sujetos controles25. Trabajos más recientes comparan las concentraciones de LpA-I en tres regiones distintas con diferentes tasas de mortalidad por infarto al miocardio, demostrando que la concentración de LpA-I fue menor en aquella población con más alta mortalidad por infarto26. Nuestro estudio demostró que la concentración del colesterol-HDL no sería un buen indicador de riesgo de patología cardiovascular, en cambio, las subpoblaciones de HDL, LpA-I y LpAI:A-II demostraron ser útiles para la evaluación del riesgo relativo. Es así como sujetos con concentraciones de LpA-I por debajo de los niveles de "cut-off" presentan un incremento de 2,5 veces en el riesgo relativo de presentar patología coronaria. En sujetos con concentraciones de LpA-I:A-II por sobre los niveles de "cut-off" el riesgo es 3 veces superior.

Todos estos antecedentes demuestran la existencia de una alteración en los niveles de partículas LpA-I y LpA-I:A-II asociados a enfermedad coronaria y sugieren fuertemente que la determinación de estas partículas sería una prueba más eficiente que el colesterol-HDL para la detección de individuos con riesgo de desarrollar esta enfermedad.

El análisis de las partículas lipoproteicas LpA-I y LpA-I:A-II aparece como una vía promisoria para elucidar uno de los mecanismos involucrados en la fisiopatología de la aterogénesis.

Se ha demostrado que el eflujo de colesterol desde células periféricas es facilitado por las partículas LpA-I mediante la unión de ésta a un sitio específico de la superficie celular y que las partículas LpA-I:A-II interaccionarían con el mismo sitio sin ejercer un efecto en este proceso27,28. Además, las dos proteínas claves del transporte reverso de colesterol como son la lecitina: colesterol aciltransferasa (LCAT) y la proteína de transferencia de colesterol (CETP) se han encontrado presentes principalmente en partículas LpA-I3. Estas observaciones sugieren que los menores niveles de partículas LpA-I podrían reflejar una alteración del proceso del transporte reverso de colesterol, lo que conduciría a un aumento del riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares. Esta hipótesis es apoyada por recientes evidencias que muestran que animales transgénicos para el gen de la apoA-I humana sometidos a una dieta hipercolesterolémica, desarrollan menos lesiones ateroscleróticas que animales que sobre-expresan el gen de la apoA-I y la apoA-II29. Todo lo anterior guarda una lógica relación con los resultados obtenidos en el presente estudio, donde se demuestra que existen niveles inferiores de partículas LpA-I y superiores de LpA-I:A-II en pacientes con coronariopatía. El conjunto de estas evidencias sugieren fuertemente que las partículas LpA-I representarían la fracción antiaterogénica de las HDL cuyo efecto benéfico sería contrarrestado por las partículas LpA-I:A-II.

Finalmente, el presente análisis de las lipoproteínas plasmáticas basado en su contenido en apolipoproteínas podría proveer una nueva base para la clasificación de las dislipoproteinemias, la evaluación del riesgo relativo y la evaluación del efecto de terapias hipolipemiantes.

Correspondencia a: Dr Carlos Calvo M. Casilla 237, Universidad de Concepción. Concepción, Chile. email: ecalvo@udec.cl

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