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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.128 n.2 Santiago feb. 2000

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872000000200015 

CARTAS AL EDITOR

Se invita a los lectores a enviar cartas al Editor, con comentarios, preguntas o críticas sobre artículos que hayan sido publicados en la Revista y a las que los autores aludidos puedan responder. También serán bienvenidos los comentarios sobre problemas de actualidad biomédica, clínica, de salud pública, de ética y de educación médica. Podrá aceptarse la comunicación preliminar de datos parciales de una investigación en marcha, respetándose la norma básica de que no haya sido publicada ni sometida a publicación en otra revista. La extensión máxima aceptable es de 3 páginas, tamaño carta, escritas a doble espacio, con un máximo de 6 referencias bibliogáficas (incluyendo el artículo que la motivó) y 1 Tabla o Figura. Las cartas que se acepten podrán ser acortadas y modificadas formalmente, por los Editores.

Caracterización de la región 5’ no
codificante del virus de la hepatitis C

Characterization of the non coding 5’
region of hepatitis C virus

 

S r. Editor: Hemos leído con especial atención el artículo de Barro, Vásquez y Spencer "Uso de una reacción de polimerasa en cadena simple combinada con un ensayo de heteroduplexes en la caracterización de la región 5’ no codificante del virus de la hepatitis C"1, ya que la iniciativa de esta investigación se inició a partir de un Proyecto Inserm (Francia) que nuestro Centro desarrollaba en conjunto con el Instituto Pasteur, para la implementación de técnicas de biología molecular en el estudio del virus de la hepatitis C.

Para lo anterior, el Dr. Spencer se contactó con uno de los autores de esta carta (MVR) quien le proporcionó sueros seleccionados para permitir la estandarización del nuevo método propuesto. Las muestras de suero correspondieron a sujetos RNA-VHC positivos con distintas características: a) ocho sueros de pacientes con hepatitis crónica, no tratados y con alta carga viral; b) siete sueros de enfermos tratados con interferón, no respondedores o con recaída, habiendo establecido los distintos genotipos por el método de RFLP; y c) ocho sueros RNA-VHC negativos provenientes de enfermos con diagnóstico de otras patologías hepáticas.

El método que utilizamos para la detección de RNA en esos sueros no corresponde a la referencia mencionada, ya que el nuestro es un RT-PCR anidado, modificado y adaptado por nuestro laboratorio2, cuya sensibilidad es de 50-80 copias de RNA/ml.

Por otra parte, en relación al trabajo presentado por los autores quisiéramos hacer algunos comentarios:

1. Existe en la introducción un error, probablemente de transcripción, ya que los autores se refieren a un ensayo de movilidad electroforética de productos de PCR anidado, lo cual no corresponde al método simple descrito.

2. Los ensayos de PCR para la detección de VHC y los ensayos de cuantificación de VHC tienen clínicamente objetivos diferentes, que se traducen en requisitos de sensibilidad en el primero y precisión en el segundo, por lo cual los métodos descritos por los autores serían de uso en investigación pero de poca aplicación clínica de rutina. Esto que parece tan obvio, muchas veces no se considera a la hora de elegir el método con el cual el clínico va a evaluar a sus pacientes. Con el aumento de laboratorios que realizan exámenes de biología molecular, con diferentes metodologías y sensibilidades, los errores diagnósticos y de interpretación que nos ha tocado resolver son cada vez más frecuentes.

3. La detección de RNA de VHC confirma o descarta una infección activa, por lo cual se requiere la mayor sensibilidad. Un 10% de las muestras estudiadas en nuestro laboratorio (alrededor de 1.500 pacientes estudiados y 5.000 exámenes realizados) tienen niveles bajos o muy bajos de RNA (< 2.000 copias RNA/ml) como son aquellos pacientes con una infección de corta evolución, respondedores a tratamiento antiviral, hemodializados con primoinfección, post trasplantados recientes, etc.

4. Los ensayos de cuantificación de VHC tienen su máxima indicación en la monitorización del tratamiento antiviral, donde se necesita evaluar con la mayor precisión y exactitud la presencia de cambios significativos de la viremia para decidir conductas intratratamiento.

Al respecto, la cuantificación de un amplificado de PCR debe ser realizada en condiciones estrictas. No basta realizar diluciones de muestras conocidas, sino que se requiere además certificar que la muestra en estudio haya tenido las mismas condiciones y eficiencia de amplificación que un control interno conocido (estándar interno). Todos los ensayos de cuantificación por PCR lo han incorporado.

5. Si bien nos parece muy bueno que se estén desarrollando nuevas alternativas para el estudio de la infección por VHC, no concordamos con los autores en que la metodología propuesta sea simple, rápida y fácil de implementar en un laboratorio de rutina ya que un resultado de "nested PCR" y su genotipificación se obtiene en menos de 12 h, el trabajo con geles de agarosa es menos engorroso y de menor tiempo de corrida, el bromuro de etidio es lo suficientemente sensible para un "nested PCR" y un RFLP entrega un resultado rápido sin tener que enfrentar la muestra con diferentes patrones por separado.

6. Finalmente, consideramos que hubiera sido de interés determinar la concordancia real de los métodos propuestos, correlacionando los resultados con las características clinicopatológicas de los casos estudiados. Para ello, sería importante conocer los resultados con heteroduplexes de todas las muestras positivas estudiadas así como todos los resultados de semicuantificación comparados con técnicas de cuantificación de mayor sensibilidad que un b-DNA (>200.000 copias de RNA/ml). Por último, no queda claro en la metodología descrita cómo definieron los autores los genotipos encontrados por secuenciación por cuanto la Tabla presentada sólo compara homologías entre diferentes muestras.

 

Drs. Javier Brahm B, Marta Velasco R, Gabriela Muñoz G y Mauricio Venegas S (BQ)
Centro de Gastroenterología, Departamento de Medicina, Hospital Clínico de la Universidad de Chile

REFERENCIAS

1. BARRO A, VÁSQUEZ M, SPENCER E. Uso de una reacción de polimerasa en cadena simple combinada con un ensayo de movilidad de heteroduplexes en la caracterización de la región 5’ no codificante del virus de la hepatitis C. Rev Méd Chile 1999; 127: 783-90.

2. MUÑOZ G, VELASCO M, THIERS V ET AL. Prevalencia y genotipos del virus hepatitis C en donantes de sangre y pacientes con enfermedad hepática crónica y hepatocarcinoma en población chilena. Rev Méd Chile 1998; 126: 1035-42.

LA CARTA FUE ENVIADA A LOS AUTORES ALUDIDOS, CUYA RÉPLICA ES LA SIGUIENTE:

S r. Editor: Hemos leído la carta enviada por los Drs. Brahm, Velasco, Muñoz y Venegas en referencia a nuestro artículo allí referido. Nos permitimos expresar lo siguiente:

1. La investigación realizada en nuestro laboratorio bajo ningún aspecto estuvo enmarcada dentro de algún proyecto financiado por Inserm (Francia). El único financiamiento comprometido fue de la Dirección de Investigación de la Universidad de Santiago de Chile, como consta en los agradecimientos del artículo.

2. Todas las iniciativas presentadas con el fin de obtener financiamiento por el convenio Inserm-Conicyt fueron hechas en conjunto con la Dra. Eugenia Lamas. Lamentablemente estos proyectos no fueron nunca financiados, por causas ajenas a cualquiera de los coautores del presente artículo.

3. El Dr. Mario Barro cuenta con experiencia anterior por haber estado trabajando en el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología en La Habana, Cuba, durante 3 años. En este período publicó en diferentes congresos y revistas los siguientes trabajos: (la carta explicita 7 presentaciones en Congresos, 1 Tesis de Pregrado y 2 publicaciones en "Biotecnología Aplicada").

Como se puede concluir, la implementación de la técnica estuvo basada en la experiencia previa del Dr. Barro, y en las facilidades de nuestro laboratorio, que permiten llevar a cabo proyectos de virología molecular, incluyendo entre otras cosas el desarrollo de técnicas diagnósticas. Estos argumentos permiten confirmar la total autosuficiencia e independencia técnica de nuestro laboratorio. Es necesario indicar que no se requirió para la realización de este trabajo de aporte técnico alguno de los autores de la mencionada carta, razón por la cual no mencionamos sus nombres en los agradecimientos.

3. Como consta en los agradecimientos del artículo, se deja expresa constancia que parte de los sueros usados en el trabajo fueron efectivamente los mencionados en la carta adjunta, lo que nos llevó a manifestar en el artículo nuesto agradecimiento en la persona de la Dra. Marta Velasco. Es importante destacar que en el trabajo descrito se hizo, además, uso de otros sueros, como se puede concluir de la lectura del artículo. De acuerdo entonces a las prácticas habituales se agradeció la donación y selección de los sueros, en las cuales participaron los Drs. Marta Velasco y Eliecer Villagra.

4. La referencia de Brechot et al (referencia 2 de nuestro artículo), se menciona en el sentido del uso del PCR-anidado en forma genérica como sistema de identificación. Efectivamente la Dra. Muñoz usa un PCR de este tipo, es cierto que pueden existir diferencias como las mencionadas, pero en ningún caso se altera el uso general del mencionado método, por lo que la referencia es absolutamente válida.

5. Respecto a los comentarios específicos mencionados en la carta:

Comentario 1: Efectivamente hay un error, posiblemente nuestro de transcripción, en la mencionada afirmación. Observación que agradecemos muy sinceramente.

Comentario 2: Respecto al objetivo clínico y rapidez del método, no concordarnos con la conclusión de nuestros corresponsales, puesto que parece obvio que un método en el cual sólo se realiza una amplificación y no dos como en el caso del PCR anidado de la Dra. Muñoz, sea efectivamente más rápido. Sobre la sensibilldad del método propuesto debe considerarse que la tinción de geles con nitrato de plata permite una sensibilidad entre 10 a 50 veces mayor que la tinción con bromuro de etidio. Es interesante destacar que el uso masivo de bromuro de etidio puede ser peligroso, ya que es un reactivo cancerígeno, lo que lo hace poco aconsejable para uso rutinario en un laboratorio de diagnóstico. La otra ventaja del método desarrollado en el artículo es que los geles de poliacrilamida pueden ser fácilmente preservados como testigo, ya que se pueden secar en forma muy sencilla.

En este contexto, también es importante mencionar que nuestro trabajo no tiene como objetivo cambiar los métodos que los distintos laboratorios emplean, ya que sería presumido y alejado del propósito que tiene un trabajo científico. Sí estamos mostrando una alternativa, que en nuestras manos tiene menos posibilidades de error que el PCR anidado cuando se aplica en forma rutinaria. Es sabido que la segunda etapa de PCR usando partidores internos (etapa de anidamiento) requiere de un cuidado especial que muchas veces no es posible disponer en un laboratorio de diagnóstico rutinario. Son estas enormes posibilidades de contaminación las que hacen difícil manejar el sistema diagnóstico, como menciona la Dra. Muñoz. Es indudable, además, que cada laboratorio debe tener la seriedad necesaria para manejar apropiadamente sus métodos, incluyendo los controles adecuados.

Comentario 3: No nos interesa ni compete discutir resultados anteriores; aquellos que son mencionados tienen como propósito que el lector saque sus propias conclusiones. Sólo queremos dejar en claro que en estudios de "doble ciego" realizados en nuestro laboratorio con las muestras entregadas por el Dr. Villagra, el laboratorio BiosChile y las pocas muestras obtenidas de la Dra. Velasco, obtuvimos resultados congruentes con los previamente comunicados. Es interesante destacar que en este grupo de pacientes había muestras provenientes de pacientes con hepatitis aguda y estaban en el principio de su infección. Estos resultados aún no publicados por nosotros y fruto de una colaboración con el Dr. Villagra, muestran que es posible detectar, en pacientes aún sin respuesta inmune al virus y clínicamente agudos, el RNA del virus hepatitis C a través de nuestro ensayo, lo que sugiere que su sensibilidad es mayor que las técnicas rutinarias.

Comentario 4: La cuantificación "estricta" de la carga viral es un tema de discusión en la comunidad científica y según lo observado en la literatura el diagnóstico por medio del "branched-DNA" es el método de elección actual para determinar carga viral. De allí nuestro cuidadoso término de "evaluación semicuantitativa de la carga viral". Si nuestros corresponsales no le encuentran ninguna utilidad a este estudio, es una opinión personal que el lector puede tener en cuenta. Sin embargo, nosotros creemos que la utilidad del método es permitir, entre otras cosas, caracterizar diferentes cepas virales, determinando en forma simple el genotipo. El lector comprenderá que son dos objetivos diferentes, por lo que esperamos se pueda obtener información molecular del virus que permita orientar las decisiones clínicas.

Comentario 5: Nunca pensamos en medir el tiempo de ejecución de nuestra técnica, pero nos permitimos dudar de que una metodología que envuelve dos reacciones de PCR, una digestión enzimática y dos electroforesis de agarosa (una para ver las muestras positivas y otra para la visualización de la digestión) sea más rápida que otra donde con un único PCR y una sencilla reacción de hibridación se permite obtener un resultado reproducible, utilizando minigeles de acrilamida con tiempos de corrida de una hora cada uno. En lo referente a la estrictez que se requiere para hacer un diagnóstico del genotipo de un aislado, es claro que solamente el "secuenciamiento" del fragmento amplificado permite una absoluta certeza del genotipo descrito. Sin embargo, la formación del heteroduplex es la técnica contigua en cuanto a sensibilidad, no sólo para genotipos conocidos sino para detectar nuevas variantes. En este momento es importante mencionar que en el "XI International Congress of Virology (Sidney)", realizado entre el 9 y 13 de agosto de 1999, aparece junto a nuestro trabajo, otro, donde también utilizan el heteroduplex como herramienta de genotipificación ("Genotyping Hepatitis C virus using heteroduplex mobility assays: correlation with nucleotide sequencing" Peter White and William Rawlinson. Prince of Wales Hospital, Virology Division, Randwick, Australia).

Comentario 6: Lamentamos mucho que los autores de la carta precedente no hayan hecho una cuidadosa lectura del artículo, ya que en la Tabla 2 se compara la homología de secuencia de los genotipos identificados; la realización de dicho estudio implica la secuenciación del fragmento amplificado. Como último punto de este comentario, las muestras secuenciadas fueron además comparadas con algunas en las que contábamos con la cuantificación hecha por la técnica de "branch-DNA", como consta en la Tabla 1 de nuestro artículo.

Drs. Mario Barro, Mónica Vásquez y Eugenio Spencer
Laboratorio de Virología, Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Química y Biología, Universidad de Santiago de Chile

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