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Revista médica de Chile

versão impressa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.128 n.9 Santiago set. 2000

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872000000900006 

Mutación del gen p53 en el cáncer
de colon y recto

p53 Gene mutation in colorectal
carcinoma

Juan Carlos Roa S, Iván Roa E, Angélica Melo A1,
Juan C Araya O, Miguel A Villaseca H, Mariano Flores M,
Barbara Schneider2.

Background: Genetic events associated to colorectal carcinoma are well characterized, but there is scanty information about this issue in Chilean subjects. Aim: To determine the frequency and distribution of exons 5, 6, 7, 8 and 9 mutations and the immunohistochemical expression of p53 gene in biopsy samples of colorectal carcinoma. Material and methods: p53 gene exons 5, 6, 7, 8 and 9 were directly sequenced in 42 biopsy samples of colorectal carcinoma. Immunohistochemical expression of p53 was determined in 35 samples. Results: Thirty one discrete mutations (12 transitions, 11 transversions and 8 insertions) were observed in 21 samples (60%). Nine samples had mutations in exon 5, twelve samples had mutations in exon 6, seven samples had mutations in exon 7 and three samples had mutations in exons 8 and 9. Immunohistochemical expression of p53 protein was observed in 18 of 35 cases. There was a high correlation between the genetic alteration and immunohistochemistry, when p53 was expressed in more the 20% of cells. The positive and negative predictive values of p53 expression were 87 and 80% respectively. There was a non significant lower mortality among patients with mutations in their biopsies. Conclusions: These results confirm the involvement of p53 gene mutations in colonic carcinogenesis. Immunohistochemical methods for the detection of p53 protein have a high predictive value (Rev Méd Chile 2000; 128: 996-1004).
(Key-words: Carcinoma; Colonic neoplasms; p53 Gene; Mutation; Rectal neoplasms)

Recibido el 13 de marzo, 2000. Aceptado en versión corregida el 31 de julio, 2000.
Trabajo financiado parcialmente por Proyecto Fondecyt# 1991025.
Unidad de Anatomía Patológica. Servicio y Departamento de Cirugía. Hospital de Temuco.
Facultad de Medicina. Universidad de la Frontera, Temuco, Chile.
Department of Pathology. Luisiana State University Health Sciences Center.
1 Tecnólogo Médico.
2 PhD.

El cáncer colorrectal es una neoplasia cuya frecuencia ha ido aumentando en los últimos años y será uno de los tumores malignos más importantes en nuestra población en el futuro cercano1,2. Los eventos genéticos que conducen a la aparición de cáncer de colon han sido bien caracterizados, sin embargo3, la información obtenida en la población chilena es mínima4.

El modelo de la progresión de las alteraciones genéticas en el cáncer de colon es un hecho conocido y aceptado3. Entre ellas, destaca la mutación del gen supresor de tumores p533,5. Este gen considerado como el guardián del genoma humano, cuya función normal es impedir la replicación de células con material genético dañado a través de una inhibición de la replicación transcripcional e inducción de la apoptosis celular6. Las mutaciones en el gen p53 favorecen la transformación maligna celular. Estas mutaciones comprometen en el 98% de los casos a los exones 5 al 9 que corresponden al material genético ubicado entre los codones 100 a 300, donde algunos de estos codones presentan una mayor frecuencia de mutaciones y son conocidos como "hot spots"3,7,8.

Las alteraciones de este gen pueden estudiarse a nivel de su producto proteico con técnicas de inmunohistoquímica4, inmunoprecipitación9; a nivel cromosómico (hibridación in situ, FISH)10; a nivel génico con técnicas de biología molecular basadas en la reacción de polimerasa en cadena (PCR). Entre estas últimas están el polimorfismo conformacional de cadena simple (SSCP)11,12, la electroforesis en gel gradiente de denaturación (DGGE)13,14, análisis de heteroduplex15 y secuenciación de los segmentos génicos amplificados16.

La proteína normal del gen p53 tiene una vida media de 15 a 20 min17,18, esto determina que en condiciones normales no pueda ser detectada inmunohistoquímicamente. Sin embargo, al mutar el gen se produce una proteína defectuosa que no puede ser degradada19, acumulándose por aumento de su vida media, permitiendo de esta manera su inmunodetección. Muchos estudios han utilizado la inmunotinción de p53 como un marcador indirecto de mutación, sin embargo, en algunas publicaciones no se ha demostrado una estricta relación entre la expresión inmunohistoquímica y mutación del gen20-22.

No existe información en nuestro medio respecto de las alteraciones moleculares que se observan en el cáncer de colon con sólo comunicaciones aisladas basados en técnicas de inmunohistoquímica4, desconociéndose importantes aspectos biológicos de ésta, y suponiendo que estos tumores se comportan en nuestra población de manera similar a poblaciones extranjeras.

El objetivo de este estudio es determinar la frecuencia y distribución de mutaciones del gen p53 mediante secuencia directa de los exones 5, 6, 7, 8 y 9 y la expresión inmunohistoquímica de su producto proteico, correlacionando esta información con sobrevida de los pacientes.

MATERIAL Y MÉTODO

Selección de los casos: se seleccionaron en forma aleatoria 42 casos de colectomías por cáncer rectal de archivo de biopsias de la Unidad de Anatomía Patológica-Citopatología del Hospital Regional Temuco. Las piezas quirúrgicas fueron procesadas según las reglas de la Sociedad Japonesa de Investigación del Cáncer de Colon y Recto23,24. Los tumores fueron clasificados mediante los sistemas de Dukes25 y OMS26. Se obtuvo antecedentes clínicos de etapificación tumoral y seguimiento de los pacientes.

Se seleccionaron áreas representativas de cada tumor, realizándose cortes de 5 µ de espesor para la técnica inmunohistoquímica y un corte de 40 µ para la extracción de ADN. Las baterías de procesamiento (solventes y colorantes) fueron montadas especialmente para esta técnica, a fin de disminuir los riesgos de contaminación. Los cuchillos del micrótomo fueron desechables, utilizando distintas áreas para cada muestra, previa limpieza con solventes. Se realizó disección de las áreas representativas del tumor mediante estereomicroscopía. El material disecado fue desparafinado en xilol e hidratado mediante incubaciones en concentraciones decrecientes de alcohol. Posteriormente, se centrifugaron a 16.000 g por 15 min a temperatura ambiente, eliminándose el sobrenadante.

Extracción del ADN: para la extracción de ADN se empleó el "DNA Isolation KK (Gentra USA)", según las instrucciones del fabricante. En resumen, consistió en: incubación en solución de lisis con proteinasa K a 55º C durante la noche o hasta la digestión del tejido. Luego, incubación con ARNasa y solución precipitante de proteínas. Del sobrenadante se precipitó el ADN con isopropanol; posteriormente se resuspendió en buffer de hidratación y almacenó a 4º C.

Amplificación del ADN: las amplificaciones fueron realizadas en un termociclador GeneAmp PCR Systems (Perkin Elmer). Se usaron 4 juegos de iniciadores (primers) para amplificar 4 segmentos de los exones 5, 6, 7 y 8 del gen supresor de tumores p53. La amplificación de estos 4 segmentos de tamaño entre 134 y 332 pares de bases se realizó usando las siguientes secuencias para los iniciadores27. Como control interno de la calidad del ADN extraído se realizó PCR para p-globina28.

Exón5 (sense)

5’ TTC CTC TTC CTG CAG TAC TC 20 mer
240 bp(antisense) 5’ CTG GGC MC CAG CCC TGT CGT 21 mer
xón6 (sense) 5’ ACG ACA GGG CTG GTT GCC C A 20 mer
187bp (antisense) 5’ AGT TGC MA CCA GAC CTC AG 20 mer
Exón7 (sense) 5’ TCT CCT AGG TTG GCT CTG ACT G 22 mer
134bp (antisense) 5’ GCA AGT GGC TCC TGA CCT GGA 21 mer
Exón8-9(sense) 5’ CCT ATC CTG AGT AGT GGT MT C 22 mer
332bp (antisense) 5’ CCC MG ACT TAG TAC CTG MG 21 mer
B globina (sense) 5’CM CTT CAT CCA CGT TCA CC 20 mer
260bp (antisense) 5’ ACA CM CTG TGT TCACTA GC 20 mer

La reacción se realizó en un volumen total de 30 µl, utilizándose las condiciones de amplificación descritas por Shefffield27. Las mezclas de reactivos se realizaron en hielo y las muestras fueron colocadas en el termociclador al alcanzar una temperatura de 70º C ("hot start"). La pureza y tamaño de los productos PCR obtenidos fueron determinados en geles de agarosa 2,5% (Amresco Inc. Ohio, USA).

La PCR fue realizada con 5-10 µl de ADN genómico, 1 x buffer PCR, 0,2-0,4 µM de cada iniciador, 200 µM de cada uno de los deoxinucleótidos trifosfatos, 1,5 µM de MgCI y 1,5 U de Taq Polimerasa , en un volumen final de 50 µl (Gibco BRL) . La amplificación se realizó con el siguiente protocolo: predenaturación (94º por 4 min), 35 ciclos de denaturación (94º por 1 min), hibridación y extensión (72º por 1 min). Las temperaturas de hibridación fueron para el exón 6 y 8 de 60º y para los exones 5 y 7 de 62º y de 55 para, ß-globina por un tiempo de 1 min. La extensión final se realizó a 72º por 7 min25.

Los productos PCR obtenidos fueron corridos en geles de agarosa 1,5%, 0,6 µg/ml de bromuro de etidio y expuestos a luz UV (Fotodyne 21). En algunos casos se realizó una segunda amplificación en iguales condiciones, disminuyendo el número y duración de los ciclos (30 ciclos de 30 seg. en cada paso). Esta reamplificación se realizó con 5-7 µl del producto PCR.

Secuenciación de productos PCR: se obtuvo secuencias satisfactorias de los exones 5, 6, 7 y 8-9 del gen p53, en 35 de los 42 casos analizados. Los productos PCR (pPCR) purificados fueron secuenciados directamente, usando el kit "T7 Sequenase PCR product sequencing (Amersham)" y 35S-dCTP marcado de acuerdo a las instrucciones del fabricante, consistió en: tratar los pPCR con fosfatasa alcalina y exonucleasa para eliminar primers y hebras simples, posteriormente se agregó 1 µl de primer de secuencia (10 µM) y la etapa de denaturación-hibridación se realizó a 95º C por 3 min. La marcación se realizó con 0,5 µCi de 35S-dCTP a temperatura ambiente por 10 min y la reacción de terminación se realizó a 37º C por 10 min. En los casos que presentaban mutaciones ellas fueron confirmadas con secuenciación en ambos sentidos (sense y antisense).

Las muestras se corrieron en gel de poliacrilamida al 6% a 40 Watts y a una temperatura de 50º C por 2 h y posterior autoradiografía por alrededor de 17-20 h a temperatura ambiente (Figura 2).

Estudio histoquímico: se utilizó la técnica estándar Streptavidina-Biotina (Biogenex) para tejidos fijados en formalina e incluidos en parafina6. Se realizó pretratamiento de los cortes a ebullición seguido de un lavado en buffer fosfato. La incubación del anticuerpo primario se realizó a temperatura ambiente en cámara húmeda durante la noche (anticuerpo monoclonal anti-proteína p53 Oncogene Science Ab6 1:100). Posteriormente fueron incubados con anticuerpo secundario 1:320 (multilink biotinylated, Biogenex), durante 1 h y finalmente revelados con diaminobenzidina. En cada prueba se emplearon controles negativos y positivos. En los controles negativos se sustituyó el anticuerpo primario por suero normal, y como control positivo se utilizaron casos de carcinomas de vesícula biliar en los que previamente se había demostrado positividad para esta la proteína p53.

Forma de medición de la positividad: la tinción positiva para la proteína del gen p53 fue de tipo intranuclear (Figura 1). La estimación de la positividad se realizó de acuerdo al porcentaje de células positivas en la muestra examinada. Para los fines de este estudio se consideraron como positivos aquellos casos en que al menos 5% de las células mostraron positividad y se establecieron rangos de expresión según el porcentaje de células teñidas. En los casos con positividad dudosa, se realizó un nuevo ensayo, si persistía la duda estos casos fueron considerados negativos29.

Análisis estadístico: se utilizo la prueba exacta de Fischer, chi cuadrado y Kaplan Meier.


FIGURA 1. Microfotografía de adenocarcinoma tubular poco diferenciado infiltrante en colon y recto con intensa positividad nuclear para p53 en el 100% de las células tumorales.


FIGURA 2. Secuenciación de los exones 5, 6,7 y 8 del gen p53.Fotografía compuesta que muestra ejemplo gráficos de mutaciones puntuales en los exones 5, 6, 7, 8-9. Los asteriscos indican el cambio de nucleótido en relación con el control normal. En el exón 8, se muestra la secuencia en dirección retrógrada (antisense) en el resto la dirección de secuencia es anterógrada (sense).

RESULTADOS

Las características generales del grupo estudiado se resume en la Tabla 1. El 100% de los tumores correspondieron a adenocarcinomas, los que en su gran mayoría fueron moderadamente o poco diferenciados (77%) y avanzados 91% (etapas B y C de Dukes).


En 35 de 42 casos (83%) se logró secuenciar satisfactoriamente los 5 exones. En la Tabla 2 se resumen los hallazgos de los 35 casos, que incluye codón en el cual se encontró la lesión, el cambio de nucleótido y la modificación de la secuencia aminoacídica. En 21 casos (60%) se observaron 31 mutaciones: 12 mutaciones puntuales por transición, 11 por transversión y 8 por inserción Las mutaciones se distribuyeron de la siguiente manera: Exón 5= 9 casos; Exón 6= 12 casos; Exón 7= 7 casos y Exones 8-9= 3 casos (Tabla 2). En el caso 1 se encontraron transiciones en los codones 177 y 218, sin embargo, estas se ubicaron posterior a un codón de terminación generado en el codón 171 por una transversión. De este modo, el caso presenta 3 mutaciones, pero las 2 últimas no generan alteración de la proteína. Un hecho interesante es que se encontró 8 Inserciones, 7 de las cuales generaron la aparición de codones de terminación posteriores debido al cambio en el marco de lectura. A diferencia de otros estudios, no existió una especial alta frecuencia de mutaciones en codones específicos ("hot spot"), y se distribuyeron en forma homogénea entre los codones 130-293, estando el 60% en el área de la proteína que se une a secuencias específicas de ADN por la cual, esta proteína ejerce su efecto inactivando la replicación celular.


En 18 casos (51,4%) el estudio inmunohistoquímico mostró positividad para la expresión proteica de este gen. Se establecieron rangos según porcentaje de células positivas como se muestra en la Tabla 3. Al considerar sólo los casos con más de 20% de sus células positivas (se excluyó a 3 casos que presentaban positividad entre 5 y 20% de las células) se observó una correlación entre la alteración génica (mutación) y la expresión inmunohistoquímica de la proteína en 81,25% de los casos (Tabla 4) con una sensibilidad de 81%, especificidad de 85,7%, valor predictivo positivo 87% y valor predictivo negativo de 80%. Es interesante mencionar que 5 de los 8 casos con mutación pero con IHQ negativa presentaban en la secuencia una mutación de terminación prematura de la proteína y por lo tanto indetectable mediante inmunohistoquímica debido a que el epítope proteico identificado por el anticuerpo se ubica en la zona ausente.


El tiempo de seguimiento de los pacientes fluctúo entre 2 a 73 meses con un promedio de 32 meses. Se encontró menor sobrevida en aquellos pacientes con mutación del gen p53, sin embargo esta diferencia no fue significativa (Figura 3).


FIGURA 3. Curva de Sobrevida de Kaplan Meier que muestra una fuerte tendencia a menor sobrevida en el grupo de pacientes que presenta mutación de p53. P= NS

No se encontró correlación entre otras características morfológicas, presencia de mutaciones y sobrevida en el grupo estudiado.

DISCUSIÓN

Nuestros resultados muestran la presencia de mutaciones puntuales en el 60% de los carcinomas de colon y recto estudiados (21 de 35), concordando con comunicaciones extranjeros que presentan una frecuencia de mutaciones entre 55% y 70%30-33. Aún cuando algunos de estos estudios preseleccionaron casos con alteraciones en el brazo corto del cromosoma 1732,33, lo cual aumenta el porcentaje de mutaciones respecto de nuestro grupo.

Nuestros resultados muestran una correlación superior al 80% (entre la expresión inmunohistoquímica de p53 y una mutación detectada mediante secuenciación directa cuando se utiliza como punto de corte 20% de las células positivas. Existen numerosas causas para explicar los falsos positivos y negativos de la inmunohistoquímica si se considera a la secuenciación como técnica de referencia. Los falsos positivos pueden deberse a la estabilización de la proteína p53 por otras proteínas, como algunos productos virales (E6-E7 del virus papiloma humano)34,35, y como producto de la unión a miembros de la familia de proteínas del choque calórico36. También pueden explicarse por la sobrecarga de trabajo del sistema p53, en el cual la proteína normal se acumula debido a una mayor frecuencia de alteraciones genéticas que ocurren en las células tumorales que en el tejido normal circundante17. Finalmente la mutación podría estar en alguno de los exones no estudiados, instancia poco probable si consideramos que en más del 98% de las mutaciones de p53 en cáncer de colon se encuentran entre los exones 5 y 9. Los falsos negativos pueden deberse a mutaciones puntuales que no estabilicen la vida media de la proteína (sin cambio de la secuencia aminoacídica)37,38, o modifiquen específicamente el sitio de reconocimiento antígeno-anticuerpo. Una mutación de detención puede hacer desaparecer una parte importante de la proteína haciéndola indetectable a la inmunohistoquímica37,38. Este fenómeno ocurrió en 8 de 9 de nuestros casos. Debido a la inserción de bases nucleotídicas se generó un cambio en el marco de lectura, produciendo en el sitio mismo de la inserción o más adelante un codón de terminación que dejó trunca a la proteína, En el caso restante no se produjo este codón de terminación.

En series internacionales la correlación entre la expresión inmunohistoquímica y la mutación del gen p53 es baja, no superando índices del 60%30-32,39. Sin embargo, nuestros indicadores muestran una alta sensibilidad y especificidad de la IHQ permitiendo considerarla como una excelente herramienta en el screening de mutaciones puntuales del gen p53, especialmente cuando ésta se encuentra presente en más del 20% de las células tumorales (p= 0,02). Sin embargo, la expresión inmunohistoquímica de p53 no demostró ser un factor pronóstico en nuestro grupo de pacientes, lo que en general concuerda con lo comunicado en el extranjero.

La presencia de mutación de TP53 entre los exones 5 al 9 determinada mediante secuenciación, mostró una tendencia a menor sobrevida en el grupo de pacientes que las presentaba, sin embargo, esta diferencia no fue significativa (Figura 3). Es posible que el alto porcentaje de casos avanzados con mal pronóstico y el número de casos impida mostrar una diferencia significativa. Lo que plantea la necesidad de estudios con un mayor número de pacientes que permita validar o rechazar esta observación. El estudio de éste y otros aspectos claramente relacionados con la carcinogénesis de colon y recto y de la interacción de la célula tumoral con la matriz extracelular del huésped nos permitirá la agresividad tumoral en nuestra población.

Podemos concluir que es de importancia estudios enfocados no sólo en describir características fenotípicas y genotípicas de nuestros tumores gastrointestinales sino también de correlacionarlas con sobrevida y otros parámetros clínicos a fin de establecer elementos pronósticos que permitan diferenciar subgrupos de pacientes con el objeto indicar terapias acordes a la agresividad con la finalidad de mejorar tanto el tiempo de sobrevida como la calidad de vida.

Correspondencia a: Dr. Juan Carlos Roa S. Laboratorio de Biología Molecular, Facultad de Medicina, Universidad de la Frontera. Casilla 54 D. Temuco. Chile.

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