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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.128 n.7 Santiago jul. 2000

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872000000700008 

Prevalencia de Chlamydia trachomatis
en conjuntivitis neonatal determinada
mediante las técnicas de inmuno-
fluorescencia y amplificación génica

Indirect fluorescence and genic
amplification for the determination of
Chlamydia trachomatis prevalence in
neonatal conjunctivitis

Carolina Valencia O, Valeria Prado J, Maritza Ríos1,
María Antonieta Cruz2, Jean Jacques Pilorget

 

Backgrund: Chlamydia trachomatis is one of the most common identifiable infectious agents in neonatal conjunctivitis. It also causes pneumonitis, that is preceded by conjunctivitis in one third of cases. Aim: To asses the prevalence of Chlamydia trachomatis in newborns with conjunctivitis. Patients and methods: In 162 newborns, coming from 14 Primary Health Centers from Santiago de Chile, C. trachomatis was detected by indirect fluorescence and two polymerase chain reaction (PCR 1 and 2), wich amplified different sequences from the common endogenous plasmid. Those patients with positive indirect fluorescence and PCR 2 were definedas infected: Results: The prevalence of C. trachomatis was 8%, and the distribution of the positive cases was similar in the different Health Centers. Other isolates were: S. aureus (9.8%), S. pneumoniae (8%), S. viridans (6.2%) y H. influenzae (5.5%). Conclusions: The prevalence of C. trachomatis in neonatal conjunctivitis in Chile is similar to that of developed countries. Therefore, C. trachomatis should be considered in the election of antimicrobials for the treatment of neonatal conjunctivitis, to avoid ocular and respiratory complications. (Rev Méd Chile 2000; 128: 758-65).
(Key Words: Antibiotics; Chlamydia infections; Chlamydia trachomatis).

Recibido el 27 de julio, 1999. Aceptado en versión corregida el 28 de mayo, 2000. Instituto
de Ciencias Biomédicas, Programa de Microbiología, Unidad de Microbiología Oriente.
Universidad de Chile.
Financiamiento: Programa de Microbiología Oriente Universidad de Chile y Laboratorios
Abbott Chile.
1 Bioquímico PhD
2 Tecnólogo Médico

La conjuntivitis es uno de los cuadros infecciosos más frecuentes del período neonatal, siendo C. trachomatis uno de los agentes causales más importantes1-4, con una incidencia en USA de 14 a 44 por 1000 nacidos vivos.

Si bien la conjuntivitis neonatal por C. trachomatis puede resolverse en forma espontánea entre los 3 a 12 meses de vida5, la infección subclínica o moderada puede persistir durante años6, describiéndose secuelas y complicaciones oculares en los pacientes no tratados7-9. Además C. trachomatis es una causa frecuente de neumonitis en el lactante. Este cuadro es precedido en un tercio de los casos por una conjuntivitis por Chlamydia en el período neonatal10.

Se han desarrollado diversos métodos de diagnóstico para C. trachomatis, entre los que destacan el cultivo celular11,12, inmunofluorescencia directa (IFD)13,14, amplificación de DNA15,16 y el método de ELISA17,18.

Entre las técnicas descritas, la IFD ha demostrado un excelente rendimiento en el diagnóstico de C. trachomatis en diversas muestras, con una sensibilidad y especificidad de hasta 99% en muestras oculares19. Por su parte, la técnica de amplificación de ácidos nucleicos (PCR) ha demostrado también un excelente rendimiento en diversas muestras20,21, existiendo trabajos que avalan su utilidad en conjuntivitis neonatal2,22.

Debido a la escasa información acerca de la participación de este agente en patología ocular en nuestro medio, unido al hecho que la conjuntivitis neonatal por Chlamydia es una entidad de difícil diagnóstico, que no responde al tratamiento con antibióticos de uso habitual23 y que causa importante morbilidad en el período del neonato y lactante, se realizó este estudio con el fin de determinar la prevalencia de este patógeno en conjuntivitis del neonato mediante las técnicas de PCR e IFD en nuestro medio. Además, se buscaron factores de riesgo asociados a infección, con el fin de orientar al clínico en la búsqueda de este agente en conjuntivitis del recién nacido, y se evaluó el rendimiento de la técnica de PCR como método de diagnóstico en conjuntivitis por Chlamydia trachomatis.

MATERIAL Y MÉTODO

Población: Se estudiaron a 162 neonatos <28 días con cuadro de conjuntivitis aguda purulenta, derivados desde 14 consultorios de Atención Primaria de las áreas Oriente, Sur-Oriente y Sur de Santiago, durante los períodos de mayo a diciembre de 1997, con o sin uso previo de antibióticos. El tamaño muestral fue calculado considerando una prevalencia de 12% según único estudio de prevalencia que existe en nuestro medio24, con una potencia de 90% y un nivel de significancia de 5% (Ver Programa Epi-Info 5.0, 1990). Antes de realizar el estudio se contó con el consentimiento informado de las madres de todos los recién nacidos.

Toma de la muestra: Posterior a limpieza del detritus celular, se realizó torulado, en forma separada en cada ojo, de la conjuntiva palpebral inferior del recién nacido. Las tórulas fueron colocadas en medio de transporte Stuart, sembrándose posteriormente para detección de otras bacterias con técnica semicuantitativa en agar Thayer Martin, Agar Sangre Cordero 5%, Agar Chocolate y Müller Hinton. Con tórula de dracón se realizó torulado del fórnix conjuntival de ambos ojos, realizándose con ella un extendido en un portaobjetos diseñado especialmente para IFD. La tórula luego se introdujo en medio 2SP (Sucrosa-2-Fosfato) y se guardó a -70°C para su posterior procesamiento por PCR.

Detección de Chlamydia trachomatis:

1) Técnica de IFD: Los frotis se fijaron con acetona por 5 min, guardándose a -20°C hasta su procesamiento por IFD. Se realizó tinción de las placas según instrucciones del fabricante del kit de IFD (PROLAB-DIAGNOSTIC), y se observaron a 40x para screening y a 100x para confirmación. Se consideraron positivas para C. trachomatis aquellas muestras con más de 10 corpúsculos elementales por campo mayor.

2) Técnica de PCR: Se utilizaron dos técnicas de PCR, denominadas en forma arbitraria PCR 1 y 2. Ambas utilizaron como blanco de amplificación secuencias del plasmidio endógeno común de C. trachomatis, de 201 y 241 pb. respectivamente. Los partidores utilizados para PCR1 fueron CTP1 (5’-TAGTAACTGCCACTTCATCA-3’) y CTP2 (5’-TTCCCCTTGTAATTCGTTGC-3’) y para PCR2, KL1(5’-TTCGGAGCCGATTACGAAGA-3’) y KL2 (5’-AATCAATGCCCGGATTTGGT-3’). Ambas técnicas de PCR se realizaron utilizando 500 ml de las muestras de 2SP, las que se centrifugaron a 16.000 rpm, resuspendiendo el pellet en 100 ml de Tris-HCl 10 mM. 5 ml de la muestra blanco fueron calentados a 100°C para liberar el DNA, siendo mezclados luego en una solución que contenía 2,5 U de Taq polimerasa, 25 pmol de cada partidor, 1,8 mM de Mg++ y 0,2 mM de cada dNTP en un volumen total de reacción de 50 ml. Los amplificados de ambas PCR se compararon con un marcador de peso molecular (ladder) y un control positivo de ambos amplificados de C. trachomatis serovar L2.

La sensibilidad molecular de ambas PCR se estableció con diluciones de DNA de C. trachomatis serovar L2 de entre 1 ng/ml hasta 0.01 fg/ml.

La especificidad molecular de ambas PCR se determinó utilizando como probable blanco de amplificación DNA de otras bacterias presentes en conjuntiva ocular.

3) Determinación de la prevalencia de C. trachomatis: definición de Gold Standard ampliado. Se definió como paciente infectado aquel con resultados positivos por PCR2 e IFD. Como no infectados se definieron aquellos pacientes con una o ambas de estas pruebas negativas. PCR2 formó parte del gold standard debido a que con esta técnica se obtuvo un mejor resultado en los estudios de sensibilidad molecular.

4) Rendimiento de PCR1: Se estableció el rendimiento de PCR1 (Sensibilidad, Especificidad, VPP, VPN) en comparación a gold standard ampliado previamente definido.

5) Estudios complementarios de discordancia encontrada entre IFD y PCR 1 y 2: Debido a que se detectó una mayor cantidad de muestras positivas por IFD en comparación a ambas PCR, se llevaron a cabo estudios complementarios para explicar esta diferencia. En primer lugar se compararon dos métodos de pretratamiento de las muestras por PCR: extracción con fenol cloroformo y calentamiento a 100°C. Se realizó una dilución seriada de C. trachomatis serovar L2 desde 10-2 hasta 10-8 CE/µl, en forma paralela una serie de estas diluciones fue pretratada con extracción del DNA con fenol-cloroformo, mientras que la otra mitad fue calentada a 100°C. Se comparó la sensibilidad molecular de ambos métodos de pretratamiento mediante la amplificación del DNA de C. trachomatis por las técnicas de PCR 1 y 2. Además se evaluó la posible existencia de falsos negativos por PCR debido a la presencia de sustancias inhibidoras de la Taq-polimerasa, mediante el uso de partidores que amplificaron una secuencia del gen de la b-globina humana.

6) Determinación de factores de riesgo de infección: Se recolectaron antecedentes del neonato, su madre y características de la conjuntivitis con el fin de determinar algún factor de riesgo asociado a infección por C. trachomatis.

7) Detección de otras bacterias: Se investigó la presencia de otras bacterias causantes de conjuntivitis neonatal, considerándose los siguientes aislamientos como patógenos oculares: N. gonorrhoeae, E. coli, S. pneumoniae, S. viridans, H. influenzae, M. catharralis, P. aglommerans, P. aeruginosa y S. aureus, este último con crecimiento moderado a abundante en la placa de cultivo.

RESULTADOS

Características generales de los pacientes: De los 162 neonatos estudiados, 92 fueron hombres (56,7%) y 70 mujeres (43,2%), con una edad promedio de 16 días al momento de la toma de muestra. El 66% de los neonatos fueron de término, y 115 (71%) nacieron por parto normal (Tabla 1). El 20% de las madres de los neonatos eran adolescentes (< 19 años) y 40% eran primigestas (Tabla 2). El 63,5% de los recién nacidos inició sintomatología de conjuntivitis los primeros cuatro días de vida y el 36,4% de ellos presentaban secreción ocular abundante (Tabla 3).




Detección de C. trachomatis: De un total de 162 muestras estudiadas, 13 (8%) resultaron positivas por PCR1, 15 (9,2%) por PCR2 y 26 (16%) por IFD (Tabla 4). La sensibilidad molecular de PCR 1 y 2 fue de 0,1 ng/µl y de 1 fg/µl respectivamente. En relación a la especificidad molecular no se obtuvo amplificación de DNA de otras bacterias de conjuntiva ocular para ninguno de los pares de partidores utilizados en ambas PCR. Según gold standard definido previamente (PCR2 e IFD), 13 pacientes resultaron infectados por C. trachomatis (8%).


Rendimiento PCR1: La sensibilidad y especificidad estadística de PCR1 fue de 85% y 98% respectivamente. Los VPP y VPN fueron de 85% y 98% respectivamente.

Evaluación de la discordancia entre IFD y ambas PCR (1 y 2): el DNA de Chlamydia trachomatis fue detectado por los dos métodos de pretratamiento hasta una dilución de 1 CE/µl utilizando los partidores CTP1/2(PCR1) y hasta 10-4 CE/µl utilizando KL1/2(PCR2). La secuencia del gen de la b-globina humana logró ser amplificada en todos los especímenes estudiados.

Factores de riesgo de infección por C. trachomatis. Los casos positivos se distribuyeron en 9 de los 14 consultorios participantes, y en todas las áreas de salud de Santiago analizadas. No hubo correlación significativa entre infección por Chlamydia y antecedentes de la madre, del niño, ni con características del parto. Tampoco se encontró correlación con características del cuadro de conjuntivitis, excepto con el hecho de presentar un cuadro de secreción ocular abundante (p<0,01) (Tablas 1,2 y 3).

Detección de otras bacterias: en las de muestras de los 162 neonatos los aislamientos más frecuentes encontrados fueron: S. aureus (9,8%), S pneumoniae (8%), S viridans (6,2%) y H influenzae (5,5%) (Tabla 5).


DISCUSIÓN

Chlamydia trachomatis es una de las infecciones transmitidas por vía sexual más prevalentes en el mundo, siendo además importante agente causal de morbilidad en el neonato y en lactantes25. Estudios previos demuestran que entre 22% a 50% de los niños nacidos de una madre infectada desarrollará conjuntivitis de inclusión y entre 10% a 20% una neumonía26.

En nuestro estudio se identificó a Chlamydia trachomatis como agente causal en el 8% del total de los casos (13/162) (Intervalo confianza 95% [3,8-12,2]). La prevalencia de conjuntivitis neonatal por Chlamydia trachomatis encontrada en nuestro análisis se ubica en un valor intermedio entre los observados en países de Europa (1,2%) y lo encontrado en promedio en USA (18,7%)27,28, lo que corrobora que en nuestro medio las cifras de infección son similares a las que se detectan en países desarrollados y se verifica la hipótesis planteada.

Buscando algún factor de riesgo que oriente a una conjuntivitis por Chlamydia trachomatis, observamos que la distribución de los casos positivos en nuestro medio ocurre en la mayor parte de los consultorios estudiados y se presentan en todas las áreas de Santiago analizadas, lo que indica que la infección es ubicua y por lo tanto las estrategias de detección deben ser implementadas en forma universal.

Al analizar las características generales del cuadro de conjuntivitis, se encontró una correlación significativa entre cuadro clínico caracterizado por secreción conjuntival abundante e infección por Chlamydia trachomatis, por lo que este hallazgo debe alertar en forma especial al clínico en la sospecha y búsqueda de este agente frente a un neonato con conjuntivitis. No se encontró correlación entre infección por Chlamydia y antecedentes de la madre, embarazo, parto, características generales del niño, ni otras características del cuadro ocular, por lo que según este análisis la búsqueda de estos antecedentes no aportaría al clínico información útil para sospechar el agente frente a un neonato con conjuntivitis.

Se conoce que la transmisión de la infección al recién nacido ocurre durante su paso por el canal del parto, y que excepcionalmente puede adquirirla en el período perinatal a través de las manos de una persona infectada a los ojos del niño29. En nuestro estudio hubo cuatro niños infectados con Chlamydia trachomatis cuyo parto fue por cesárea sin evidencias de trabajo de parto o rotura prematura de membrana, que representaron cerca de un tercio del total de casos positivos por Chlamydia trachomatis encontrados en nuestro trabajo. Si bien la literatura no menciona en forma exacta la frecuencia con que se observa este hecho, los resultados encontrados en este estudio hacen plantear la posibilidad de que esta vía de infección sea más frecuente de lo que se cree.

En cuanto al rendimiento de la técnica de PCR1 en relación a los resultados del Gold Standard ampliado, se obtuvo una sensibilidad de 85% y una especificidad de 98%, mientras que los Valores Predictivos Positivo y Negativo fueron de 85 y 98% respectivamente, cifras similares a las publicadas en la literatura22,30.

Por otra parte, al analizar las tres técnicas utilizadas, se observó una discordancia significativa en los resultados obtenidos mediante IFD en relación a ambas PCR. Una discordancia significativa en los resultados por ambas técnicas fue encontrada también por Thomas y colaboradores, quienes obtuvieron una positividad mayor por la técnica de IFD en un estudio de 244 muestras uretrales y cervicales utilizando el kit AMPLICORâ. En este estudio se detectó incluso una menor sensibilidad para la detección de Chlamydia trachomatis por PCR en comparación a lo detectado por IFD31. Thejls ET AL también obtuvieron una mayor detección de muestras positivas por IFD en relación a amplificación por PCR dirigida al plasmidio endógeno común32. En nuestro estudio esta discordancia fue analizada detalladamente al fin de encontrar una explicación a este hecho.

Se descartó la posibilidad de que los resultados negativos por PCR, pero positivos por IFD, se deban a la presencia de sustancias inhibidoras de la técnica de amplificación en los especímenes oculares. También se descartó que el método de calentar las muestras a 100°C para obtener DNA no haya sido suficiente para liberar los corpúsculos de Chlamydia desde el interior de las células infectadas, pues nuestros resultados demostraron que al utilizar este procedimiento además de obtener una adecuada detección de corpúsculos elementales de Chlamydia (1CE/µl para los partidores CTP1/CTP2 y 10-4 CE/µl para los partidores KL1/KL2), no se logró una mejor detección al pretratar las muestras con SDS y proteinasa K. También se planteó que los resultados positivos por IFD pero negativos por ambas PCR se haya originado por un problema de sensibilidad de la técnica de amplificación en nuestras condiciones. Esto se podría plantear si se evalúan los resultados de aquella técnica de PCR que resultó con una menor sensibilidad molecular, en este caso PCR1 (0,1 ng/µl). Sin embargo al analizar la totalidad de las muestras con el segundo método de amplificación utilizado (PCR2), con el que se obtuvo una detección de DNA de Chlamydia trachomatis de 1 fg/µl, la discordancia en relación a los resultados obtenidos por IFD se mantuvo. Se hace difícil por tanto plantear que esta diferencia se deba a un problema de sensibilidad en la detección de DNA de Chlamydia trachomatis por PCR, debido a que el nivel de detección alcanzado fue bastante adecuado. Sin embargo por el hecho de que los estudios de sensibilidad de PCR se realizaron con Chlamydias obtenidas de una muestra pura, sin las diversas secreciones que acompañan a las muestras clínicas, no se puede descartar en forma absoluta que haya existido un problema de detección del DNA por PCR en las muestras de los neonatos estudiados.

Otra posibilidad es que las muestras discrepantes, negativas por ambas PCR y positivas por IFD, contengan Chlamydias que no porten el plasmidio endógeno común, blanco de la amplificación que nosotros utilizamos. Si bien hay publicaciones que han reportado la existencia de Chlamydias que no los poseen33 este hecho no ha podido ser demostrado hasta este momento, ya que no han logrado ser cultivadas en diferentes laboratorios ni tampoco se ha logrado demostrar la pérdida del plasmidio en los diferentes serovares estudiados.

Es poco probable la existencia de resultados falsos positivos por IFD, debido al excelente rendimiento observado en diferentes publicaciones de esta técnica. Sin embargo es una de las potenciales causas que pueden explicar la presencia de estos resultados discrepantes. Se han descrito reacciones cruzadas con otras bacterias a pesar de estar trabajando con anticuerpos monoclonales dirigidos contra la Proteína Mayor de Membrana Externa de Chlamydia trachomatis34.

Otra causa que puede explicar estos falsos positivos, y que al mismo tiempo se describe como una de las desventajas de la IFD, es el hecho que conlleva un elemento subjetivo necesariamente asociado a la lectura e interpretación de cada espécimen.

Para minimizar este problema las muestras fueron leídas con la supervisión de dos profesionales con vasta experiencia en la técnica, por tres observadores diferentes que analizaron las muestras en forma independiente y utilizando tanto controles positivos como negativos con el fin de verificar la calidad del método de tinción realizado.

En relación con otros agentes etiológicos de conjuntivitis neonatal, los principales aislamientos encontrados en nuestro estudio, además de Chlamydia trachomatis fueron Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus viridans y Haemophilus influenzae, en concordancia a lo mencionado en estudios previos3.

No se obtuvo ningún aislamiento de Neisseria gonorrhoeae en los neonatos estudiados. Estos resultados son concordantes con lo reportado en países industrializados, donde gracias al uso masivo de profilaxis ocular en el recién nacido la incidencia de conjuntivitis gonocócica es muy baja (0,3%).

La conclusión principal de este estudio es que Chlamydia trachomatis es una causa importante de conjuntivitis neonatal en Chile, con una prevalencia similar a lo publicado en países desarrollados (8% [3,8-12,2%]), detectándose como agente causal en aproximadamente uno de cada doce recién nacidos con conjuntivitis. Si a esta cifra se suma el hecho de que la infección por Chlamydia trachomatis puede seguir un curso crónico en la conjuntiva del recién nacido, provocando en forma potencial secuelas oculares, y que puede complicarse además con una neumonía en un tercio de los casos, se hace imprescindible incorporar su detección y estudio en nuestro medio a través de laboratorios de referencia. En aquellos servicios en que el diagnóstico de laboratorio no sea posible de realizar por problemas de recursos, una alternativa sería la de considerar a Chlamydia trachomatis entre los agentes etiológicos en el momento de elegir un tratamiento terapéutico empírico frente a una conjuntivitis neonatal en nuestro medio.

Correspondencia a: Dra. Carolina Valencia O. Condell 303-4° Piso, Providencia, Santiago, Chile. Fono-fax: 2045460

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