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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.128 n.5 Santiago mayo 2000

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872000000500006 

Caracterización clínico - molecular
de la enfermedad granulomatosa
crónica autosómica recesiva causada
por déficit de p47-phox

Clinical and Molecular
Characterization af autosomal
recessive chronic granulomatous
disease caused by p47-phox deficiency

Mónica Cornejo De L, Juan A. López Q1, Sara Navarro V1,
Diana García de O, Pablo J Patiño G.


Background: The cytosolic protein p47-phox (phagocyte oxidase) is one of the essential components of the superoxide generating system in phagocytes and its defect causes approximately 30% of the chronic granulomatous disease (CGD) cases. Aim: Two patients were studied, belonging to the same family, without a consanguinous background, in which deficiency or absence of superoxide generation was found together with recurrent and severe infections in one case and benign infections in the second. Methods: The presence of gp91-, p67- and p47-phox in patients and controls was determined by Western Blot analysis of granulocytes. Sequencing of PCR amplified DNA was performed by an enzimatic method. Results: Western Blot analysis showed normal expression of gp91 and p67 and absence of p47-phox. The molecular genetic study demonstrated a homocygotic dinucleotide GT (GT) deletion at the beginning of exon 2 of the p47-phox gene. The same mutation has been found in European, American and Japanese patients. Conclusions: The molecular characterization of this pathology done for the first time in Chile is important for diagnostic classification, patient prognosis, and adequate genetic advice and a possible future therapy. (Rev Méd Chile 2000; 128: 490-8).
(Key-Words: DNA mutational analysis; Granulomatous disease, chronic; NADPH oxidase; Respiratory burst)

Recibido el 26 de noviembre, 1999. Aceptado en versión corregida el 25 de enero, 2000.
Cátedra de Inmunología, Escuela de Medicina, Universidad de Valparaíso - Chile
Grupo de Inmunodeficiencias Primarias, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia -
Colombia
1 Biólogo

La enfermedad granulomatosa crónica (EGC) es una inmunodeficiencia caracterizada por infecciones severas recurrentes producidas por bacterias y hongos con formación de granulomas, debido a la incapacidad de los fagocitos (neutrófilos, eosinófilos, monocitos y macrófagos) para generar compuestos reactivos de oxígeno, necesarios para la muerte intracelular de los microorganismos fagocitados.

Los neutrófilos tienen un rol fundamental en los mecanismos de defensa contra patógenos microbianos. Son las primeras células que llegan al sitio de la infección y tienen la capacidad innata de ingerir y destruir microorganismos. La destrucción de los patógenos es mediada por 2 procesos: 1) la activación del sistema enzimático NADPH oxidasa permite la producción de metabolitos tóxicos del oxígeno durante el fenómeno conocido como estallido respiratorio y 2) la fusión de los gránulos intracelulares con el fagosoma (vesícula que contiene los microorganismos ingeridos) y liberación de su contenido en esta vesícula.

La NADPH oxidasa es un complejo enzimático localizado en la membrana plasmática de los fagocitos que toma electrones del NADPH en el citosol y los dona a oxígeno molecular al otro lado de la membrana, generando anión superóxido (O2-). Reacciones posteriores producen peróxido de hidrógeno (H2O2) ácido hipocloroso (HOCl) y otros productos microbicidas (OH, 1O2) ya sea en el espacio extracelular o en la vacuola fagocítica ejerciendo efectos tóxicos sobre los organismos ingeridos o microbios extracelulares. En los fagocitos en reposo los componentes de la NADPH oxidasa se encuentran localizados en diferentes compartimentos de la célula lo cual evita su activación. La estimulación del fagocito por unión de microorganismos opsonizados a receptores en la superficie conduce al ensamblaje del complejo enzimático activo y a la inducción del estallido respiratorio en estas células.

Se han identificado al menos 5 componentes de la oxidasa: 2 unidos a la membrana plasmática: gp91-phox (phagocyte oxidase) y p22-phox que juntos forman el citocromo b558 y tres componentes citosólicos p47-phox, p67-phox y p40-phox. Esteúltimo no es un componente esencial de la oxidasa y pareciera tener un rol regulatorio. Finalmente existen otras 2 proteínas que participan en la activación del sistema aunque no son componentes exclusivos de éste: Rap1A la que se encuentra asociada al citocromo b558 y posiblemente regula la desactivación de la NADPH oxidasa y Rac2, que tiene amplia distribución tisular y tiene un papel en funciones celulares como transporte vesicular y dinámica del citoesqueleto. La activación del sistema requiere de la traslocación de p47-phox, p67-phox y Rac2 a la membrana celular donde interactúa con el citrocromo b558 permitiendo la activación de la oxidasa1,2.

Una mutación en cuatro de las subunidades phox puede causar la EGC. El 60-65% de los casos se debe a mutaciones en el gen de la gp91-phox (EGC ligada al X), alrededor del 30% se producen por deficiencia de p47-phox y 2-3% (cada una) a deficiencia de p22-phox o p67-phox (formas autosómicas recesivas). Los pacientes con deficiencia de p47-phox y p67-phox descritos hasta el momento no expresan la proteína, sin embargo, en algunos casos originados por mutaciones puntuales en los genes de la gp91-phox o p22-phox pueden producir cantidades normales de una proteína no funcional3.

En este artículo se presenta el análisis clínico y molecular de 2 pacientes chilenos con una EGC autosómica recesiva por deficiencia de p47-phox. Ambos pacientes pertenecen a la misma familia, en la cual no había historia de consanguineidad. El estudio genético molecular evidenció una delección homocigota del dinucleótido GT (GT) al inicio del exón 2 del gen de la p47-phox.

PACIENTES Y MÉTODOS

Caso 1. Varón de 15 años, hijo menor de padres sanos no consanguíneos (Figura 1). A partir de los 31/2 años presentó impétigo y abscesos a repetición (1-2 veces/año) en regiones axilar, cervical, pared abdominal y extremidades, lo cual requirió de tratamiento antibiótico y quirúrgico en varias ocasiones. A los 8 años de edad neumonía del lóbulo superior derecho sugerente de etiología estafilocóccica. A los 10 años presentó absceso hepático estafilocóccico que necesitó drenaje quirúrgico. Luego de esta infección fue referido para estudio inmunológico. La reacción de NBT demostró que sólo 15% de los granulocitos estimulados con PMA eran positivos comparado con 100% de granulocitos de su madre y 93% de un control no relacionado. Los niveles de IgG, A, M y E, CH50, C3 y C4 fueron normales. Con el diagnóstico de EGC se inició una terapia profiláctica con sulfametoxazole - trimetoprim (1 tableta/día), lo cual permitió una disminución notable de los episodios infecciosos. Desde esa fecha sólo ha presentado episodios ocasionales de blefaroconjutivitis con sobreinfección estafilocóccica.

FIGURA 1. Arbol genealógico de la familia de 2 pacientes con EGC. La flecha indica Caso 1. El Caso 2 corresponde al hermano 5. La reducción de NBT en la madre y en los hermanos 1,2,4 y 6 fue normal. En el hermano 3 de los pacientes y 6 hermanos de la madre clínicamente sanos no se efectuó prueba de NBT.

Caso 2. Varón de 21 años, es el quinto hijo de la misma familia. Al momento de efectuarse el diagnóstico de su hermano se encontraba absolutamente asintomático. Elúnico antecedente que refiere es una hospitalización a los 7 meses de vida por diarrea y neumopatía aguda. A los 16 años presentó episodios de abscesos en extremidad inferior y en cara. A los 19 y 21 años consultó por abscesos cervicales que requirieron drenaje quirúrgico y terapia antibiótica, motivo por el cual fue enviado para estudio inmunológico.

Prueba de nitroazul de tetrazolium (Nitroblue tetrazolium - NBT). Se efectuó en granulocitos adheridos a portaobjetos utilizando PMA (Phorbol Myristato Acetato, Sigma Chemical Co., St. Louis MO) como activador de las células; la generación de radicales de oxígeno se evidenció por medio de la reducción del colorante NBT (Sigma) con la consecuente formación de precipitados de formazan4. Por cada ensayo se estudió un control normal.

Separación de leucocitos a partir de sangre venosa periférica. La sangre venosa periférica se sedimentó con Dextrán al 6% (Sigma). El sobrenadante rico en leucocitos se centrifugó a 335 x g/12 min/4ºC. Luego de la lisis de los eritrocitos los granulocitos se separaron de los mononucleares por un gradiente de Ficoll - hipaque (Sigma) centrifugando a 400 x g/30 min/4ºC. Las células mononucleares se recuperaron para realizar la extracción de DNA y los neutrófilos se lavaron por centrifugación y se resuspendieron en PBS. La pureza y viabilidad fueron determinadas por tinción con violeta de genciana y azul de tripano, respectivamente5,6.

Generación de anión superóxido. Para determinar la producción de anión superóxido 6,6 x 106 polimorfonucleares de pacientes y controles preincubados con suero humano inactivado al 10% se estimularon con PMA (5 µg/ml). Como indicador de dicha producción se cuantificó la reducción de citrocromo C (0,066 mM, Sigma) en presencia o ausencia de superóxido dismutasa (0,032 mg/ml, Sigma). La reacción se realizó a 37ºC durante 15 min7. El sobrenadante se colocó por duplicado en placas de ELISA y la absorbancia se determinó en lector de ELISA con un filtro 550 mm. Los resultados se expresaron como nmoles de citocromo C reducido/1 x 106 PMN/30 min. Además en el caso 1 se realizó una cinética de producción de anión superóxido utilizando un espectrofotómetro Biochrom 4060 UV (Pharmacia), expresándose el resultado del citocromo C reducido en nmol de O2-/min/107 células.

Inmunodetección (Western blot) de la p47-phox en neutrófilos. Con el fin de identificar cual era el componente defectuoso de la NADPH oxidasa se realizó un Western Blot para evaluar la presencia de las proteínas que constituyen el mencionado sistema. Los neutrófilos fueron resuspendidos a una concentración final de 5 x 107 células/ml y tratados con 2,5 mM de diisopropilfluorofosfato (DFP, Sigma) durante 10 min/4ºC. Luego fueron lavados con PBS a 335 x g/10 min/4ºC, se resuspendieron en tampón de relajación (10 mM PIPES, 100 mM KCl, 3 mM MgCl2) y se lisaron por medio de sonicación durante 5 segundos con una intensidad de 3 watt (Branson, Dalbury, CT). El producto de la sonicación fue centrifugado a 43.000 x g/20 min/4ºC y sometido a una electroforesis en condiciones reductoras en un gel con un gradiente de poliacrilamida de 4 a 15% (Miniprotean II, BioRad, Richmond, CA). Las proteínas fueron transferidas eléctricamente a una membrana de nitrocelulosa de 0,45 µm (BioRad). Las membranas se trataron con una solución de bloqueo (10 mM de HEPES, 0,5 M de NaCl, 3% de albúmina sérica bovina; 0,2% de azida de sodio y 10% de suero de cabra) durante una hora a temperatura ambiente con agitación. Después se incubaron con un anticuerpo policlonal de conejo anti-p47-phox, durante toda la noche a temperatura ambiente con agitación. Luego se añadió IgG de cabra anti-Fc de conejo marcado con fosfatasa alcalina (Sigma), se incubó una hora a temperatura ambiente con agitación. Los complejos de anticuerpos formados sobre la membrana fueron revelados por medio del sistema BCIP/NBT (Solución premezclada de 5 bromo-4 cloro-3 indolyl fosfato y nitroazul de tetrazolium como sustrato productor de color al actuar sobre fosfatasa alcalina, BioRad)8.

Extracción de ADN genómico. El ADN fue extraído a partir de las células mononucleares con el método de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y luego precipitado con acetato de amonio y etanol absoluto. La cantidad de ADN se determinó por medio de lectura espectrofotométrica a 260 nm y la pureza por la relación entre los valores a 260/280 nm.

Amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del ADN que corresponde al gen p47-phox. Se conoce que la mayor parte de los pacientes con deficiencia de la p47-phox presentan una delección homocigótica del dinucleótido GT en el comienzo del exón 2 de este gen3. Por lo tanto, con el fin de definir si esta mutación estaba presente en nuestros pacientes se amplificó por medio de la técnica de PCR el exón 2 de la p47-phox a partir de ADN genómico. La reacción de amplificación con las muestras de pacientes y controles se realizó en un volumen final de 50 µl9. La reacción contenía tampón de PCR 10X (100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 500 mM KCl, 1,5 mM MgCl2) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 10 mM de la mezcla de dNTPs (200 µM concentración final) (Pharmacia, Piscataway, NJ), 2,64 ng/µl (concentración final) de cada oligonucleótido, Taq polimerasa (5 U/µl) (Boehringer Mannheim), 0,5 µg del respectivo ADN genómico y se completó con agua MQ. La reacción de amplificación se realizó en un termociclador GeneAmp 9600 (Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT) en las siguientes condiciones: 95ºC/2, 30 ciclos de 96ºC/5 seg, 65ºC/15 seg y 72ºC/30 seg seguido por un ciclo de 72ºC/7 min. Los oligonucleótidos para la amplificación y el secuenciamiento de la p47-phox fueron diseñados de acuerdo a la secuencia descrita previamente10, utilizando el programa Oligoâ Software (National Biosciencies, Inc., Plymouth, MN).

Reacción del secuenciamiento. Las muestras de DNA amplificadas por PCR fueron secuenciadas con el método enzimático de incorporación de dideoxinucleótidos utilizando un estuche comercial (Thermo Sequenase Cycle Sequencing Kit, Amersham Life Science, Arlington Heights, IL)11. Para cada fragmento secuenciado, se marcó un oligonucleótido (sentido o antisentido) de la siguiente manera: tampón de quinasa 10X, 7,5 ng/µl (concentración final) del primer seleccionado, T4 polinucleótido quinasa 0,45 U/µl (concentración final), g32P-ATP (actividad específica de 3000Ci/mmol, 10mCi/ml Amersham) completando con agua MQ. La reacción se incubó a 37ºC/30 min luego se inactivó a 90ºC/2 min. Luego se preparó la mezcla de secuenciamiento con tampón de reacción 10X (260 mM de Tris-HCl pH 9,5, 65 mM de MgCl2), Thermo Sequenasa ADN polimerasa (4U/µl), el oligonucleótido marcado y agua MQ a un volumen de 17,5 µl. Posteriormente 4 µl de esta mezcla fueron adicionados a cada uno de los tubos de PCR que contenían 4 µl de la mezcla apropiada de deoxi/dideoxinuclótidos. La reacción de amplificación se realizó en las mismas condiciones descritas para la PCR. Porúltimo, a cada muestra se le adicionaron 3 µl de solución de parada del estuche (10 mM de NaOH, 95% formamida, azul de bromofenol al 0,05%, xylen cyanol al 0,05%).

Los fragmentos generados en la reacción de secuenciamiento fueron desnaturalizados por calor y sometidos a electroforesis en poliacrilamida al 8% en condiciones denaturantes (Urea/7M en TBE 1X). El gel se retiró con papel filtro y se secó al vacío a 80ºC/1h. Finalmente se hizo una autorradiografía a -70ºC toda la noche con una película Bio Max "Kodak"12

RESULTADOS

La reducción de NBT en granulocitos estimulados con PMA se encontró severamente disminuida en el Caso 1 (15%), ausente en el Caso 2 y fue normal (100%) en la madre y 4 hermanos sanos (2 hombres y 2 mujeres).

A diferencia de los controles, los neutrófilos de los pacientes no produjeron anión superóxido (Caso 1) o la producción fue mínima (0,86 nanomol cit C reducido/1 x 106 PMN/15' del Caso 2 vs 9,4 del control normal) en respuesta a la estimulación con PMA. El Western Blot para los diferentes componentes del sistema NADPH oxidasa realizado a partir de los granulocitos del Caso 1 demostró una expresión normal de gp91-phox y p67-phox, mientras se evidenció una total ausencia de p47-phox (Caso 1, Figura 2). De acuerdo con los resultados obtenidos en la inmunodetección de la p47-phox y conociendo que la mayoría de los pacientes con deficiencia de esta proteína presentan una delección homocigótica del dinucleótido GT al inicio del exón 2 se amplificó y analizó por secuenciamiento enzimático específicamente esta región del ADN, demostrándose que ambos pacientes presentaban una delección homocigótica del dinucleótido GT (GT) al inicio del exón 2 (Caso 1 Figura 3). Estos resultados confirman una EGC autosómica recesiva por déficit de p47-phox debido a una mutación GT.

FIGURA 2. Inmunodetección de la p47-phox en el citoplasma de neutrófilos de 2 pacientes con EGC (P1 y P2) y de 2 individuos normales (N1 y N2). La ausencia de la banda correspondiente a la p47-phox en P2 (Caso 1) confirma el diagnóstico de EGC por deficiencia de esta proteína. La columna PM corresponde a los estándares de peso molecular.

FIGURA 3. Análisis de la secuencia, a partir de DNA genómico, del exón 2 del gen de la p47-phox en un paciente deficiente (P2) para este componente del sistema NADPH oxidasa y en un individuo normal (N1). En el paciente se observa una deleción homocigótica del dinucleótido GT (GT) al inicio del exón 2, mientras que en el sujeto normal se aprecia una doble secuencia en este mismo exón, lo cual se debe a la presencia del seudogen (GT) superpuesto al gen normal.

DISCUSIÓN

En el presente artículo se describe la caracterización clínica, bioquímica y molecular de dos pacientes con EGC en los cuales se demostró que la mutación responsable del defecto era una delección del dinucleótido GT al inicio del exón 2 del gen de la p47-phox. A pesar que ambos pacientes son hermanos presentan una evolución clínica diferente. El paciente 1 refiere infecciones recurrentes desde los primeros años de vida mientras que el paciente 2 sólo ha presentado abscesos cutáneos desde la adolescencia.

La EGC es una inmunodeficiencia caracterizada clínicamente por infecciones recurrentes bacterianas y por hongos que afectan principalmente ganglios linfáticos, tejidos subcutáneos, pulmones, hígado y huesos. Se pueden presentar además manifestaciones gastrointestinales como diarrea, abscesos perianales y respuesta inflamatoria anormal que conducen a la formación de granulomas que pueden producir obstrucción de vías gastrointestinal y tracto genitourinario. Los patógenos más comunes son gérmenes catalasa positivos tales como el Estafilococo Aureus y Aspergillus spp. Otras infecciones frecuentes incluyen Serratia marcescens, Pseudomona cepacia, Klebsiella, Chromobacterium Violaceum, E. coli y Nocardia. Sin embargo, hay destrucción normal de microorganismos que producen cantidades significativas de H2O2 (por ejemplo Neumococo), que permiten reconstituir la actividad de sistema mieloperoxidasa - H2O2.

La incidencia de EGC se estima en aproximadamente 1/250.000 individuos sin preferencia étnica. Mientras la forma ligada al sexo afecta sólo varones, la forma autosómica recesiva afecta hombres y mujeres por igual1.

La prueba de reducción del NBT por fagocitos activados es el método universalmente aceptado para definir la normalidad en la producción de anión superóxido. La detección de defectos parciales requiere incluir métodos más sensibles, como la medición directa o por quimioluminiscencia de generación de anión superóxido. El uso de citometría de flujo permite efectuar una medición cuantitativa.

El curso clínico de la enfermedad es generalmente más severo en la deficiencia del componente gp91 que en aquellos con defecto de la p47. La edad de inicio de los síntomas en gp91 es significativamente menor (<1 año), el diagnóstico más precoz (4 vs 9 años) y el número de hospitalizaciones es el doble que p4713.

Si bien es inusual el diagnóstico de EGC en un adulto como el caso 2 de este estudio, se han reportado otros casos, uno de los cuales presentó la primera infección seria a los 69 años de edad (sepsis por Pseudomona Cepacia)14. Este caso demostró ser una variante rara de EGC ligada a X con cantidades normales de citocromo b558 pero marcada reducción de actividad NADPH oxidasa. La ausencia de síntomas previos en este paciente podría deberse al rol de otros mecanismos microbicidas independiente del O2 y de citoquinas que activan al fagocito.

En un estudio reciente15 en el que se midió la actividad de la oxidasa por citometría de flujo, se encontró una diferencia significativa en la producción de peróxido en neutrófilos de pacientes con EGC ligada a X y autosómica recesiva por deficiencia de p47-phox, lo que indicaría que la mutación de la p47-phox no impide completamente la oxidación a pesar del severo defecto en la generación de superóxido. Estas evidencias podrían explicar las notables diferencias en el curso clínico de nuestros casos, en las que destaca la edad de inicio (3 y 16 años) y la severidad de las infecciones para el Caso 1 en comparación con el curso benigno del Caso 2. Una de las conclusiones más importantes del presente trabajo es que el diagnóstico de EGC debe considerarse en personas mayores que presentan una infección sugerente de defecto en la función de las células fagocíticas. Es probable que el uso generalizado de terapia antibiótica, que es efectivo en los pacientes con infecciones menos severas, sea también una causa que retarde el diagnóstico de EGC por déficit de p47-phox16.

La mutación encontrada en estos pacientes (delección homocigota del dinucleótido GT en el exón 2) es la misma descrita en pacientes con deficiencia de p47-phox en Estados Unidos, Inglaterra y Japón16,17 y parece ser responsable de la mayoría de los casos descritos en el mundo, a diferencia de la deficiencia de gp91-, p22- y p67-phox, que pueden deberse a gran variedad de mutaciones. La alta frecuencia de esta mutación en pacientes con deficiencia de p47-phox no relacionados se explica por la presencia de un seudogen altamente homólogo, el cual por medio de fenómenos de recombinación meiótica hace que el gen normal sea eliminado o convertido en la secuencia anormal18.

La morbilidad y mortalidad por infecciones de estos pacientes es elevada (2 muertes/ año/100 pacientes en el NIH)19 y la sobrevida escasa en mayores de 40 años. A futuro se espera contar con terapia génica, la que ha efectuado grandes progresos, encontrándose en la actualidad ensayos clínicos en fase 1 para déficit de p47-phox19. Es importante señalar que la madre y 4 hermanos de nuestros pacientes demostraron una actividad normal de NBT, lo que es esperable en la deficiencia de p47-phox.

Los defectos de los fagocitos representan el 9% de 1428 casos notificados al Registro Latino Americano de IDP20. En Chile se encuentran notificados a Noviembre de 1999, 16 casos de EGC de un total de 211 casos de IDP (7,6%). De nuestro conocimiento, ésta es la primera familia chilena en que se ha efectuado diagnóstico molecular de EGC. La caracterización molecular de esta enfermedad es importante para la clasificación diagnóstica, lo cual permite entregar un pronóstico al paciente, un adecuado consejo genético y una eventual terapia futura.

Correspondencia a: Mónica Cornejo De Luigi, Escuela de Medicina, Universidad de Valparaíso. Hontaneda 2653, Valparaíso, Chile. Fax 56-32-507321. e-mail: monica.cornejo@uv.cl

Agradecimeintos: Este estudio ha sido posible gracias al programa colaborativo del Grupo Latinoamericano de Inmunodeficiencias Primarias (LAGID) y al Convenio de Cooperación establecido entre la Universidad de Valparaíso - Chile y la Universidad de Antioquia - Colombia.

Un registro de las Inmunodeficiencias Primarias (IDP) se encuentra abierto en Chile y Latinoamérica con el objeto de conocer la incidencia de estas enfermedades, desarrollar criterios diagnósticos y terapéuticos, compartir metodología de apoyo al diagnóstico y facilitar el desarrollo de la investigación clínica en esta área. Cualquier clínico que desee participar en este registro, puede comunicarse con el Comité de Inmunodeficiencias Primarias de la Sociedad Chilena de Alergia e Inmunología.

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