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Revista médica de Chile

versão impressa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.128 n.8 Santiago ago. 2000

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872000000800005 

Presencia de integrones y su relación con
la resistencia a cefalosporinas de tercera
generación en cepas de Acinetobacter
baumannii
de origen nosocomial

Presence of integrons and their relationships
with the resistance to third generation
cephalosporins among nosocomial isolates
of Acinetobacter baumannii

César Ramírez G1, Carolina Pino I2, Gerardo González R3,
Helia Bello T4, Mariana Domínguez Y4, Sergio Mella M,
Raúl Zemelman Z5, Hilary K Young6 y Sebastian GB Amyes7

 

Background: Acinetobacter baumannii is an important etiological agent causing nosocomial infections. High level of resistance for different kind of antimicrobials has been observed, including ß-lactam antibiotics. This feature, chromosomal or plasmid encoded, has been associated to integrons harbouring antibiotic resistance gene cassettes. Aims: To investigate the presence of integrons among clinical isolates resistant to third generation cephalosporins (3GC). Material and methods: One hundred A. baumannii strains isolated from several Chilean hospitals were included in this study. Minimal inhibitory concentrations (MIC) of 3GC by an agar dilution method were carried out. Integrons class 1, 2 and 3 were investigated by colony blot hybridisation and confirmed by PCR. Results: High level of resistance to all assayed 3GC was observed. On the other hand, integrón class 2 was the most prevalent (77% of isolates) followed by integron class 1 (52%). Forty six percent of isolates hybridised with probes for both of them. However, no positive hybridisation was detected for integron class 3. Conclusions: Nevertheless, most isolates harboured one or both class of integron; there was no direct relationship between the presence of these genetic structures and the resistance to this kind of ß-lactam antibiotics. (Rev Méd Chile 2000; 128: 863-7 ).
(Key-words: Acinetobacter infections; Antibiotics, lactam; Cephalosporins; Drug resistance, microbial; Integrons).

Recibido el 8 de marzo, 2000. Aceptado el 13 de junio, 2000.
Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción.
Department of Biological Sciences, University of Dundee, Escocia. Department of Medical
Microbiology, University of Edinburgh, Escocia.
Trabajo financiado por proyecto FONDECYT # 1970848.
1 Biólogo; 2 Estudiante de Bioquímica; 3 Licenciado en Biología, Magíster en Microbiología;
4 Bioquímico, Magíster en Microbiología; 5 Químico-Farmacéutico, Dipl. Bacteriol. MSc
Public Health; 6 BSc in Bacteriology. PhD in Bacteriology; 7 BSc in Biochemistry. PhD in
Microbiology

Acinetobacter baumannii es un cocobacilo Gram negativo no fermentador que desde el punto de vista clínico se comporta como un agente oportunista y que epidemiológicamente se caracteriza por su importancia como agente de infección nosocomial1,3. Algunos biotipos presentan una elevada y múltiple resistencia a los principales grupos de antibióticos, destacándose entre ellos, los ß-lactámicos2. Se han descrito diversos mecanismos de resistencia a esta familia de antibióticos, sobresaliendo la producción de enzimas hidrolizantes y secundariamente fenómenos de impermeabilidad de membrana externa1.

En Chile, los biotipos más frecuentes son el 9 y 8, los que se caracterizan por presentar una elevada multiresistencia a cefalosporinas2,5. En bacilos Gram negativos, esta resistencia está basada fundamentalmente en la producción de ß-lactamasas, incluyendo enzimas TEM, SHV, blaIMP, OXA y sus derivados. En Acinetobacter spp. se han descrito algunas de ellas, y recientemente se demostró la presencia de ß-lactamasas de espectro extendido (BLEE), como PER-1 y 24-15.

En los últimos años, se ha relacionado la multiresistencia a los antibióticos con la presencia de integrones, elementos genéticos que pueden contener uno o varios cassettes genéticos que confieren resistencia a diferentes agentes antibacterianos12. A la fecha, se han descrito cuatro clases de integrones en bacterias Gram negativas9; sin embargo, en Acinetobacter sólo se ha detectado las clases 1 y 21,6.

En este trabajo se investigó la presencia de integrones en cepas intrahospitalarias de Acinetobacter baumannii resistentes a cefalosporinas de tercera generación.

MATERIAL Y MÉTODO

Cepas bacterianas. Se ensayaron 100 cepas de Acinetobacter baumannii resistentes a cefalosporinas de 3ª generación, aisladas de diferentes hospitales chilenos entre los años 1995 y 1998 (Laboratorio de Antibióticos, Departamento de Microbiología, Universidad de Concepción).

Determinación de CMI. La concentración mínima inhibitoria (CMI), fue realizada mediante dilución seriada en agar, de acuerdo a las condiciones descritas por el NCCLS11.

Hibridación en colonia. La detección de los integrones se realizó mediante hibridación en colonia con sondas específicas, bajo las condiciones recomendadas por Sambrook y col13. La sonda para la clase 18, 27 y 314 se muestran en la Tabla 1. Se procedió a hibridar con la sonda toda la noche a 42 °C, a continuación las membranas se lavaron 2 veces con 5XSSC 0,1% SDS por 5 min a temperatura ambiente, luego se lavó 2 veces con 1XSSC 0,1%SDS por 15 min a 42 °C. Se agregó la solución de bloqueo (diluido 1/20) por 30 min a temperatura ambiente. A continuación, las membranas fueron lavadas con solución tampón (Tris-HCl pH 7,5, 600mM NaCl). Posteriormente, se agregó el anticuerpo HRP-antifluoresceína (diluido 1/1000) con BSA 0,5%. Las cepas positivas fueron detectadas con el sistema "ECL detection system" (Amersham Corp.).

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los partidores utilizados están descritos en la Tabla 1. La mezcla de reacción contenía 50 µl como volumen final: 0,1mM dNTPs (Perkin-Elmer), 2,5mM MgCl2 (Gibco), tampón PCR 1X (Gibco), 1,5U Taq polimerasa (Gibco), 20pmol de cada partidor (Gibco) y 20 µl del templado de ADN, el que se obtuvo al hervir por 15 min 200µl de un cultivo de 108 UFC/ml. Los ciclos de temperatura se realizaron en un termociclador GenAmp PCR System 2400 (Perkin-Elmer). Los productos de amplificación se visualizaron en geles de agarosa al 1% (30 min a 100V) teñidos con bromuro de etidio 0,5%.

RESULTADOS

Como se observa en la Tabla 2, un alto porcentaje de las cepas de Acinetobacter baumannii (68,1-96,2%) fue resistente a cefalosporinas de tercera generación, siendo ceftriaxona la menos activa y ceftazidima la de mayor actividad in vitro. Cabe destacar que para cefepima, una cefalosporina de cuarta generación, también se presentó resistencia, con frecuencia superior a los indicados para ceftazidima. Por otro lado, se observó un incremento en la frecuencia de cepas resistentes, de acuerdo al período de aislamiento, siendo las cepas del período 1997-1998 más resistentes, excepto para cefepima.

La detección de integrones en A. baumannii (Tabla 3), evidenció una mayor incidencia de integrón clase 2, seguido de la clase 1. En cambio, no se detectaron integrones clase 3, este patrón fue similar para ambos periodos de aislamientos. También se detectó la presencia simultánea de ambas clases de integrones, clase 1 y 2, en aproximadamente la mitad de las cepas ensayadas. Se puede apreciar también un aumento de las cepas resistentes a cefalosporinas sin presencia de integrones durante el período 1997-1998 comparadas con los aislamientos del período anterior (28,3% en comparación con 4,25%).

DISCUSIÓN

La resistencia a antibióticos, en A. baumannii está mediada fundamentalmente por el cromosoma o plásmidos1. Sin embargo, los integrones aparecen como nuevas estructuras genéticas que albergan genes de resistencia en los denominados cassettes genéticos, permitiendo de esta manera la producción de nuevos fenómenos de recombinación y finalmente la selección de cepas multiresistentes en el medio hospitalario10. Estos elementos genéticos ya han sido descritos en las Enterobacterias y, recientemente, en cepas de A. baumannii6.

El integrón clase 2 es el más frecuente entre las cepas intrahospitalarias de A. baumannii, a diferencia de las Enterobacterias de origen nosocomial, en donde la clase 1 es la predominante. El integrón clase 3 no fue detectado, pudiendo deberse a que esta clase sólo se ha asociado a cepas resistentes a imipenem14, y en Chile no se ha informado aún el aislamiento de cepas resistentes a este antibiótico2. Esto concuerda con lo informado en Francia con cepas de A. baumannii de origen nosocomial; sin embargo, el integrón predominante fue la clase 1, lo que sugeriría un genotipo propio de la región para las cepas chilenas10.

Por otra parte, no se evidenció una relación directa entre la presencia de integrones y resistencia a las cefalosporinas ensayadas; ya que algunas cepas que presentaron uno o ambos integrones eran susceptibles a estos antibióticos; contrariamente otras cepas resistentes carecían de estas estructuras. Tampoco se encontró relación con otros ß-lactámicos, como ampicilina y aztreonam (datos no mostrados). Sin embargo, alrededor de 80% de las cepas ensayadas eran resistentes a estos antibióticos y presentaban al menos una clase de integrón; por lo que no debe descartarse la importancia de estos elementos en el fenómeno de resistencia, ya que la asociación de integrones con transposones, los cuales podrían llevar genes de resistencia adicionales, sumado a la asociación de múltiples transposones en un mismo plásmido ayudaría a explicar, al menos en parte, la multiresistencia de estas bacterias. Debe destacarse también el aumento de las cepas resistentes, que no presentaban integrones, durante el segundo período de estudio (1997-1998), sin embargo, la explicación de este fenómeno no es clara dado las múltiples posibilidades de reordenamiento y transferencia genética en cepas sometidas a una importante presión selectiva. Lo que sigue, es dilucidar los cassettes genéticos de resistencia asociados a estas estructuras e investigar el aporte en la expresión de dicha propiedad. De acuerdo a esto, es posible prever como la pesquisa de estos elementos genéticos será de gran importancia al momento de explicar no sólo la diseminación de estos genes, sino también la posibilidad de expresión de multiresistencia en bacterias que incluso fenotípicamente pueden presentarse como susceptibles12.

Correspondencia a: Gerardo González Rocha. Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción. Teléfono: 41 203237-Fax: 41 245975. E-mail: ggonzal@udec.cl

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