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Revista médica de Chile

versão impressa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.129 n.2 Santiago fev. 2001

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872001000200003 

Autoanticuerpos dirigidoscontra productos de glicación avanzada en pacientes con diabetes mellitus tipo 1

Antibodies against advanced
glycation end products in patients
with type 1 diabetes mellitus

Margarita González R1, Christine Paquién M2,
Sylvia Asenjo M, Andrea Gleisner E, Lilian Kirsten L3,
Marcelo Bustamante C4

Background: Advanced glycation end products are associated with chronic complications of diabetes mellitus. This glycation process renders many proteins immunogenic. Aim: To detect the presence of antibodies against albumin, collagen and low density lipoprotein glycation products in boys and teenagers with diabetes mellitus. Patients and methods: Thirty one patients with diabetes mellitus type I, aged 11±3.8 years and with a mean duration of disease of 3.7±2.7 years and 31 healthy controls aged 12.4±5.3 years were studied. Antibodies against glycation end products were detected by ELISA and results were expressed as a ratio of the optical density of the glycated protein/optical density of the native protein. Results: Diabetic patients and healthy controls did not have antibodies against albumin glycation end products. Diabetics had higher levels of antibodies than controls for collagen glycation end products (2.6±0.4 and 1.8±0.2 respectively, p< 0.01) and low density lipoprotein glycation end products (3.07±0.92 and 2.2±0.72 respectively, p< 0.05). Conclusions: The biological role of these antibodies is not clear. They could be a depuration mechanism for glycation end products or contribute to chronic complications of diabetes mellitus (Rev Méd Chile 2001; 129: 141-48).
(Key-words: Antibodies; Diabetes mellitus, insulin-dependent; Glycosylation and products)

Recibido 18 abril, 2000. Aceptado en versión corregida 27 noviembre, 2000.
Trabajo financiado por Proyecto 99.072.020 - 1.0 Dirección de Investigación.
Universidad de Concepción. Chile.
Departamento de Bioquímica Clínica e Inmunología. Facultad de Farmacia.
Departamento de Pediatría. Facultad de Medicina. Departamento de Estadística.
Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas. Departamento de Biología Molecular.
Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad de Concepción. Chile
1 Bioquímico. MSc. Inmunología
2 Tesista de Bioquímica
3 Magíster en Estadística
4 Bioquímico. PhD

La glicación no enzimática de proteínas origina productos tempranos de glicación (productos de Amadori), los cuales posteriormente en la etapa irreversible de la reacción se transforman en productos finales de glicación avanzada (AGEs). Este proceso se encuentra exacerbado en los pacientes diabéticos como consecuencia de la hiperglicemia y constituye un factor determinante de las complicaciones crónicas y de la mayor morbimortalidad que presentan estos pacientes1.

Ha sido demostrado que los niveles de glicación están correlacionados con el grado de control glicémico2. Los cambios inducidos por glicación conllevan una modificación irreversible de las proteínas, éstos han sido estudiados principalmente en proteínas estructurales dado que por su bajo recambio, los AGEs de estas proteínas pueden ser acumulados en varios tejidos3.

La modificación de las propiedades físico químicas del colágeno debido a glicación, conduce a complicaciones en el paciente diabético como la disfunción de capilares retinales, del tejido renal y del sistema cardiovascular. Se postula que, en el riñón del paciente diabético, la acumulación de AGEs en la matriz extracelular glomerular contribuye a la nefropatía diabética4.

En relación con la mayor frecuencia de aterogénesis en el diabético, está comprobado que las lipoproteínas modificadas por glicación son captadas por receptor scavenger de macrófagos transformándolos en células espuma, lo que sería el punto de partida de la placa ateromatosa5.

En la última década, las evidencias experimentales involucran al sistema inmune en la patogénesis de la aterosclerosis, tanto en pacientes con enfermedad coronaria como en diabetes mellitus6. En relación con esto, está descrito que la remoción de proteínas-AGE es facilitada por receptores de superficie presentes en monocitos-macrófagos, células endoteliales, células mesangiales, fibroblastos y células neurales7,8,9. Esta interacción AGE-receptor AGE induce respuestas biológicas importantes como son: quimiotaxis, activación celular, secreción de citoquinas y factores de crecimiento tales como: factor de necrosis tumoral (TNF), interleuquina -1 (IL-1), interleuquina - 6 (IL-6), el factor de crecimiento insulinosímil (IGF-1) y el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF). Los procesos mediados por estas citoquinas dependen de las células a las cuales pertenece el receptor y la intensidad de la respuesta es función de la concentración de AGEs presentes en los tejidos.

Considerando que el proceso de glicación de proteínas puede hacerla inmunogénica e inducir la generación de respuesta inmune10, el propósito de este trabajo es determinar los niveles de autoanticuerpos dirigidos contra productos de glicación avanzada en pacientes diabéticos tipo 1.

MATERIAL Y MÉTODO

Pacientes. Se estudiaron 31 pacientes con diabetes mellitus tipo 1 con edad 11 ± 3,8 años (rango 5 - 18 años), duración de la diabetes 3,7 ± 2,7 años. Los sujetos control fueron 31 voluntarios con edad 12,4 ± 5,3 años (rango 4 - 21 años). En relación con las complicaciones crónicas sólo 3 pacientes presentaron microalbuminuria.

A todos se les determinó glicemia, colesterol total, colesterol-HDL, colesterol-LDL y triglicéridos. Hemoglobina glicosilada solamente a los pacientes diabéticos (Tabla 1). Se midió autoanticuerpos séricos anti: albúmina (HSA-AGE), colágeno (Cg-AGE) y lipoproteínas de baja densidad (LDL-AGE) en los diabéticos tipo 1 y en los sujetos control. Todos estaban en conocimiento informado y este trabajo fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Concepción.


Preparación de las proteínas-AGE (P-AGE): Albúmina sérica humana (HSA) (Sigma) 50 mg/ml y Colágeno (Cg) (tipo VII de tendón de rata, Sigma) 0,2 mg/ml fueron incubados con glucosa 6 fosfato (G 6P) 100 mM, en tampón fosfato salino (PBS) 0,2 M, pH 7,4 suplementado con EDTA 1 mM, inhibidores de proteasas y antibióticos, en oscuridad durante 83 días a 37°C y en condiciones estériles11. Las LDL, purificadas en nuestro laboratorio según protocolo estandar12 en concentración de 2 mg de proteínas/ml fueron incubadas con G 6P, en idénticas condiciones a las anteriores, durante 14 días13. Las respectivas proteínas controles (HSA c, Cg c y LDL c) fueron preparadas en idénticas condiciones a las P-AGE, pero en ausencia de G 6P. Las modificaciones producidas por los procesos de glicación avanzada fueron verificadas mediante emisión de fluorescencia14 con excitación a 370 nm y emisión a 440 nm (Espectrofluorímetro Shimadzu RF 53-5301 PC, Shimadzu Corporation, Japón) y mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% para HSA-AGE y al 2% para LDL-AGE. En la Tabla 2 se muestra el aumento en la emisión de fluorescencia (EF) de los compuestos glicados comparado con la EF de la proteína control respectiva. Para HSA control la variación en la E.F. fue de 140 unidades relativas (UR) y para HSA-G 6P de 589 UR Colágeno control presentó una variación de 120 UR y para colágeno-G 6P fue 530 UR; en el caso de LDL control se obtuvo variación negativa de - 164 UR y para LDL-G 6P se obtuvo 278 UR. Esta modificación fue confirmada por el aumento en la movilidad electroforética (Figura 1), obteniendo los siguientes coeficientes de movilidad (Rf): HSA control y nativa = 4,1 y HSA-G 6P = 5,6 (Figura 1A). LDL nativa = 1,1; LDL control = 2,0 y LDL-G 6P = 2,5 (Figura 1B). Al no estar protegida de la oxidación la LDL control se oxidó, hecho confirmado por la emisión de fluorescencia y el aumento en la movilidad electroforética, lo cual no sucedió a la LDL en presencia de G 6P. Cabe destacar que en las condiciones electroforéticas utilizadas, el colágeno y sus productos glicados no pueden ser analizados. Por lo tanto, se consideró la variación de fluorescencia como medida demodificación.



FIGURA 1. Electroforesis en gel de agarosa para albúmina (A) y para LDL (B).
Carril 1: HSA nativa (1A) y LDL nativa (1B). Carril 2: HSA control (2A) y LDL control (2B). Carril 3: HSA-AGE (3A) y LDL-AGE (3B). La corrida electroforética fue realizada a 70 Volt durante 2 h y los geles fueron teñidos con Azul de Coomasie.

Determinación de anticuerpos anti P-AGE: Los anticuerpos (Acs) séricos fueron determinados por enzima inmuno ensayo (ELISA) de acuerdo al método descrito por Craig y col15 modificado. En breve, placas de micropocillos fueron sensibilizadas con 15 µg/ml de proteína-AGE (o proteína nativa), luego de bloquear se adicionó el suero de paciente (o de sujetos control) en dilución 1/100, revelando la unión con anticuerpos antiglobulinas humanas conjugado con peroxidasa. Cada determinación fue realizada en triplicado leyendo Densidad Optica (DO) a 490 nm y los resultados expresados como el cuociente DO P-AGE / DO P- nativa; la proteína nativa corresponde a la proteína utilizada sin procesamiento alguno. Un cuociente≤ a 1 significa ausencia de anticuerpos. El coeficiente de variación inter e intraensayo de la técnica fue de 10 y 8% respectivamente.

Análisis estadístico: Para comparar los datos clínicos e inmunológicos se utilizó prueba t de Student con muestras independientes.

RESULTADOS

En relación con la determinación de autoanticuerpos, la Tabla 3 muestra los valores individuales y la Figura 2, los promedios obtenidos para cada proteína glicada en los dos grupos en estudio. Los resultados de los ELISA expresados como cuociente D.O. Proteína-AGE/ D.O. Proteína-nativa, demuestran que: para HSA-AGE se obtuvo valores similares para ambos grupos, con rangos que fluctúan desde 0,67 hasta 1,56 para los sujetos control y desde 0,94 hasta 1,71 para los pacientes diabéticos, con promedios de 1,19 ± 0,20 y de 1,26 ± 0,16, respectivamente. En cambio, para Cg-AGE se obtuvo niveles de autoanticuerpos diferentes. Los valores individuales fluctúan desde 1,44 hasta 2,28 para los sujetos control y niveles más altos desde 1,96 a 3,65 para los pacientes diabéticos, con promedios de 1,80±0,20 y 2,60±0,44, respectivamente (p<0,01). En relación con la respuesta anti LDL-AGE, también se obtuvo niveles de anticuerpos diferentes. Siendo los valores individuales desde 1,07 hasta 3,47 para los sujetos control y desde 1,50 hasta 4,88 para los pacientes diabéticos, los promedios obtenidos fueron 2,20±0,72 y 3,07±0,92, respectivamente (p<0,05).



FIGURA 2. Promedio de los autoanticuerpos séricos anti Proteínas-AGE en pacientes con Diabetes Mellitus tipo 1 (barra achurada) y en sujetos control (barra abierta). Los niveles de anticuerpos fueron determinados mediante técnica de ELISA usando como antígenos: Albúmina humana glicada (HSA-AGE) y HSA sin modificar o nativa; Colágeno glicado (Cg-AGE) y colágeno nativo; Lipoproteínas de baja densidad glicada (LDL-AGE) y LDL nativa. Se informa el cuociente densidad óptica proteína - AGE/ densidad óptica proteína nativa. Cada determinación fue realizada en triplicado.

DISCUSIÓN

El aumento en la fluorescencia, característica de los AGEs, apoya nuestros resultados como un indicador del nivel de modificación proteica por glucosa16. El análisis en geles de agarosa permitió evaluar la modificación de las LDL y HSA, observando aumento en la movilidad; esto significa pérdida de cargas positivas, hecho conocido en proteínas modificadas17. La inmunodetección de LDL-AGE con anticuerpos monoclonales anti LDL glicada producidos en nuestro laboratorio18, que reconocen productos de Amadori, no dio resultados positivos, indicando que la LDL fue glicada irreversiblemente hasta formar AGEs (datos no mostrados).

Dado que las P-AGEs son reconocidas como extrañas por el organismo, es posible que nuevos epítopos formados en las proteínas - AGEs sean presentados a los linfocitos T, induciendo respuesta inmune19. Diversos autores han informado que los carbohidratos conjugados a proteínas son importantes en la inmunogenicidad de éstas y que productos glicados de albúmina y LDL son inmunogénicos20. Esto podría explicar los niveles de autoanticuerpos aumentados hacia algunas P-AGE presente en los pacientes diabéticos en estudio.

Aunque la glicación no enzimática de proteínas plasmáticas y celulares está involucrada en los mecanismos normales de envejecimiento, los estudios de Berg y colaboradores en 199721 revelan que ya a temprana edad se manifiesta el proceso irreversible de glicación de proteínas. Estos autores demuestran la presencia de proteínas - AGE en niños y adolescentes tanto no diabéticos como portadores de diabetes tipo 1, presentando éstos mayor concentración de productos de glicación avanzada. Estos compuestos podrían inducir la formación de autoanticuerpos lo que concuerda con lo demostrado por nosotros para los niños y adolescentes (Figura 2) y por los estudios de Menzel y col22.

Los resultados de la detección de autoanticuerpos fueron expresados como el cuociente D.O. P-AGE/ D.O. P-nativa debido a la reactividad basal observada contra proteínas nativas22. En relación con la técnica de ELISA, el coeficiente de variación inter e intra ensayo obtenido es similar al descrito por Berg y col21.

La ausencia de anticuerpos contra HSA-AGE demostrada en este trabajo (Figura 2) indica que la presencia de HSA-AGE, demostrada en pacientes diabéticos23, no sobrepasaría los mecanismos de tolerancia inmunológica establecidos para albúmina.

Si bien la presencia de Cg- AGE ha sido demostrada en pacientes diabéticos; la existencia de autoanticuerpos anti Cg-AGE aún no ha sido informada en la literatura revisada.

En relación con los autoanticuerpos anti LDL-AGE, se encontró diferencias en las poblaciones estudiadas al compararlos con sus controles respectivos. En pacientes con diabetes mellitus tipo 1 se ha detectado la presencia de complejos inmunes anti cardiolipina, anti LDL oxidada24 y anti LDL glicada25. Estos complejos inmunes podrían ser captados por los macrófagos e inducir de esta forma la generación de células espuma26. También pueden ser depurados por el sistema monocito-macrófago del bazo, hígado y médula ósea. Sin embargo, está descrito que las modificaciones oxidativas y químicas resultantes de la glicación avanzada afectan la depuración de la LDL, siendo la degradación lisosomal de LDL-AGE en los macrófagos mucho más lenta que la degradación de LDL oxidada o acetilada27; este hecho podría favorecer la formación de células espuma. Es de interés realizar otros estudios para dilucidar el rol de estos autoanticuerpos y de sus respectivos complejos inmunes.

Correspondencia a: Margarita González R. Departamento de Bioquímica Clínica e Inmunología. Facultad de Farmacia. Universidad de Concepción. Casilla 237. Concepción. Chile. FAX 56 41 231903 e-mail: magonzal@udec.cl

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