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Revista médica de Chile

versão impressa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.128 n.8 Santiago ago. 2000

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872000000800001 

Contribución del neuropéptido y
a la fisiología de la co-transmisión
simpática humana. Estudios en biopsias
de vena safena

Neuropeptide Y contribution to the
physiology of human sympathetic co
transmission. Studies in saphenous
vein biopsies

María Verónica Donoso G, Ramiro Miranda J, Manuel
José Irarrázaval Ll, Sergio Morán V, Ricardo Zalaquett S,
Juan Pablo Huidobro-Toro.

 

Background: It is known that the sympathetic varicosities co-store and co-release norepinephrine (NE) together with adenosine S-triphosphate (ATP) and neuropeptide Y (NPY). Aim: To describe the chemical characterisation of stored and released NPY from the varicosities of sympathetic nerve terminals surrounding segments of the human saphenous vein, and the vasomotor activity of rings electrically depolarized or contracted by the exogenous application of the co-transmitters. Material and methods: Saphenous vein tissues were obtained from patients undergoing elective cardiac revascularization surgery. Results: The chromatographic profile of NPY extracted from biopsies is identical to a chemical standard of human NPY. Upon electrical depolarisation of the perivascular sympathetic nerve terminals, we demonstrated the release of NPY to the superfusion media, which did not exceed a 1% of its stored content. The release of the peptide is sensitive to guanethidine, and to extracellular calcium, suggesting that the mechanism of its release is exocytotic in nature. The electrically evoked release of NPY is dependent on the frequency and duration of the electrical pulses. Phenoxybenzamine reduces the electrically evoked release of NPY. Exogenous application of NE and ATP contract saphenous vein rings; the simultaneous application of NE plus ATP causes a synergic response, effect which is further potentiated by the joint co-application of 10 nM NPY. Conclusions: Present results highlight the role of NPY as a sympathetic co-transmitter in the regulation of human vascular tone. (Rev Méd Chile 2000; 128: 829-38).
(Key-words: Adrenergic agents; Biogenic amine neurotransmitters; Neuropeptide Y; Saphenous vein).

Recibido el 26 de enero, 2000. Aceptado el 29 de junio, 2000.
Trabajo financiado parcialmente por el Proyecto FONDECYT #1980966, por la Cátedra
Presidencial en Ciencias otorgada en 1995, por el proyecto de la Fundación Andes y por
el proyecto FONDAP 13980001.
Departamento de Fisiología, Unidad de Regulación Neurohumoral, Facultad de Ciencias
Biológicas y Departamento de Cirugía de Tórax, Hospital Clínico, Escuela de Medicina
Universidad Católica de Chile, Santiago, Chile.

El músculo liso vascular está densamente inervado por pequeñas ramas de nervios autonómicos simpáticos. Las terminales de estos nervios penetran desde la adventicia y hacen contacto con células musculares; esta disposición anatómica es llamada unión neuroefectora vascular. Recientemente se ha propuesto el concepto de la co-transmisión neuronal, que se refiere a la acción concertada, de los varios neurotransmisores que se liberaran simultáneamente desde las varicosidades de los nervios terminales. En el caso de los nervios simpáticos, sus varicosidades terminales almacenan además de noradrenalina (NA), adenosina 5’-trifosfato y neuropéptido Y (NPY). Los neurotransmisores se co-localizan en una misma vesícula sináptica, de las cuales se conocen dos variedades basado esencialmente en su tamaño. Nuestros conocimientos sobre la fisiología de la co-transmisión simpática son aún muy incompletos. Los co-transmisores en la sinapsis, y en la unión neuroefectora, operan mecanismos que regulan tanto la terminal neuronal como la actividad postsináptica. Entre otras funciones, éstos actúan sobre receptores presinápticos que regulan la liberación de NA, de ATP, y NPY y/o actúan post-sinápticamente en la unión neuroefectora simpática modificando la sensibilidad de la sinapsis a la acción de los neurotransmisores1-3. Desde un punto de vista clínico, los co-transmisores simpáticos actúan en la fisiología de los reflejos simpáticos.

A pesar del gran progreso en el estudio de la fisiología y neuroquímica del sistema autonómico durante la última década, aún se sabe muy poco acerca de la co-transmisión simpática humana. Escasos estudios han investigado el contenido de NA, ATP y NPY de los nervios simpáticos en los diferentes tejidos. Se han investigado muy precariamente los mecanismos responsables de la liberación de los co-transmisores, y se conoce menos aún, sobre la fisiología de la co-transmisión simpática. Entre las razones que explica la falta de estudios humanos de esta naturaleza, es necesario señalar obviamente, la falta de modelos experimentales sencillos para abordar estos estudios. En nuestro laboratorio hemos desarrollado la metodología para utilizar biopsias de vasos sanguíneos humanos con el propósito de estudiar el almacenamiento y liberación de los co-transmisores simpáticos desde los terminales simpáticos perivasculares. La vena safena es un modelo experimental sencillo e interesante para estudiar aspectos de la fisiología y farmacología de los nervios perivasculares simpáticos humanos4-6. Utilizando biopsias de este vaso, algunas investigaciones han visualizado, mediante técnicas inmunohistoquímicas, la presencia de las enzimas que participan en la síntesis de NA, o se ha caracterizado la respuesta vasomotora a la aplicación exógena de sustancias vasoactivas4-6. Es evidente que la fisiología de la co-transmisión simpática no ha sido aún investigada con suficiente detalle. Con el propósito de contribuir a los estudios de la fisiología de la co-transmisión simpática humana, nos pareció de interés y trascendencia clínica abordar estudios para evaluar la hipótesis de la co-transmisión simpática en vasos sanguíneos humanos.

En este estudio nos abocamos a caracterizar tres aspectos de la co-transmisión simpática en segmentos de la vena safena humana: i) identificar y cuantificar el contenido de NPY de los nervios perivasculares, ii) estudiar aspectos fisiológicos y farmacológicos relacionados con la liberación de NPY al medio de superfusión de biopsias de este vaso y iii) caracterizar la reactividad vascular de este vaso en respuesta a la aplicación exógena de los co-transmisores: NA, ATP y NPY.

MATERIAL Y MÉTODO

Se utilizaron trozos de vena safena humana. Las biopsias se obtuvieron de pacientes programados para revascularización cardíaca; las muestras se trasladaron en solución salina, lo más rápido posible, desde el pabellón quirúrgico al laboratorio experimental. Los protocolos fueron revisados y autorizados por el Comité de Ética de ambas Facultades. En algunos casos, las biopsias llegaron al mesón experimental en minutos luego de su disección. En el laboratorio, el tejido se mantuvo en solución buffer Krebs-Ringer burbujeada con mezcla de 95% O2/5% CO2 hasta la ejecución del experimento.

Identificación cromatográfica y cuantificación del NPY contenido en las biopsias. Los segmentos de 1-1,5 cm de la biopsia previamente limpiada del tejido conectivo adyacente, se pesaron y se homogeneizaron en 1 ml de ácido acético 0,2 N con 2% de EGTA. El homogenizado se incubó por 15 min en un baño hirviendo (aprox. 100 °C). La muestra se centrifugó durante 30 min a 2000 rpm. Se separó el sobrenadante y se pasó por una columna Sep-Pak (Bondapack C18) para concentrar el NPY. El péptido se eluye de la columna con una mezcla de metanol-ácido tri-fluoroacético (TFA). El eluído se llevó a sequedad. La muestra se reconstituyó en la solución buffer. Para la cuantificación del NPY se utilizó la técnica de radioinmuno-análisis (RIA). Este ensayo utiliza un anticuerpo policlonal comercial, el cual reconoce tanto al NPY como algunos de sus fragmentos del extremo carboxilo terminal. Por este motivo, se procedió a realizar en experimentos paralelos la separación cromatográfica del péptido para en una segunda etapa cuantificarlo por el RIA. Se utilizó un equipo de cromatografía HPLC, previamente calibrado con muestras sintéticas de NPY humano y algunos de sus fragmentos (NPY 5-36, NPY 16-36, y NPY 18-36). Se compararon los tiempos de retención de las muestras extraídas de las biopsias con los estándares químicamente puros, previamente identificados en la misma columna cromatográfica. Se incluyó además de los compuestos truncados de NPY, el producto oxidado del péptido en metionina 17. El NPY oxidado se preparó en el laboratorio a partir de una muestra químicamente pura de NPY sintético, según protocolo descrito por O’Hare and Schwartz, 19897. Existen evidencias en la literatura que el NPY se oxida con relativa facilidad en los tejidos como en la sangre y en líquido cefaloraquídeo.

Preparación de las biopsias para protocolos de liberación y de reactividad vascular. Se preparararon anillos de aproximadamente 3-5 mm de longitud, se colocaron en una cámara de superfusión donde las biopsias se mantuvieron en solución buffer Krebs-Ringer oxigenado a pH 7,4 y 37°C. Se registró la contracción muscular isométrica de la capa muscular circular, por medio de un transductor de tensión acoplado a un polígrafo. Se ajustó la tensión basal del anillo a 1 g, la que se mantiene durante el experimento. Se colocaron dos electrodos de platino en los bordes interiores de la cámara de superfusión. Se conectaron los electrodos a un estimulador eléctrico, para aplicar los pulsos eléctricos transmurales, o se aplicaron directamente al baño de incubación, donde se mantuvieron los anillos de la biopsia, los agentes vasomotores que se quieren estudiar.

Liberación del NPY desde el tejido al medio de superfusión. Los terminales neuronales perivasculares de los anillos de las biopsias se despolarizan mediante estímulos eléctricos transmurales (70 V; 0,5 mseg; 5-40 Hz) por tiempos variables (entre 1-5 min) remedando lo que sucede fisiológicamente. Se recogió cada 5 min el líquido de superfusión de la biopsia para cuantificar el NPY liberado. El buffer de superfusión se concentró mediante columnas Sep-Pak, y se cuantificó el NPY mediante un RIA específico. Con el propósito de identificar químicamente el material inmuno reactivo liberado, se hicieron experimentos adicionales para separar e identificar cromatográficamente el NPY y cuantificarlo mediante el RIA8. En otra serie de experimentos, se estimula eléctricamente los nervios perivasculares durante 5 min pero se cambió la frecuencia del estímulo eléctrico entre 5 y 40 Hz, para investigar si la liberación de NPY es dependiente de la frecuencia del estímulo eléctrico. Paralelamente, en biopsias separadas, estudiamos la influencia de la duración del estímulo eléctrico en la cuantía de la liberación del péptido. Con este propósito, las biopsias se estimularon con trenes de pulsos de 40 Hz durante 1, 3 y 5 min.

Para evaluar diversos aspectos del mecanismo de la liberación del NPY, se diseñaron experimentos en preparaciones superfundidas inicialmente con solución buffer que contiene 2,5 mM calcio externo (control), y preparaciones superfundidas por 2 h con solución buffer sin calcio externo, a la cual se le agregó además 0,1 mM EGTA, un agente quelante de calcio. Otro grupo de experimentos se realizó en preparaciones superfundidas en solución buffer que contiene 5 µM guanetidina, droga que interfiere con el mecanismo de exocitosis simpático o con 10 µM fenoxibenzamina, droga que bloquea el receptor a2-adrenérgico presináptico, y por lo tanto, nos podría revelar detalles del mecanismo de regulación de la liberación de este co-transmisor simpático.

Estudios de reactividad vascular. Se disectaron anillos de la vena de acuerdo con las indicaciones descritas anteriormente. Los anillos se montaron en baños de superfusión de 5 ml para registrar la contracción isométrica de la capa muscular circular. Los anillos se equilibraron durante 1 h con aproximadamente 1 g de tensión. Las preparaciones se calibraron con el estándar de 70 mM KC1, estímulo que se repitió secuencialmente al menos 3 veces hasta lograr contracciones equivalentes. Las respuestas vasomotoras producidas por los estímulos eléctricos, como por los co-transmisores agregados en forma exógena, se compararon con el estándar de 70 mM KC1. Las terminales simpáticas perivasculares se estimularon transmuralmente mediante electrodos de platino (70 V, 0,5 mseg y trenes desde 2,5-20 Hz) durante 30 s. En estos protocolos se agregó al baño de incubación concentraciones variables de NA o de a,ß metilén ATP (análogo estructural no hidrolizable de ATP), o la administración simultánea de NA más el análogo de ATP. Otros protocolos consideran agregar simultáneamente al baño de incubación de las biopsias de los tres co-transmisores. Es decir, NA más a,ß metilén más NPY.

Análisis estadístico: Los valores que se presentan corresponden al promedio de las observaciones con el error estándar respectivo. Se utilizó el análisis de prueba zeta, regresión lineal, análisis de varianza, y cuando corresponde a la prueba "t" no pareado el cual es analizado según las tablas de Dunnett. En todos los casos, la significancia se establece con un p <0,05.

RESULTADOS

Contenido e identificación cromatográfica del NPY. El estudio de 37 biopsias procedentes de 29 pacientes indica que la vena safena humana contiene 22,3 ± 2,9 pmol NPY/g tejido húmedo. Para identificar la naturaleza química del NPY, en 3 de estas biopsias se procedió a la separación e identificación cromatográfica del péptido. Los tres estudios revelan un resultado muy similar, y demuestran que el tiempo de la elución cromatográfica del péptido extraído de las biopsias es idéntico al del NPY sintético usado como estándar. Además, el cromatograma revela que prácticamente no hay fragmentos de péptidos contaminantes, lo que implica que la degradación NPY es mínima. La Figura 1 muestra el perfil cromatográfico del NPY extraído de una biopsia de vena safena. Se observa el peak característico de NPY que se manifiesta entre los 37-39 min y un peak acompañante menor que eluye con un tiempo de retención inferior. Éste último parece corresponder a NPY oxidado, ya que éste peak co-eluye con el producto que se obtiene al oxidar un estándar de NPY sintético.

FIGURA 1. Identificación del NPY extraído de las terminales simpáticas de la vena safena humana y del NPY liberado mediante estímulos eléctricos desde los terminales neuronales perivasculares.
El gráfico superior muestra el perfil cromatográfico del NPY extraído de las terminales neuronales simpáticas de una biopsia de vena safena humana. El 90% del NPY contenido en el tejido co-eluye con un estándar de NPY sintético (flecha), demostrando que el péptido no sufre una metabolización significativa en el tejido. Existe un peak secundario, que corresponde aprox. al 10% del material, y que podría corresponder al péptido oxidado, el cual eluye en el tiempo indicado por la flecha.
El panel inferior demuestra el perfil cromatográfico del péptido liberado al medio de incubación, de la misma biopsia de la cual se extrajo el NPY para efectuar el análisis que se muestra en el panel superior. Los perfiles cromatográficos de ambos materiales son prácticamente idénticos. La cantidad de NPY liberada al medio de incubación equivale a menos del 1% del contenido total del péptido en el tejido. El recuadro muestra la tensión muscular que desarrolló la biopsia al ser estimulada eléctricamente para liberar el NPY que fue purificado e identificado cromatográficamente.
*Superfusado= medio de superfusión.

Liberación de NPY al líquido de superfusión y mecanismos celulares de su regulación. La estimulación eléctrica de los terminales neuronales perivasculares produce la liberación de NPY al medio de incubación. Los estudios analíticos permiten afirmar que el NPY liberado de la biopsia es cromatográficamente idéntico con NPY estándar (Figura 1), y que éste corresponde a menos del 1% del contenido total del péptido en el tejido. Además, queda en evidencias un pequeño contaminante, que al igual que en el caso de la extracción del péptido de las biopsias, parece corresponder al péptido oxidado.

Características de la liberación de NPY

a. Frecuencia y tiempo de estimulación eléctrica transmural: La liberación del péptido es dependiente de la frecuencia del estímulo, y aumenta significativa y linealmente con la duración del estímulo. Despolarizaciones eléctricas de 5, 20 y 40 Hz liberan 1,1 ± 0,2 (n=4); 8 ± 3,4 (n=4) y 16 ± 3 (n=9) fmol NPY respectivamente. La correlación estadística entre liberación y la frecuencia de los estímulos es de 0,6574 (p<0,001, Figura 2). Estudios paralelos demuestran que la liberación de NPY varía linealmente con la duración del estímulo (1, 3 y 5 min.). El coeficiente de correlación de estas dos variables fue de 0,5617 (p<0,05, Figura 2).

FIGURA 2. Efecto de la frecuencia y del tiempo de estimulación sobre la liberación de NPY.
En el panel superior se muestra el efecto de la duración del estímulo eléctrico transmural sobre la liberación de NPY. Existe una relación lineal entre el aumento del NPY liberado y la duración del estímulo cuyo coeficiente de correlación es 0,5617 (p < 0,05).
El panel inferior muestra como influye la frecuencia de estimulación eléctrica transmural (5 min) sobre el NPY liberado al medio de incubación. Se obtuvo una correlación lineal entre la frecuencia del estímulo y la liberación de NPY cuyo valor es de 0,6574, p < 0,01.
Entre paréntesis se indica el número de biopsias analizadas, * p < 0,05; ** p < 0,01, de acuerdo con la prueba zeta, y la prueba "t".

b. La liberación del NPY depende del calcio extracelular: La estimulación eléctrica de las biopsias (40 Hz durante 5 min) en un medio de incubación carente de calcio, reduce en 50% la liberación de NPY (8,3 ± 2,9 fmol de NPY, n=4 vs 16,1 ± 3,1 fmol de NPY, n=9, Tabla 1), indicando que el calcio está involucrado en el mecanismo que regula este proceso.

c. Guanetidina bloquea la liberación de NPY. La incubación de las biopsias con 5 µM guanetidina disminuye en 66% la liberación de NPY evocada por un estímulo eléctrico de 40 Hz durante 5 min (p< 0,05, n=5, Tabla 1).

d. Bloqueo del receptor a2 presináptico mediante fenoxibenzamina. La incubación del tejido con 10 µM fenoxibenzamina reduce en 84% la liberación de NPY (p<0,01, n=4, Tabla 1), sugiriendo la complejidad del mecanismo que regula la liberación del péptido, ya que éste proceso parece ser independiente de la liberación de NA.

Reactividad vascular de anillos de vena safena.

Despolarizaciones eléctricas transmural. La estimulación eléctrica de los nervios perivasculares produce contracciones musculares de la capa circular de anillos de la vena safena que es dependiente de la frecuencia del estímulo eléctrico (Figura 3). La cuantía de la contracción inducida por el estímulo de 10-20 Hz puede alcanzar hasta 50% de la contracción inducida por el estándar de 70 mM KC1, que provoca la máxima contracción de estas biopsias.

FIGURA 3. Respuesta vasomotora desarrollada por un anillo de una biopsia de vena safena humana.
La estimulación eléctrica transmural de los terminales neuronales perivasculares produce respuestas vasomotoras proporcionales en magnitud y duración a la frecuencia de los estímulos eléctricos transmurales. Se ilustran los resultados de dos experimentos efectuados con una misma biopsia. La incubación de la biopsia con 100 nM tetrodotoxina (TTX) durante 10 min, reduce casi completamente la respuesta vasomotora inducida por los estímulos eléctricos. Por otro lado, la incubación con 5 µM guanetidina (GUAN) reduce en forma tiempo-dependiente la actividad vasomotora evocado por los estímulos eléctricos. El registro inferior central se obtuvo a los 3 min de la aplicación de esta droga, mientras que el recuadro de la derecha se obtuvo luego de 30 min de la aplicación de esta droga.

Tetrodotoxina (TTX) bloquea la actividad vasomotora inducida por estímulos eléctricos transmurales. La incubación de anillos de la vena safena con 100 nM TTX anula, reversiblemente, la contracción inducida por los estímulos eléctricos (Figura 3). Esta toxina bloquea los canales de sodio voltaje-dependiente, impidiendo la conducción por los nervios perivasculares, lo que permite concluir que los estímulos transmurales no despolarizan directamente el músculo liso.

Bloqueo de la exocitosis por guanetidina. La incubación de anillos vena safena con 5 µM guanetidina reduce en forma muy significativa la respuesta vasomotora inducida por los estímulos eléctricos. Los registros de la Figura 3 demuestran que luego de 30 min de incubación con esta droga, la actividad vaso motora inducida por despolarización eléctrica está anulada. Esta droga bloquea la exocitosis de la NA y de NPY de las varicosidades simpáticas, impidiendo su acción post-sináptica.

Efecto vasomotor causado por aplicación exógena de los co-transmisores simpáticos

Aplicación conjunta de NA y ATP. La co-aplicación de NA y ATP, o en su defecto de un análogo estructural menos hidrolizable que el ATP, como el a,ß metilén ATP (a,ß), produce un claro ejemplo de sinergismo. Es decir la cuantía de la respuesta vasomotora obtenida al aplicar ambos transmisores en forma conjunta es mayor que la acción correspondiente a la suma de las respuestas vasomotoras producida por cada agonista aplicado en forma individual (Figura 4-A).

FIGURA 4. Sinergismo vasomotor entre noradrenalina (NA) y un análogo no hidrolizable de adenosina 5’-trifosfato, y la potenciación de dicha respuesta por NPY.
Se muestran dos ejemplos representativos de varios experimentos que ilustran la acción vasomotora de NA y de un análogo no hidrolizable de ATP, a,ß metilén ATP (a,ß) que activa receptores purinérgicos como el ATP.
Panel A: La aplicación de 10 nM de NA al baño de incubación donde se mantiene el anillo de la biopsia, evoca una respuesta vasomotora pequeña. Análogamente, la aplicación de 0,5µM a,ß metilén ATP (a,ß) produce una pequeña contracción comparada con el estándar de KC1. Sin embargo, la aplicación simultánea de ambos agonistas provoca una respuesta vasomotora que no es equivalente al efecto aditivo de cada uno de ellos, ejemplificando el sinergismo en la acción vasomotora de ambos agonistas.
Panel B: Este protocolo se efectuó con una biopsia de un paciente diferente al del panel superior, e ilustra que la aplicación de 10 nM NPY facilita aún más el sinergismo de la acción simultánea de NA y a,ß.

Aplicación conjunta de NA, ATP y NPY. Al igual que en estudios anteriores, se demostró que la aplicación de 10 nM NPY no modifica la actividad motora de anillos de la vena safena. Sin embargo, 10 nM NPY, facilita la cuantía y acelera el desarrollo de la respuesta vasomotora causada por la aplicación conjunta de NA más ATP. (Figura 4-B). Este resultado indica el sinergismo de acción postsináptica entre los co-transmisores simpáticos.

DISCUSIÓN

El aspecto más novedoso de esta investigación es la demostración que el co-transmisor simpático NPY, localizado en las varicosidades simpáticas de la vena safena humana, es liberado de las vesículas sinápticas por un mecanismo de exocitosis, el cual había sido previamente estudiado para la NA cerebral humana. A nuestro entender, ésta es la primera demostración que el NPY se libera de nervios simpáticos perivasculares humanos mediante un mecanismo de exocitosis. Además, esta investigación demuestra que el NPY facilita la acción vasomotora post-sináptica de ATP y NA, demostrando que los tres co-transmisores participan en la actividad vasomotora simpática.

Los nervios perivasculares simpáticos humanos han sido poco estudiados. Por razones metodológicas y éticas, la fisiología y farmacología de la co-transmisión simpática, y de los receptores para NA, ATP y NPY de los vasos humanos han sido estudiadas muy insuficientemente. Nuestro interés por contribuir a este tema de estudio abarca investigaciones de aspectos fisiológicos, y pretende descubrir aplicaciones a la terapéutica humana. La biosíntesis de los co-transmisores simpáticos es interesante. Mientras el NPY se sintetiza en los cuerpos celulares y se transporta para su almacenamiento en las vesículas de las varicosidades terminales que rodean los vasos sanguíneos, la NA y el ATP se sintetizan esencialmente en las varicosidades de la terminal neuronal. La catecolamina se recicla en 70-80% mediante un transportador de membrana, y el ATP, que es rápidamente degradado por ectonucleotidasas, no se recicla como tal, sino como adenosina. El NPY liberado al espacio sináptico pasa a la circulación para su eliminación, ya que no se conocen mecanismos de reciclaje del péptido o de fragmentos de éste9.

Un aspecto relevante de este estudio fue la combinación del RIA con la identificación cromatográfica del NPY. Dado que los anticuerpos que se usan para determinar el NPY reconocen en algún grado algunos fragmentos del péptido, decidimos identificar químicamente lo caracterizado por el RIA. Esta analítica nos permite certificar si lo que se libera es auténtico NPY, o corresponde a un fragmento del péptido. Al mismo tiempo, esta metodología nos permite saber si el NPY se degrada en el tejido o una vez liberado al líquido de superfusión. Los resultados de nuestros estudios cromatográficos sugieren que el NPY no se metaboliza mayormente, ya que consistentemente no hemos observado la presencia de fragmentos del péptido ni en las varicosidades de la terminal neuronal, ni en el superfusado, luego de la liberación del neuropéptido. Sin embargo, hemos detectado regularmente la presencia de un pequeño contaminante que basados en otros estudios sugerimos podría corresponder al péptido oxidado, más que a un fragmento de hidrólisis. Aún no sabemos si esta pequeña contaminación ocurre por oxidación del NPY durante el procedimiento de extracción del tejido, o es un producto de oxidación natural del péptido. Varios estudios han señalado la presencia de NPY oxidado en varios tejidos, y en el líquido cefaloraquídeo humano10.

Los resultados de este estudio demuestran que la liberación de NPY es dependiente de parámetros como la frecuencia y el tiempo de estimulación de las terminales neuronales. Además, es evidente que la exocitosis de NPY depende de la concentración extracelular de calcio. El estudio con fenoxibenzamina resultó particularmente interesante. Esta droga bloquea receptores

a-adrenérgicos, entre otros, los autoreceptores presinápticos que controlan la liberación de NA y eventualmente de sus co-transmisores. Nuestro estudio demuestra que esta droga disminuye significativamente la liberación de NPY, lo que puede significar que en ausencia funcional de este receptor, se inhibe la regulación de la liberación del péptido. Es sabido que este antagonista adrenérgico aumenta la liberación de NA. El hecho que la fenoxibenzamina disminuya la liberación de NPY podría ser interpretado como una indicación que la liberación de estos co-transmisores es diferencial, o que esta diferencia se explica porque la fenoxibenzamina aumenta la liberación de NA, y que es ésta la que frena la liberación del NPY. Alternativamente, el propio NPY puede interferir con su liberación. Este aspecto no está del todo claro, y requiere mayor experimentación. Estudios aún preliminares usando tiramina, el producto de la decarboxilación de la tirosina, demuestran que este compuesto libera cantidades masivas de NPY (Donoso y col., resultados no publicados). Se sabe que esta droga, al igual que las anfetaminas, libera NA mediante un mecanismo que no depende del almacenamiento de NA vesicular ni de la concentración de calcio extracelular. Nuestros resultados indican que tiramina libera NPY sin la necesidad del estímulo eléctrico, a través de un mecanismo que aparentemente no depende de la movilización de las vesículas sinápticas.

La respuesta vasomotora inducida por la estimulación eléctrica de los anillos de las biopsias es de origen simpático. Apoyan esta conclusión las siguientes evidencias: 1) Se utilizaron estímulos eléctricos de 0,5 ms de duración, los cuales normalmente no despolarizan el músculo liso; 2) la respuesta vasomotora es bloqueada casi totalmente por tetrodotoxina y; 3) las respuestas son reducidas en forma muy significativa por guanetidina, droga muy selectiva de los terminales neuronales de tipo simpático. Esta droga interfiere con la fusión de las vesículas sinápticas a la membrana plasmática, bloqueando la transmisión adrenérgica, motivo por el cual no se liberan los neurotransmisores simpáticos.

Para caracterizar la respuesta vasomotora de cada uno de ellos, e investigar como los neurotransmisores interactúan entre sí para producir la respuesta vascular, remedamos la acción del nervio mediante la aplicación exógena de dichos neurotransmisores. Tanto la aplicación de NA como de ATP producen respuestas de vasoconstricción. El NPY que no produce directamente vasoconstricción, potencia la acción vasomotora inducida por NA y ATP. Este hallazgo demuestra una acción concertada de los co-transmisores sobre el músculo liso vascular, acción que constituye la base de la llamada co-transmisión simpática. El hallazgo que la co-aplicación de concentraciones pequeñas de NA y de ATP producen una respuesta sinérgica es notable, y constituye la segunda evidencia a favor de la idea de la co-transmisión simpática. El efecto sinérgico, concertado de los co-transmisores simpáticos es a su vez potenciado por NPY, lo que constituye una nueva e importante demostración de la eficacia sináptica si los tres co-transmisores se liberan simultáneamente en la unión neuroefectora vascular. Estos experimentos de carácter marcadamente fisiológico, permiten remedar, aunque en forma primitiva, lo que debe suceder cuando se liberan desde las terminales sinápticos NA y sus co-transmisores.

En conclusión, nuestros estudios demuestran que la vena safena es un modelo atractivo para estudiar aspectos de la fisiología y farmacología de la co-transmisión simpática humana. Estamos conscientes de las limitaciones para extrapolar estas observaciones a fisiología de los reflejos simpáticos humanos en el control de la presión arterial. Los resultados de Capurro y Huidobro-Toro11 implicando al NPY como uno de los transmisores involucrados en el control baroreflejo de la presión arterial, constituyen un aporte promisorio. Por otra parte, estos resultados demuestran que la estrategia experimental de usar trozos de vasos aislados para evaluar aspectos relevantes de la co-transmisión simpática de los nervios perivasculares humanos permite el diseño de protocolos novedosos. Las implicaciones fisiológicas de nuestros hallazgos a la homeostasis de la presión arterial y la aplicación clínica de estos conceptos recién se comienzan a vislumbrar.

Correspondencia a: Dr. Juan Pablo Huidobro-Toro. Fax: 56-2 -222-5515. E-mail: jphuid@genes.bio.puc.cl

Agradecimientos:

Nuestro reconocimiento al personal auxiliar del pabellón de cirugía de Tórax del VI piso del Hospital Clínico de la P. Universidad Católica de Chile, por su colaboración en el manejo expedito de las biopsias humanas.

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