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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.128 n.10 Santiago oct. 2000

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872000001000001 

Detección de Salmonella enteritidis
en muestras de productos avícolas
de consumo humano en la Región
Metropolitana

Detection of Salmonella enteritidis
in samples of poultry products for
human consumption in the Chilean
Metropolitan Area

Marcela Alexandre S1, Claudia Pozo M1, Viviana González G1,
María Cristina Martínez H2, Soledad Prat M3,
Alda Fernández R3, Alberto Fica C, Jorge Fernández O4,
Ingrid Heitmann G.

Background: Salmonella enteritidis (SE) is a frequent cause of diarrhea, and is transmitted mainly by SE contaminated eggs or poultry meat. The frequency of SE contaminated eggs or chicken meat and the risk for acquiring this pathogen is unknown in Chile. Aim: To measure SE contamination in eggs poultry meat and entrails offered in retail markets in the Metropolitan Area during two consecutive years (1998-1999). Material and methods: Samples were placed in sterile bags and transported to the laboratory before 4 hours at 4°C. Microbiologic detection was done using a standard procedure and an immunodetection assay. Results: SE was found in one of 1081 egg samples (0.09%). The contaminated sample was offered in a supermarket under their own commercial name. Six percent of 1154 poultry meat samples were contaminated by SE and 2.3% by other Salmonella serotypes. Entrails had even higher rates with 10.2% of 370 samples harboring SE and 2,7% other serotypes. Total Salmonella sp. isolates and SE isolates declined during 1999. Nine SE phagotypes were identified, predominating types 4 and 7. Conclusions: Eggs and other avian products are contaminated by different SE phagotypes and other Salmonella serotypes, implicating a risk for the consumers (Rev Méd Chile 2000; 128: 1075-83).
(KeyWords: Poultry products; Salmonella enteritidis; Salmonella food poisoning)

Recibido el 18 de abril, 2000. Aceptado en versión corregida el 12 de agosto, 2000.
Servicio de Salud Metropolitano del Ambiente, Unidad de Desarrollo y Subdepartamento
de Microbiología, Instituto de Salud Pública y Programa de Microbiología, ICBM, Facultad
de Medicina, Universidad de Chile.
Trabajo financiado parcialmente por Proyecto Fondecyt n° 1980912.
1Médico Veterinario
2Bioquímico
3Tecnólogo Médico
4Ph.D.

Las infecciones por Salmonella enteritidis (SE) son una causa importante de diarrea, morbilidad y en ocasiones de mortalidad en la población humana. Están asociadas principalmente al consumo de huevos y productos derivados contaminados, tales como mayonesas y merengues entre otros1-4. Esta bacteria causa infecciones en el ser humano en forma endémica o en brotes epidémicos de intoxicación alimentaria que abarcan, en ocasiones, amplias zonas geográficas debido a la centralización de la industria avícola y a extensas cadenas de distribución comercial4. Es así como en USA, Inglaterra, Italia, Finlandia y Canadá se comunican anualmente numerosos brotes de intoxicación por este patógeno, constituyendo un importante problema de salud pública a nivel mundial5,6. A pesar de que SE apareció epidémicamente en Chile sólo en 1994 y en forma rezagada en relación a otros países afectados por la pandemia de infecciones por este agente7, ésta se ha manifestado en importantes brotes de toxiinfección alimentaria, de gran impacto público, especialmente en la Región Metropolitana (RM). Los alimentos mayoritariamente involucrados han sido mayonesa de elaboración propia (no comercial), torta de merengue, huevos, alimentos de banquetes y postres de leche entre otros (comunicación personal, Dra. Verónica Solari, Departamento de Vigilancia Sanitaria, SESMA).

Salmonella enteritidis ha sido detectada en muestras de alimentos avícolas asociados a estos brotes, aunque su presencia no permite establecer la frecuencia de la contaminación en huevos o carnes de ave en venta y de esta manera estimar el riesgo de salud de la población. Tampoco se conoce si la contaminación es debida a un grupo restringido de bacterias o a varios subtipos provenientes de diferentes fuentes infectantes. Este estudio fue diseñado para contestar estas interrogantes, determinando la frecuencia de contaminación por SE en productos avícolas en venta en la RM y además realizando un estudio de fagotipificación bacteriana para orientar el análisis epidemiológico. Los resultados de este estudio son importantes para la elaboración de campañas de prevención en los consumidores y para apoyar a organismos estatales y a productores y distribuidores en los programas de control y calidad de sus alimentos.

MATERIAL Y MÉTODO

Para el desarrollo de este trabajo se estudiaron muestras de huevos, carnes de ave y menudencias de pollo en venta libre en la RM. Los 3 tipos de productos se analizaron por separado debido a sus diferencias en las etapas de producción, distribución, almacenamiento, procesamiento y consumo. El muestreo incluyó diferentes niveles de venta y comercialización, desde distribuidoras de productos avícolas (carne o huevos), faenadoras de carne y supermercados. Las marcas comerciales fueron registradas, pero codificadas para la presentación de los resultados en este trabajo.

Tamaño muestral: El estudio de vigilancia en huevos fue establecido arbitrariamente en un mínimo de 1000 muestras debido a la falta de datos nacionales y a las frecuencias variables publicadas sobre contaminación por SE en huevos que pueden oscilar entre uno por 10.000 huevos a frecuencias cercanas al 1% o más3,8. El tamaño muestral para establecer la frecuencia de SE en carne de ave y menudencias de pollos, se estableció por un estudio previo en 100 muestras de carnes y menudencias de pollo que indicaron una positividad de 10% para SE. Asumiendo este antecedente, se determinó una muestra cercana a 1.000 para tener un bajo error de estimación (<2%) con un error a de 5%. El muestreo se llevó a cabo durante los años 1998 y 1999. Las muestras de huevos (cada una de 12 huevos) y de carne o menudencias de pollo (cada una de 250g) fueron tomadas aleatoriamente, en bolsas estériles y en forma aséptica, por el personal del SESMA. Las muestras de pollo, menudencias o huevos se transportaron refrigeradas al Laboratorio de Microbiología del SESMA en un plazo no mayor a 4 h. Se muestrearon huevos con no más de 8 días de oviposición.

Preparación de la muestra: Se pesaron en forma aséptica 12,5g de yema de huevo, 12,5g de cáscara o 25 g de carne y/o menudencias de pollo, depositando el contenido en bolsas estériles. Las muestras de yema de huevo se homogeneizaron con 112,5 ml de Caldo Tripticasa Soya (Difco) y las muestras de cáscara de huevo con un volumen equivalente de Caldo Tetrationato de Hajna (Difco) con solución de iodina al 4%. La muestra fraccionada de carne de pollo o menudencia fue homogeneizada en 225 ml del mismo caldo con yodo. Posteriormente se incubaron las bolsas a 37°C durante 18 h.

Detección microbiológica: Las muestras fueron analizadas por la técnica tradicional de detección microbiológica estandarizada por el Food and Drug Administration (FDA)9 y por una técnica de inmunodetección (VICAM, Massachusetts). Ambas técnicas tienen la misma sensibilidad analítica para detectar SE en yema de huevo (101 ufc/ml) y son 100% específicas para discriminar entre diferentes especies bacterianas. La sensibilidad analítica del cultivo tradicional es de 101 ufc de Salmonella por ml para cáscara de huevo y la de inmunodetección de 105 ufc/ml (datos provistos por fabricante).

A. Detección por cultivo tradicional: Luego de la incubación a 37°C, se transfirieron 100 µl del caldo a un tubo con 9,9 ml de Caldo Rappaport Vassiliadis (CRV) (Merck) y se incubó a 42°C durante 24 h. Este medio y la temperatura actúan en forma selectiva para potenciar el crecimiento de Salmonella. Desde el medio CRV, se traspasó un inóculo en asa a una placa de agar Salmonella-Shigella (Merck) y de agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato (XLD) (Difco) con Novobiocina al 0,12%. Ambas placas se incubaron a 37°C durante 24-48h y las colonias sospechosas sometidas a pruebas bioquímicas y seroagrupación con antisueros policlonales para Salmonella sp. del tipo O y Vi (Difco).

B. Técnica de inmunodetección magnética (VICAM®): Diez ml del caldo de las bolsas que contenían muestras homogeneizadas e incubadas, se filtraron a través de un papel Ederol N° 37 con el fin de eliminar restos macroscópicos de la muestra. Posteriomente 2 ml del filtrado fueron traspasados a un vial de captura estéril y se les adicionó 100 µl de perlas magnéticas cubiertas por anticuerpos monoclonales específicos para Salmonella sp, incubando el vial en rotación a temperatura ambiente durante 1 h. Los viales fueron colocados en un soporte magnético durante 10 min para permitir que las perlas magnéticas cubiertas con anticuerpos adheridos a Salmonella sp. se separen del resto de la muestra y se adhieran a la pared del vial. Se realizaron 3 lavados de acuerdo a las instrucciones del fabricante utilizando reactivos comerciales. Finalmente, el imán fue retirado liberando las perlas magnéticas de la pared del vial y 200 µl de solución buffer fueron adicionados a cada vial. La mezcla fue sembrada en placas XLD-Novobiocina al 0,12% e incubadas a 35°C durante 24 h. Las colonias sospechosas fueron confirmadas nuevamente por pruebas bioquímicas y seroagrupación policlonal para antígenos somáticos y antisuero capsular Vi (Difco).

Identificación definitiva de Salmonella enteritidis: Tanto las cepas obtenidas por cultivo tradicional como por inmunodetección fueron derivadas al Centro de Referencia de Enterobacterias en el Instituto de Salud Pública y confirmadas como Salmonella serotipo enteritidis mediante aglutinación con antisueros somáticos y flagelares.

Fagotipificación. Esta técnica de marcación bacteriana fue realizada de acuerdo a procedimientos estandarizados previamente publicados10. Sólo se analizaron las muestras avícolas del año 1998 (88% de los aislamientos de SE identificados).

RESULTADOS

Detección de SE en huevos. Un total de 1081 muestras de huevos en venta en la RM fueron analizados, incluyendo 23 marcas comerciales, distribuidores o huevos expendidos por supermercados bajo su propio nombre comercial. Salmonella enteritidis fue detectada en una de las muestras, en la fracción correspondiente a la yema del huevo, determinando una frecuencia de contaminación de 0,09%. El aislamiento positivo fue detectado en octubre de 1998 en una muestra bajo la marca comercial de un supermercado y expendida en un local del sector oriente de la RM. No se detectó SE en las cáscaras analizadas. El aislamiento de SE fue pesquisado bajo la técnica de inmunodetección pero no por la técnica de cultivo tradicional.

Detección de SE en carne de ave y menudencias de pollo. Se analizaron en total 1524 muestras, de las cuales 1154 (75,7%) fueron de carne de pollo y 370 (24,2%) correspondieron a menudencias de esta misma especie. Las muestras correspondieron a 9 marcas comerciales. De las 1524 muestras analizadas, en 144 (9,44%) muestras se identificó Salmonella sp. De éstas, 108 (7,08%) correspondieron a SE (Tabla 1). Sólo una de las 9 marcas comerciales estuvo libre de contaminación por Salmonella sp. El rango de contaminación osciló entre 1% y 15,5% con un valor promedio de 6,8% por marca. Las muestras de menudencia de pollo fueron más frecuentemente positivas a Salmonella sp. y a SE en relación a las muestras de carne de pollo (Tabla 2). Esta diferencia resultó significativa por la prueba de diferencia de proporciones (p=0,0077 para diferencia en la frecuencia de aislamientos de Salmonella sp. y p=0,0061 para la diferencia en la frecuencia de aislamientos de SE). La mayor parte de los 144 aislamientos de Salmonella identificados en las muestras de carne de ave y menudencias correspondieron a aislamientos de S. enteritidis (n=108, 75% del total). Los restantes aislamientos se distribuyeron en diferentes serotipos o serogrupos tal como se aprecia en la Tabla 3. Los serotipos Heidelberg, Hadar, Cerro e Infantis fueron los más frecuentes y constituyen 18% del total identificado. Los restantes serotipos o serogrupos fueron identificados infrecuentemente y algunos de ellos no pudieron ser tipificados en detalle.


Del total de las muestras de carne de ave y menudencias, 620 (40,7%) fueron tomadas en supermercados; 370 (24,3%) en plantas faenadoras; 294 (19,3%) en distribuidoras de abarrotes o carnicerías y 240 (15,7%) en distribuidoras avícolas. La frecuencia de aislamientos de Salmonella sp. y de Salmonella enteritidis fue significativamente mayor en las plantas faenadoras y distribuidoras de abarrotes que en supermercados y distribuidoras avícolas (por ej. p=0,0005 entre plantas faenadoras y distribuidoras avícolas) (Tabla 4).

Los aislamientos de Salmonella sp y de SE demostraron una declinación significativa entre 1998 y 1999 (Figura 1). La reducción alcanzó 61% para los aislamientos totales de Salmonella y 80% para los aislamientos de SE. El porcentaje y número de aislamientos de otros serotipos diferentes a SE no varió significativamente entre 1998 y 1999, tal como se aprecia por las curvas paralelas en la Figura 1 (2% en 1998 y 2,8% en 1999 de aislamientos no pertenecientes al serotipo enteritidis, p=0,31).

FIGURA 1. Muestras de carne de ave y menudencias de pollo positivas a Salmonella sp. y Salmonella enteritidis según año de muestreo.
La diferencia observada entre los valores de Salmonella sp. para los años 1998 y 1999 y en los valores de Salmonella enteritidis entre 1998 y 1999 fue significativa (p<0,0001, prueba bilateral de diferencia de proporciones).

Fagotipificación. El aislamiento de SE identificado en una muestra de huevo pertenecía al fagotipo 1. Los 96 aislamientos avícolas del año 1998 se distribuyeron en 9 fagotipos totales con un aislamiento con una cepa atípica y otra no tipificable. Dos fagotipos predominantes fueron identificados, correspondientes a los tipos 4 y 7 con 59% y 25% del total, respectivamente (Tabla 5). Los otros fagotipos fueron identificados sólo ocasionalmente.

DISCUSIÓN

Mundialmente SE ha sido implicada como agente causal en brotes de intoxicación alimentaria, hecho que ha sido reportado en numerosos trabajos de investigación24,11. La importancia de estas infecciones en la salud de la población, su fuerte asociación con productos avícolas y la ausencia de medidas terapéuticas efectivas7, hacían necesario evaluar el potencial riesgo de consumo en productos avícolas contaminados por SE en venta libre en la Región Metropolitana.

Los resultados de este trabajo demuestran la circulación de SE en huevos, carne de ave y menudencias de pollo en venta en la RM. Esta contaminación establece un riesgo de salud para la población y refuerza la necesidad de iniciar una política que regule y controle la calidad de este tipo de alimentos en Chile. Para ello será necesario establecer medidas de control de estos alimentos a nivel de la producción, procesamiento, transporte y almacenamiento en sitios de venta; como asimismo una campaña educativa en la población que enfatice la forma de almacenamiento y cocción de este tipo de productos.

El porcentaje de aislamiento de SE en las muestras de huevos analizadas alcanzó 0,09%, equivalente a una de cada 1000 muestras de huevo contaminadas por SE. El porcentaje de aislamiento de SE en la muestra de huevos analizada es significativo debido al alto consumo de huevos que supera los 6.000.000 de unidades al día en promedio12. A pesar de que el porcentaje de esta cantidad que se consume directamente por la población es desconocido y que no es destinado a productos derivados industriales como la mayonesa, el volumen de consumo y la frecuencia de contaminación indica una elevada exposición de la población. Por otra parte el modesto tamaño muestral podría subestimar la frecuencia de contaminación, el que de ampliarse podría indicar que no una sino varias marcas comerciales podrían estar contaminadas. Esta posibilidad queda sugerida por datos obtenidos en un estudio transversal del SAG en pequeños y medianos productores de huevos en 1997, que detectó la presencia de SE en varios planteles avícolas destinados a la producción de huevos. Además, estudios de marcación microbiológica realizados por los autores han identificado una diversidad y clonal en los aislamientos clínicos y por lo tanto la existencia de varias fuentes infectantes operativas en nuestro país (XVI Congreso Chileno de Infectología, Pucón, agosto de 1999).

La frecuencia de contaminación de los huevos por SE en esta muestra se ubica dentro del amplio rango reportado por diversos estudios en otras latitudes3,8,13. Estudios en Inglaterra y Gales indican una frecuencia de 0,00014%13. Estimaciones en Estados Unidos señalan una frecuencia de una unidad contaminada en cada 10.000 huevos8 y otros estudios han encontrado valores cercanos al 1%3. Las variaciones encontradas en parte son explicadas por la metodología empleada, la que puede estar enfocada a conocer el nivel de contaminación en huevos de planteles conocidamente afectados por SE, a estimaciones nacionales o a estudios en muestras tomadas al azar como el de este trabajo. El hallazgo de SE en la yema del huevo y no en su superficie, respalda el concepto de contaminación transovárica del huevo en el sitio de producción14. La contaminación superficial generada durante la oviposición o por vía horizontal luego de la postura ocurre con frecuencias variables15,16 y es también en parte responsable del problema. Por ello, la industria avícola internacional ha intentado evitar esta contaminación mediante diversas estrategias de lavado8 para disminuir el riesgo. Sin embargo, en nuestro país coexisten diferentes realidades industriales y comerciales que incluyen la presencia de muestras con restos de fecas en la superficie de los huevos o incluso la venta de huevos quebrados a un precio menor. Esta situación es crítica porque al estar la cáscara quebrada o sucia, facilita la entrada de microorganismos, los que se multiplican y logran una alta dosis infectante. La coexistencia de formas de contaminación transováricas y horizontales en nuestro país, indican que se requerirá un gran esfuerzo de control, regulación y educación.

El origen comercial de la muestra contaminada no pudo ser definido en detalle debido a que se expendía bajo el nombre comercial de una cadena de supermercados y adquirido a través de una compleja red de comercialización que impide conocer el lugar físico donde ocurrió la oviposición. Esta red hará más laboriosa la fiscalización, rastreo y control epidemiológico de estas infecciones y obligará a buscar fórmulas legales que permitan identificar el lugar físico de la postura de las muestras contaminadas por SE o al menos el de su adquisición.

La baja carga bacteriana de SE que contamina inicialmente los huevos tiene oportunidades de amplificarse a medida que transcurren los días desde la postura, por agotamiento de los mecanismos naturales de control microbiológico al interior del huevo y especialmente si no se incorporan cadenas de frío que inhiban el crecimiento bacteriano y por ende la dosis infectante antes del consumo. Estos dos aspectos, tiempo de oviposición y cadenas de frío, son ampliamente regulados en países desarrollados. Nuestro país permite la comercialización del huevo hasta un mes desde su fecha de elaboración, pero no incorpora por ahora la obligación de contar con cadenas de frío desde su producción y tampoco ha educado a la población sobre continuar con esta cadena en su domicilio. Debido a que el Ministerio de Salud no recomienda conservar huevos por más de tres semanas a partir de la fecha de compra, la población podría estar consumiendo huevos de más de 50 días desde la oviposición y en muchos casos sin refrigeración durante todo este período. La importancia de la refrigeración como forma de control de SE ha sido establecida en varios estudios que demuestran como el enfriamiento y el almacenamiento a bajas temperaturas protegen a los huevos de la penetración por SE17. En contraste, el almacenamiento a temperatura ambiente permite la penetración de SE en tan sólo 3 días18. La penetración de SE está correlacionada también con el nivel de contaminación superficial y el tiempo transcurrido desde la oviposición19.

La contaminación de carne de ave y menudencias de pollo por SE resultó ser amplia y extensa, abarcando a casi todas las marcas comerciales incluidas en el estudio. La frecuencia de esta contaminación cae dentro de los amplios márgenes comunicados por otros autores en países tales como Tailanda, Reino Unido y Estados Unidos20-22. La contaminación de estos productos puede ocurrir en los propios planteles avícolas y especialmente amplificarse en los procesos de faenamiento, empaque o distribución, tal como lo revela el hallazgo de un mayor grado de contaminación en las plantas faenadoras y en los distribuidores minoristas. La mayor frecuencia de aislamientos en menudencias de pollo en relación a la carne de ave puede indicar a su vez la importancia que tienen las vísceras infectadas por SE o la mayor manipulación y mezcla que ocurre con el procesamiento de estos productos.

Otros serotipos de Salmonella fueron detectados en las muestras de carne de ave y menudencias de pollo en este estudio, especialmente los serotipos Heidelberg, Hadar, Cerro e Infantis. Su presencia estable a pesar de la disminución observada en los aislamientos de SE entre 1998 y 1999, puede indicar una contaminación cruzada desde productos porcinos o bovinos en los sitios de faenamiento, procesamiento o en vitrinas de venta. Algunos autores han indicado al serotipo Hadar como el más frecuente en carne de pollo21. La diversidad de serotipos de Salmonella en estas muestras indica un vehículo de transmisión posible que podría explicar los casos esporádicos de infecciones humanas por estos serotipos pesquisados anualmente en el Centro de Referencia de Enterobacterias del ISP.

La caída significativa en la frecuencia de aislamientos positivos de SE en muestras de carne y menudencias de pollo observada en 1999, coincidió con la realización de sumarios sanitarios por parte del SESMA durante el año 1998 y coincide, además, con el impacto público que causaron varios brotes observados en la RM. La naturaleza de las medidas que explican esta caída es desconocida para los autores, pero obedece probablemente a la adición de compuestos químicos o antibióticos, esta última no prohibida en nuestro código sanitario. Esta caída coincidió además con la falta de desarrollo de coliformes en las placas de las muestras analizadas, lo que indica el uso de compuestos con un amplio espectro antimicrobiano, descartando el efecto específico de vacunas. El uso de antibióticos para controlar la colonización por Salmonella no está penado en todos los países desarrollados, pero ha dejado desastrosas consecuencias en aquellos lugares donde se ha utilizado, por la selección de cepas altamente resistentes que inevitablemente se "filtran" al ambiente clínico23-25. Hasta ahora los aislamientos disponibles no indican la aparición de cepas resistentes en nuestro medio (XVI Congreso Chileno de Infectología, 1999).

Los resultados obtenidos en este trabajo fueron informados periódicamente a las instancias pertinentes del SESMA, organismo que aplicó medidas de inspección y supervisión a nivel de los diversos eslabones de producción incluidas plantas faenadoras, distribuidoras de productos avícolas y locales de procesamiento de alimentos, las que fueron sometidas a sumarios sanitarios y sanciones judiciales; todo ello con el objetivo de asegurar al consumidor la entrega de un producto de elevada calidad sanitaria y de minimizar el riesgo de enfermedad en nuestra población.

El análisis epidemiológico fue complementado con técnicas de marcación bacteriana para discriminar entre aislamientos no relacionados y facilitar el rastreo hacia las fuentes de origen. Diversas alternativas han sido aplicadas con este propósito en SE, entre ellas la fagotipificación10, la electroforesis de campos pulsados usando enzimas de corte infrecuente y la ribotipificación entre otras26-28. La fagotipificación tiene la ventaja de ser una prueba fenotípica de fácil realización y que ha sido aplicada sobre un gran número de cepas a nivel mundial, permitiendo estudios comparativos. Su desventaja radica en su bajo poder discriminatorio por el predominio de unos pocos fagotipos en una población. La aplicación de esta técnica de marcación sobre la mayor parte de los aislamientos de SE obtenidos en este trabajo, indicó la presencia de varios fagotipos lo que establece una diversidad biológica y la circulación y exposición de SE desde varias fuentes infectantes. El hallazgo de los fagotipos 1 y 4 es concordante con los fagotipos de mayor relevancia identificados entre los aislamientos clínicos. En contraste, la alta frecuencia del fagotipo 7 (25%) sobrepasa los bajos valores observados entre los aislamientos clínicos (1%) (XVI Congreso Chileno de Infectología). Estas diferencias podrían ser explicadas por una menor capacidad adaptativa de ciertos tipos bacterianos para invadir o persistir en el ser humano.

Correspondencia a: Dra MV Marcela Alexandre S. Laboratorio de Microbiología, SESMA, San Diego 630 piso 8, Santiago. email: m_alexandre@yahoo.com

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