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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.128 n.9 Santiago set. 2000

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872000000900002 

Utilidad de la técnica de AgNOR
en la interpretación de los derrames
de cavidades serosas

Usefulness of AgNOR assay in the
assessment of serous effusions

Adriana E Rocher, Ana María Blanco, Luis A Palaoro

Background: AgNOR technique detects, using silver salts, argyrophylic proteins of the nucleolar organizer region (NOR). The number and size of NOR reflect cell activity, proliferation and transformation and may help to differentiate benign from malignant cells. Aim: To assess the value of AgNOR assay to differentiate reactive mesothelial cells from malignant cells in serous effusions. Material and methods: Thirty one fluids obtained from 16 pleural, 14 peritoneal and one pericardial effusion, were studied. The fluids were processed with Giemsa and Papanicolau stains and with the AgNOR technique. The number of AgNOR dots were counted (only when it was possible to distinguish each individual dot) and the mean value per nucleus was calculated for each smear. Results: Mesothelial cells had a mean of 4,88 ± 1,5 dots compared with 13,78 ± 3,88 dots in the malignant cells (p<0,001). Conclusions: AgNOR assay can be useful for the differentiation of benign and malignant cells in serous effusions. (Rev Méd Chile 2000; 128: 963-8).
(Key-words: Cytodiagnosis; Cytological techniques; Neoplasm metastasis; Serous membrane)

Recibido el 5 de enero, 2000. Aceptado en versión corregida el 11 de julio, 2000.
Laboratorio de Citología, Departamento de Bioquímica Clínica. Facultad de Farmacia
y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina.

Uno de los motivos más frecuentes de producción de derrames en cavidades serosas es la presencia de un tumor maligno metastásico. La evaluación citológica de muestras coloreadas con Papanicolaou y Giemsa puede llegar a carecer en muchos casos de la exactitud requerida conduciendo a un alto porcentaje de diagnósticos erróneos.

Con frecuencia se recurrió al empleo de métodos auxiliares con el fin de complementar el diagnóstico morfológico. La inmunomarcación, cuya contribución a la evaluación rutinaria de material citológico es defendida por algunos1 y desestimada por otros2, debido principalmente a la discrepancia entre los valores comunicados al utilizarse técnicas poco comparables, es de uso desde hace varios años.

En el caso específico de la diferenciación entre células mesoteliales reactivas y malignas, se han ensayado paneles de anticuerpos contra diversos antígenos (filamentos intermedios, oncoproteínas) para establecer criterios que ayudan a incrementar la exactitud del diagnóstico.

La inmunofluorescencia aplicada a efusiones con anticuerpos antiEMA, AUA-1 y Ber EP4 demostró la utilidad de este panel para la diferenciación entre carcinomas y células benignas3 aunque algunos recomiendan la reevaluación del extendido citológico con coloración morfológica en caso de inmunomarcación positiva4.

También se han desarrollado anticuerpos contra antígenos especiales como el B72,35, o contra proteínas de oncogenes, como la codificada por el gen c-erbB-2. Esta última mostró reactividad en gran porcentaje de carcinomas metastásicos a serosas, especialmente en el caso de carcinomas de mama y ovario6.

Para algunos autores, la utilización simultánea de la inmunomarcación de adenocarcinomas en efusiones para antígeno epitelial de membrana (EMA) y antígeno carcinoembrionario (CEA) fue de utilidad en casos de muestras no concluyentes (Blanco AM, Szulc M, Palaoro LA: Inmunocitoquímica de líquidos de punción-Resumen del IX Congreso Argentino de Citología; Buenos Aires, 1990; pag 42).

Con el objeto de simplificar la metodología empleada como complemento del simple análisis morfológico, y de disminuir los costos producidos por el uso de anticuerpos monoclonales, se aplicó la técnica de AgNOR a extendidos citológicos derivados de líquidos de punción con células benignas y malignas.

La misma se basa en detectar por medio del uso de sales de plata, las proteínas fibrilares no histonas ubicadas en las regiones organizadoras del nucleolo (NOR).

El conjunto de genes que transcriben RNA ribosomal se encuentra en las constricciones secundarias de los cromosomas 13, 14, 15, 21 y 22. El tamaño del nucleolo varía de acuerdo a la necesidad de la célula de generar ribosomas, y como consecuencia incrementa la producción de proteínas. El número y tamaño de los NOR refleja la actividad, proliferación o transformación de las células.

Este método comenzó a aplicarse de rutina por Ploton7 en tejidos incluidos en parafina. Crocker y colaboradores8 lo utilizaron en secciones de nódulos linfoides y de melanomas, observando buena correlación entre el número de partículas y el grado de proliferación. Smith y Crocker9 lo evaluaron en lesiones de mama y encontraron diferencias significativas entre tumores malignos y benignos.

Nuestro objetivo fue investigar la utilidad de la técnica del AgNOR -una técnica de bajo costo y fácil aplicación- en derrames de cavidades serosas, como un ensayo que nos permita diferenciar entre células mesoteliales reactivas y células neoplásicas.

MATERIAL Y MÉTODO

Fueron evaluados líquidos de derrame provenientes de 31 pacientes: 16 derrames pleurales, 14 derrames peritoneales y un derrame pericárdico pertenecientes a pacientes ingresados entre agosto/98 a junio/99 en el Hospital de Clínicas "José de San Martín". Se les efectuó a los mismos coloraciones de Giemsa, Papanicolaou y AgNOR. En casos especiales se complementó con técnicas de inmunomarcación.

Todos los casos positivos fueron clasificados citológicamente como adenocarcinomas.

Los respectivos tumores primarios, excepto un caso, tenían confirmación histopatológica. Los nueve adenocarcinomas pleurales provenían de mama (6), pulmón (2) y de origen desconocido (1).

El grupo negativo (16 pacientes) fue seleccionado entre aquellos con citología benigna y con historia clínica que revelaba ausencia de patología neoplásica, complementada en algunos casos con estudios tomográficos y de marcadores oncológicos séricos. Los procesos causantes de las efusiones benignas (7 pleurales, 8 peritoneales y 1 pericárdico) comprendían cirrosis hepática, infarto pulmonar, insuficiencia cardíaca congestiva y procesos inflamatorios agudos.

En un par de casos con citología no totalmente concluyente e historia de patología benigna se evaluó la expresión de CEA y EMA por inmunocitoquímica1 con resultados negativos para ambos marcadores.

Técnica de AgNOR: las muestras fijadas previamente en etanol 96° se colorean durante 25 min en la oscuridad con una solución coloidal de plata obtenida mezclando dos partes de nitrato de plata 5% p/v en una parte de gelatina al 1% p/v en ácido fórmico al 1% v/v. Se lava 3 veces con agua deionizada, luego una vez con solución de tiosulfato al 1% p/v durante 5 min, se deshidrata con xileno y se realiza el montaje en bálsamo de Canadá7.

Se observan los preparados con objetivo de inmersión, se cuenta el número de puntos de AgNOR por célula, debiéndose observar un mínimo de 100 células. El resultado debe expresar la media de puntos para cada muestra. El análisis estadístico de las muestras se realizó por la prueba t de Student.¹

RESULTADOS

La observación mostró claramente las partículas de AgNOR, el recuento se efectuó en aquellos casos que podrían ser diferenciables aún estando agrupados.

En los extendidos con células mesoteliales reactivas (Figura 1) se obtuvo una media de 4,88 partículas de AgNOR por célula (desviación estándar: 1,50), mientras que en los casos de células neoplásicas la media fue de 13,178 (desviación estándar: 3,88) con una diferencia altamente significativa entre las dos poblaciones (p<0,0001) (Tabla 1).


FIGURA 1. Células mesoteliales reactivas bajo número de partículas AgNOR (x 1250).

La distribución de las partículas en cada núcleo siguió diversos patrones: aisladas, agrupadas en forma compacta (Figura 2), agrupadas en forma laxa y en cuadro mixto (Figura 3) (Tabla 2).


FIGURA 2. Adenocarcinoma mostrando AgNOR con patrón de distribución compacto en algunas células (observar célula inferior con un cluster compacto) (x 1250).


FIGURA 3. Adenocarcinoma con un alto numero de AgNOR. Nótese la gran cantidad de partículas en cuadro mixto: agrupadas en forma laxa y como puntos aislados (x 1250).


DICUSIÓN

Con el fin de diferenciar entre células benignas y malignas aplicando recuento de partículas de AgNOR, las mismas fueron contadas en forma individual. Cuando se encontraban agrupadas, una cuidadosa observación estableció el número total del conjunto. Si la masa de partículas era muy compacta e impedía el recuento diferencial, esa célula no era considerada en la evaluación. Por ese motivo es que la diferencia obtenida entre ambas poblaciones (benignas versus malignas) fue altamente significativa. Otros autores utilizaron el criterio del recuento de los grupos compactos como una sola partícula, obteniendo diferencias mucho menores10.

El criterio elegido para la determinación del número de partículas es fundamental y debe insistirse en un método que permita la estandarización, para poder obtener resultados comparables11. Es importante la unificación de criterios dentro de esta técnica, para lo cual se deben considerar diversos puntos:

a) Fijación del material (usar solamente etanol 96° o etanol post solución Carnoy). b) El tiempo de la reacción es dependiente de la temperatura oscilando entre 20 y 60 min, con un tiempo medio 25 de min. c) Los depósitos inespecíficos de Ag (fondo o "background"), se resuelven recurriendo al lavado con tiosulfato de sodio al 1% p/v durante 5 min.

No se observó un patrón predominante que permita sospechar la naturaleza benigna o maligna de los derrames. En las dos poblaciones se dieron todos los casos posibles de distribución de las partículas de AgNOR.

Se ha informado, en algunos materiales, un cuadro predominante de partículas aisladas, abundantes e irregulares en neoplasias12, mientras que otros autores muestran imágenes de distribución mixta en adenocarcinoma de derrames de cavidades serosas13.

En nuestro trabajo las células mesoteliales reactivas y neoplásicas presentaron, en algunos casos, la misma imagen de grupos compactos y a pesar del mayor tamaño de ellos, en el caso de células malignas, no puede utilizarse este patrón como criterio diferencial de ambas poblaciones. Se debe recurrir al recuento en aquellas células que permitan la visualización individual de las partículas de los grupos.

Es importante proceder cuidadosamente cuando en un material de derrame coexistan dos poblaciones: células mesoteliales reactivas y células neoplásicas. El recuento debe efectuarse en las células con mayor número de partículas corroborando los datos obtenidos con la coloración morfológica de rutina (Figura 4)


FIGURA 4. Gran célula perteneciente a un adenocarcinoma con un alto número de AgNOR acompañada de células mesoteliales reactivas con un bajo AgNOR.

El método demostró su utilidad en aquellos casos de citología no concluyente. Dos casos de cirrosis hepática que mostraron extrema reactividad mesotelial en ascitis tuvieron promedios de AgNOR de 5,20 y 4,70, lo que permitió encuadrarlos en casos de patología benigna. Inversamente, en una paciente con metástasis de carcinoma mamario a pleura y cuadro citológico sospechoso, el AgNOR alcanzó el valor de 12,00. El método del AgNOR tiene algunos límites originados principalmente en la agrupación extrema de partículas que impiden su recuento diferencial. Algunos casos de adenocarcinoma con patrón de macronucleolos compactos no fueron incluidos en la estadística, por presentar la imposibilidad de su recuento y sin embargo, el mismo material coloreado con la técnica de Papanicolaou, no ofrecía dudas en el citodiagnóstico. En estos casos, la técnica del AgNOR no sólo sería de escasa información sino que su aplicación carecería de sentido al tratarse de muestras fácilmente clasificadas por coloraciones morfológicas.

La utilización de metodología de contraste diferencial de interferencia (DIC), un procedimiento que no es de rutina en la mayoría de los laboratorios, permitiría aumentar la resolución de las partículas agrupadas en grupos compactos. Si bien no se han realizado comparaciones de scores entre este método y los de observación convencional con microscopio óptico, queda la posibilidad de investigar la utilidad de esta modificación en trabajos futuros14.

La técnica de AgNOR es sencilla pero rigurosa, el observador debe ser meticuloso contando sólo las partículas discernibles, aunque las mismas se encuentren agrupadas. Tendrán que ser estandarizados sus pasos para obtener una óptima coloración de las partículas.

Este método (AgNOR) es un importante bíomarcador de ayuda en los líquidos de punción ya que permite diferenciar significativamente entre células mesoteliales reactivas y células malignas.

Correspondencia a: Adriana E Rocher. Malabia 2321, 1° piso dpto. 4, (1425) Buenos Aires, Argentina.

REFERENCIAS

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