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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.129 n.5 Santiago mayo 2001

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872001000500003 

Efecto de enzimas proteolíticas y de la
abstinencia sexual en la cuantificación
bioquímica de alfa-glucosidasa en plasma
seminal humano

Effects of proteolytic enzymes and sexual
abstinence on a-glucosidase levels
in human seminal plasma

Patricio Peña S1,2, Raúl Sánchez G, Bélgica Vásquez P1,3,
Claudia Castillo K1, Werner Miska4

Background: a-glucosidase is found in human seminal plasma as an acid form, located in accessory glands, and as a neutral form secreted almost exclusively by the epididymis. Quantification of a-glucosidase activity is a marker of the secretory function of the epididymis and indemnity of the sperm transport pathway Aim: To obtain reference values for a-glucosidase in normal samples of seminal plasma, to evaluate its behavior in serial samples and to determine the effect of proteolytic enzymes. Material and methods: Fifty donors, with normal semen analysis according to the criteria of the World Health Organization, were evaluated. For the study with alpha-quimotrypsin, 0.1 to 10 mg/ml of the enzyme was added to the seminal plasma from a group of donors. a-glucosidase was also measured in semen obtained from nine patients at different time intervals. Results: Normal a-glucosidase values ranged from 14.52 to 25.69 µU/ml. Concentrations up to 10 mg/ml of alpha-quimotrypsin (10 times of that usually used in the liquefaction of the semen) did not alter the quantification of a-glucosidase. Serial determinations revealed oscillations in their magnitude, which stayed in each patient's characteristic range. However a subgroup presented a marked reduction of the activity of a-glucosidase as the abstinence diminished (40%). Conclusions: Evaluation of a-glucosidase in seminal plasma gives reliable information of the secretor state of the epididymis and especially replaces invasive methods used to evaluate the indemnity of the spermatic transport from the epididymis to the anterior urethra. (Rev Méd Chile 2001; 129: 489-93)
(Key-words: Epididymis; Glucosidases; Semen; Semen preservation)

Recibido el 18 de diciembre,2000. Aceptado en versión corregida el 16 de enero, 2001.
Fuente de financiamiento: Programa MECE-SUP FRO-98, Proyecto: "Fortalecimiento de la
capacidad Científica Tecnológica y Productiva Regional". Dirección de Investigación
(9735-9820), Universidad de La Frontera Temuco, y DFG-GTZ-93.2157.106.100.
Departamento de Ciencias Básicas, Departamento de Ciencias Preclínicas y Centro de Biotecnología en Reproducción, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile.
Departamento de Andrología, J-L-Universität Giessen, Alemania.
1Tecnólogo Médico, 2MCS, 3Licenciado en Ciencias

El epidídimo humano posee un epitelio pseudoestratificado capaz de secretar diversas proteínas que están presentes en el plasma seminal1. Entre ellas, la enzima a-glucosidasa (EC. 3.2.1.1.20), la cual cataliza la producción de D-glucosa a partir de poli y oligosacáridos2. Aunque su función sobre el espermatozoide aún no es del todo dilucidada, se le ha relacionado directamente con su movilidad, y con la modificación de las glicoproteínas de superficie durante su tránsito epididimal3,4; que le conferirían la capacidad de unión a la zona pelúcida y a la penetración del ovocito5,6. Existen dos isoformas de esta enzima, una ácida (4s) originada en la próstata, y otra neutra (11s), que proviene exclusivamente del epidídimo, por lo cual se la considera a esta última como un marcador de su funcionalidad. La cuantificación de la actividad de la isoforma neutra, es de especial interés en el diagnóstico clínico. Se encuentran niveles disminuidos en pacientes con oclusión ductal, vasectomía o agénesis del conducto deferente1,2,7-12. Valores aumentados se han asociado con procesos infecciosos, silentes o activos13. Sin embargo, su mayor aplicación está en la posibilidad de utilizar esta enzima para diferenciar procesos obstructivos o sub-obstructivos en pacientes con oligozoospermia o azoospermia14. Esto implica su determinación en pacientes en los cuales estos cuadros se asocian a severas alteraciones en la licuefacción del semen. De ahí la importancia de evaluar si las enzimas proteolíticas utilizadas en licueficar el semen tienen efecto sobre la actividad de la a-glucosidasa y la variabilidad que esta enzima puede presentar en el plasma seminal de un mismo individuo dependiendo de los días de abstinencia sexual. Asimismo, es necesario determinar los valores normales para nuestra población.

Este estudio fue diseñado con los siguientes objetivos: 1) obtener valores de referencia de a-glucosidasa presente en el plasma seminal de donantes normales. 2) determinar en muestras de semen de donantes normales el efecto de la adición de la enzima proteolítica a-quimotripsina sobre la actividad de a-glucosidasa; y 3) evaluar el posible efecto de la duración de la abstinencia sexual sobre la actividad de la a-glucosidasa en muestras seriadas de pacientes del Programa de Criopreservación de Espermatozoides.

MATERIAL Y MÉTODO

Previa consulta y aprobación por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina, mediante consentimiento informado, se seleccionó los donantes para este estudio entre estudiantes de nuestra Universidad y pacientes que concurrían al Policlínico de Andrología, excluyéndose de él los sujetos con enfermedades previas y de transmisión sexual. La evaluación de a-glucosidasa se determinó en forma rutinaria en el plasma seminal de pacientes que requerían crioconservación de espermatozoides.

Determinación de valores de referencia. Se seleccionó a una población de donantes normales (n=50), según espermiograma sugerido por la Organización Mundial de la Salud (WHO)15, con edades que fluctuaron entre 19 y 46 años. Las muestras de semen se obtuvieron por masturbación con una abstinencia mínima de 2 días; una vez colectadas, se dejaron en estufa de cultivo a 37°C durante 30-60 min hasta su licuefacción. Inmediatamente se centrifugaron a 2000 r.p.m. en centrífuga clínica; el sobrenadante fue alicuotado y se mantuvo a -20°C hasta la realización del ensayo. La técnica de cuantificación enzimática16 se realizó con dodecylsulfato de sodio para eliminar la isoforma ácida9. La absorbancia de la reacción final fue medida a 405 nm en un espectrofotómetro Zeiss PM2D2. La actividad enzimática fue calculada de la curva estándar de p-nitrofenol (PNP) liberado del sustrato sintético pnitrofenol-a-D-glucopyranoside (PNPG). 1 unidad de a-glucosidasa= 1µMol de PNP producido por min. a 37°C. El coeficiente de variación inter e intra ensayo fue de 6.1% y 4.4% respectivamente. Los resultados fueron expresados en µU/ml. Los datos obtenidos se evaluaron estadísticamente por métodos paramétricos y no paramétricos17. Los valores de referencia se obtuvieron aplicando la fórmula: ± k * SD, con 95% de confianza. En los no paramétricos, se evaluó el percentil 2,5 y 97,5 con la ecuación r= 0,025 (n+1).

Efecto de a-quimotripsina sobre la actividad de a-glucosidasa. Se adicionaron concentraciones crecientes (desde 0,1 a 10 mg/ml) de a-quimotripsina18 a muestras de plasma seminal de donantes normales (n=6), que habían sido mantenidas a -20°C hasta el ensayo. Posteriormente se cuantificó la actividad de a-glucosidasa. El valor basal de cada donante se determinó previamente y se consideró como el 100% para ser comparado con los valores obtenidos de las muestras a las que se le adicionó a-quimotripsina.

Seguimiento de a-glucosidasa en muestras de plasma seminal obtenidas seriadamente. Las muestras seriadas fueron recolectadas de 9 pacientes, a través del Programa de Criopreservación de Espermatozoides del Laboratorio de Andrología, UFRO. Las muestras fueron agrupadas en tres grupos: el N°1 correspondió a abstinencia de 2 días, el N°2 a 4 días y el N°3 a 6 días desde el inicio, pero todas fueron tomadas sucesivamente, de tal forma que, entre ellas, la abstinencia correspondió siempre a 2 días. El procesamiento del plasma seminal fue según se describe previamente.

RESULTADOS

Determinación de valores de referencia. En donantes normales la actividad de la isoforma neutra de a-glucosidasa fue de 14,52 a 25,9 µU/ml (=19,32 µU/ml; SD=1,13; SEM=0,16) por métodos paramétricos. El rango normal fluctuó entre 15,85-23,46 µU/ml en el caso de los métodos no-paramétricos (Figura 1).


Figura 1. Determinación de valores de referencia en muestras de donantes normales (n=50). N° de donantes vs a-glucosidasa (µU/ ml).·: donantes normales; -: rango valores de referencia; -: media.

Efecto de enzimas proteolíticas. El uso de a-quimiotripsina en concentraciones crecientes de 0.1 a 10 mg/ml no modificó en forma significativa la actividad de a-glucosidasa (Figura 2). Considerando que se utilizaron concentraciones de hasta 10 veces la normalmente recomendada (1 mg/ml) para disolver el plasma seminal en pacientes que presentan alteración de la licuefacción.


Figura 2. Efecto de enzimas proteolíticas sobre la actividad de a-glucosidasa. Mg de a-quimotripsina por ml de plasma seminal vs media del porcentaje con respecto a la actividad enzimática basal de cada donante.

 

Seguimiento de a-glucosidasa en muestras de semen seriadas. La actividad de la enzima presentó una oscilación que fue característica para cada paciente y que se relacionó directamente con la clasificación de acuerdo a su normalidad o patología (Figura 3, muestra 1). En cambio se observó una disminución de la actividad en aquellas muestras que fueron tomadas con 2 días de abstinencia de la anterior (Figura 3, muestra 2). La disminución fue significativa (p< 0,001) cuando se tomó una tercera muestra, que conservó también 2 días de abstinencia entre ellas (Figura 3, muestra 3).


Figura 3. Seguimiento de la actividad de a-glucosidasa en muestras seriadas de semen v/s media de a-glucosidasa (µU/ml). La barra N°1, 2 y 3 representan las muestras sucesivas pero con intervalos de dos días de abstinencia entre ellas.

DISCUSIÓN

El análisis del plasma seminal entrega un importante apoyo al diagnóstico de diversas patologías que afectan el sistema reproductor masculino19. La cuantificación de la presencia de la enzima a-glucosidasa se correlaciona directamente con la función del epidídimo. Por tanto, niveles por sobre los valores de referencia estarían en directa relación con pacientes que cursan con una infección y niveles bajos, sugieren obstrucción o agenesia de los conductos deferentes, con valores cercanos a los que presentan los pacientes con vasectomía1. Para aplicar esta técnica en forma adecuada al laboratorio clínico fue necesario determinar los valores de referencia normales de la población chilena. En 50 muestras de voluntarios con un análisis seminal normal, se aplicó el método estadístico paramétrico, que con un tamaño muestral pequeño17 puede ser aplicable a la totalidad de la población estudiada. Los resultados obtenidos de un valor promedio normal de 19,32 µU/ml (SD=1,13; SEM= 0,16) fueron muy similares a los descritos para la población europea (20 µU/ml)16.

La principal utilidad de determinar esta enzima es que permite diferenciar procesos obstructivos o sub-obstructivos en pacientes con oligozoospermia o azoospermia, ya que valores normales se asocian a una falla testicular en la producción de espermatozoides20. El uso de enzimas proteolíticas (a-quimiotripsina) en muestras de pacientes con licuefacción alterada es necesario para la evaluación de la movilidad de los espermatozoides. Para ello, normalmente se utilizan concentraciones de 1 mg/ml de plasma seminal. En nuestro estudio, utilizando hasta concentraciones 10 veces mayores, la actividad de a-glucosidasa no fue alterada, obteniendo valores similares al control. Ello permite evaluar, entonces, la funcionalidad epididimaria aún en pacientes que presenten una marcada alteración en la licuefacción del semen. Estos resultados son promisorios ya que permitirían, además, determinar otras proteínas presentes en el plasma seminal y que en la actualidad no se evalúan por la imposibilidad de obtención de una muestra fluida. Otro factor necesario a considerar para una exacta interpretación del valor de esta enzima, es conocer su variabilidad entre muestras de semen sucesivas, considerando que existen importantes fluctuaciones entre mediciones en un mismo sujeto; no obstante, los valores se mantienen en rangos normales o patológicos21. En este estudio podemos concluir que si las determinaciones de a-glucosidasa, además de ser sucesivas, son muy cercanas en el tiempo, la actividad enzimática se ve notablemente disminuida, lo que sugiere que el aporte de nueva enzima al plasma seminal, por parte del epidídimo, es limitado y requiere de un tiempo de recuperación para alcanzar sus niveles basales. De ser así, sería de particular interés la consideración de los días de abstinencia en pacientes que van a procedimientos de inseminación intrauterina o fecundación in vitro, ya que los factores secretados por el epidídimo son importantes para una adecuada función espermática.

La determinación de a-glucosidasa en plasma seminal entrega una información confiable del estado secretor del epidídimo y especialmente reemplaza a métodos invasivos para evaluar la indemnidad del transporte espermático desde el epidídimo hasta la uretra anterior, descartando o confirmando procesos obstructivos. Asimismo, su determinación seriada podría ser importante para conocer la evolución de procesos inflamatorios agudos que comprometen la vía de transporte del espermatozoide en tanto a su efecto obstructivo o a su resolución posterior a la terapia correspondiente.

Correspondencia a: Prof. Dr. Raúl Sánchez G, Departamento de Ciencias Preclínicas, Facultad de Medicina Universidad de La Frontera; Casilla 54-D, Teléfono: (45) 325000; Fax: (45) 325777. E-mail: rsanchez@ufro.cl, Temuco-Chile.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Prof Dr Med Vet Roberto Matamoros, de la Escuela de Medicina Veterinaria de la UCTEM, por su valiosa colaboración en la edición en el idioma Inglés.

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