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Revista médica de Chile

versão impressa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.129 n.7 Santiago jul. 2001

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872001000700004 

Expresión de CD44 (HCAM)
en el carcinoma subseroso
de la vesícula biliar

CD44 (HCAM) expression in
subserous gallbladder carcinoma

Iván Roa E, Miguel Villaseca H, Juan Araya O, Juan Roa S,
Xabier de Aretxabala U, Gilda Ibacache S1 y
Marcela García V1

Correspondencia a: Iván Roa E. Casilla 54-D. Temuco, Chile.

Background: HCAM or CD44 is a multifunctional cell adhesion molecule, related to cell-cell, cell-extracellular matrix interactions and involved in tumor invasion. Aim: To study the importance of CD44 expression in subserous gallbladder carcinoma. Material and methods: One hundred five samples (93 female) of subserous gallbladder carcinoma and 33 non tumoral gallbladder were studied. CD44 was stained using the streptavidine-biotin technique, using human anti CD44 antibodies. Eighty subjects with carcinoma were followed for a period up to 105 months. Results: Mean age of patients was 62,6 years old, all tumors were adenocarcinoma, all were silent and 13% were well differentiated. CD44 was expressed in all controls and in 91%, the expression was normal. In 57% of cancer samples, CD44 expression was abnormal, in 50% it was less expressed and in 24%, it was not expressed. No differences in CD44 expression was observed between mucosa from control samples and mucosa adjacent to the tumor or superficial or deep tumoral areas. Global five years survival was 40%. No significant differences in survival were observed in those tumors with a lower of absent CD44 expression. Six patients with a higher expression died before 18 months of follow up. Conclusions: Nearly 50% of subserous gallbladder carcinomas show an abnormal CD44 expression (Rev Méd Chile 2001; 129: 727-34).
(Key-Words: Antigens, CD44; Carcinoma; Gallbladder neoplasm)

Recibido el 27 de febrero, 2001. Aceptado en versión corregida el 14 de mayo, 2001.
Trabajo financiado por Proyecto Fondecyt #1000350 y DIUFRO #1900.
Unidad de Anatomía Patológica y Citopatología Hospital Temuco. Departamento de Cirugía.
Facultad de Medicina. Universidad de la Frontera. Temuco, Chile.
1Tecnólogos Médicos

Está establecida la importancia del cáncer de la vesícula biliar en la población chilena1, así como su aumento sostenido en los últimos años, constituyéndose en una de las primeras causas de muerte por tumores malignos en la mujer chilena1-3.

En nuestra serie de 745 pacientes con cáncer vesicular los factores pronósticos de mayor importancia en esta neoplasia, son el nivel de infiltración tumoral de la pared y grado de diferenciación histológica. En menor grado el carácter inaparente de la lesión y la presencia de permeaciones vasculares linfáticas y sanguíneas (Roa 2000, datos no publicados).

El carcinoma subseroso de la vesícula biliar representa alrededor del 25% al 30% de todos los tumores, siendo un grupo heterogéneo y de pronóstico incierto4. En la actualidad no existen elementos demostrados que permitan predecir el comportamiento ni menos hay acuerdo acerca del tipo de tratamiento que demuestre un claro beneficio para los pacientes5-8.

Las características biológicas de las células tumorales explican parcialmente su agresivo comportamiento, así como su capacidad de producir metástasis. Otros factores que han ido cobrando importancia guardan relación con la expresión de moléculas de la matriz extracelular. Muchas de estas moléculas participan activamente en la comunicación intercelular y regulan la relación y comportamiento de la célula normal y tumoral9-12. Entre estas moléculas se encuentran las llamadas moléculas de adhesión celular (MAC), las que regulan la adhesión de una célula con otra y los mecanismos de comunicación entre las células y de las células con la matriz extracelular que las rodea. En condiciones de normalidad este balance permite un armonioso crecimiento y mantención de los tejidos. Sin embargo, se ha demostrado que en múltiples neoplasias, esta regulación y control se pierde con una anormal expresión de estas MAC6 como en el estómago13, próstata14, mama15, y otros16-18. Por otro lado, se ha demostrado en algunas neoplasias la relación entre la expresión de algunas de estas moléculas de adhesión celular y la capacidad de dar metástasis11,13.

Una de estas familias de MAC es la superfamilia de las inmunoglobulinas, que incluye a un gran número de moléculas con acentuada diversidad estructural y funcional y que mantienen características básicas de las inmunoglobulinas12,19,20. El dominio Ig-símil es extracelular y frecuentemente se localiza en la superficie celular con una corta cola intracitoplasmática12,19. El HCAM o CD44 es codificada por un gen localizado en el cromosoma 11p13. En el humano está compuesta a lo menos por 21 exones, de los cuales 10 están expresados en la mayoría de los tipos celulares, cuyo producto es una proteína glicosilada de 95-90 kDa conocida como CD44 estándar21. Los restantes exones pueden expresarse en forma variable en los distintos tipos celulares o tejidos y son variantes o isoformas.

El CD44 se encuentra en una variedad de tejidos incluyendo sistema nervioso central, pulmones, hígado, páncreas, etc., mientras que algunas variantes parecen tener una distribución mucho más restringida. Las variantes de CD44 son expresadas en tejido durante el desarrollo incluyendo los epitelios embrionarios21,22. Uno de los principales ligandos de esta molécula es el ácido hialurónico, además del colágeno, fibroelastina, laminina, etc22. La porción citoplasmática del CD44 interactúa con el citoesqueleto a través de su unión directa con la anquirina. Entre las funciones del CD44 se incluyen la adhesión celular (agregación y migración), anidación linfocitaria en ganglios, hematopoiesis, angiogénesis, liberación de citoquinas, así como la metabolización y degradación del ácido hialurónico21,22,24,25.

Muchas células tumorales así como sus metástasis expresan altos niveles de CD44, mientras que algunos tumores como los gliomas expresan exclusivamente el CD44 estándar20. Otras neoplasias como cánceres gástricos, intestinales, cáncer de la vejiga, cáncer de cuello uterino, mama y linfomas no Hodgkin también expresan variantes de CD4420,21. De esta manera, el CD44, particularmente algunas de sus isoformas, se pueden usar como herramientas diagnósticas o marcador pronóstico en algunas neoplasias malignas20. Estudios recientes muestran que el CD44 está involucrado en a lo menos 2 de las etapas de la cascada invasiva como son adhesión a la matriz extracelular y motilidad. La sobre expresión de una de las variantes de CD44 v6 sugiere su participación en la transformación maligna del epitelio de la mama26. El CD44 v6 le confiere potencial metastásico a líneas celulares del carcinoma y sarcoma de la rata, potencial que puede ser bloqueado con anticuerpos anti CD4427,28. En los linfocitos inmaduros el CD44 es sobreexpresado en respuesta al estímulo antigénico y puede participar en la etapa aceptora de la respuesta inmune19.

Algunos estudios han demostrado que la magnitud de la síntesis de variantes del CD44 se relaciona con la presencia de metástasis linfáticas29.

En el cáncer de esófago la CD44 v6 se expresan en casi la totalidad de los carcinomas, en cambio, la CD44 v2 sólo en el 30%. Los cánceres v2 positivos tuvieron un mejor pronóstico que los negativos30. En el neuroblastoma la ausencia más que la sobreexpresión caracterizan a los neuroblastomas más agresivos18, siendo mejor la sobrevida en los casos positivos. En colon la expresión del CD44 v5 es un marcador de tumores incipientes y es detectado en el epitelio displásico, no así en la mucosa normal. La pérdida de la expresión del CD44 v6 parece estar asociada a un peor pronóstico (expresión del 100% en adenomas, 90% en carcinomas y 30% de las metástasis hepáticas)17.

Existe información escasa respecto del rol que pudiesen jugar algunas de estas moléculas de adhesión celular, en particular el CD44 en el cáncer de la vesícula biliar. En un trabajo reciente, se observó la expresión del CD44 v8-10 en el 49% de 37 cánceres vesiculares, observándose una asociación entre la positividad y la infiltración tumoral vascular, linfática y metástasis, siendo un factor pronóstico independiente31.

El objetivo de este trabajo fue determinar en forma preliminar la expresión a nivel proteico del CD44 en el carcinoma subseroso de la vesícula biliar e intentar determinar su importancia como marcador o factor pronóstico.

MATERIAL Y MÉTODO

Casos. Se seleccionaron 105 carcinomas subserosos consecutivos de la vesícula biliar. En todos el diagnóstico se realizó en la pieza de colecistectomía y el nivel de infiltración fue establecido mediante el estudio seriado de la totalidad de la vesícula biliar (mapeo). Se seleccionó áreas representativas del tumor que incluían áreas superficiales (mucosa) y profundas (subserosa) del tumor. En 50 casos además había mucosa no tumoral adyacente al tumor. Como controles se utilizó 33 vesículas biliares sin evidencia de tumor ni reagudización inflamatoria. Los tumores fueron clasificados de acuerdo al grado de diferenciación histológica (bien, moderado y poco diferenciado). Se consignó además el sexo, raza, edad, tipo histológico.

Técnica de inmunohistoquímica. Se realizó mediante técnica estándar de streptavidina-biotina para tejidos fijados en formalina e incluidos en parafina. Los cortes histológicos fueron desparafinados e hidratados. La recuperación de antígenos se realizó mediante exposición a microondas en buffer citrato pH 6.0 y lavados en PBS pH 7.4. Se utilizó anticuerpo anti HCAM (DF1845) (Santa Cruz Biotechnology) en dilución 1/200. El anticuerpo primario fue incubado a 4°C por 16 h y luego incubado con anticuerpo secundario Multilink (biogenex) en una dilución 1:160 por 30 min y revelados con diaminobencidina.

Formas de medición de la positividad. Se consideró como expresión positiva o normal a la tinción de membrana con un patrón predominantemente lineal o finamente granular en la mayoría de las células epiteliales (>90%). Como control interno positivo se empleó la tinción de linfocitos del corion de la mucosa. En cinco casos la tinción fue negativa para las células linfocitarias y/o células epiteliales no tumorales, los que fueron considerados como falla de la técnica o bien mala calidad de la muestra por lo que fueron repetidos, o bien reemplazados por otros casos. La medición de la positividad fue realizada por dos observadores y fue clasificada, en base a la intensidad y porcentaje de positividad de las células epiteliales. Se consideró como positivo la presencia de a lo menos el 5% de las células tumorales y como negativo a tumores con porcentajes inferiores34. Se realizó una estimación semicuantitativa de acuerdo al porcentaje de células positivas y la intensidad con el objeto de intentar determinar un aumento o disminución de acuerdo a los criterios en la Tabla 1. Se consideró como una positividad normal, a la equivalente observada en los controles (la mayoría de las células positivas con tinción lineal, fina y homogénea). La mucosa no tumoral adyacente al tumor, presentó un comportamiento inmunohistoquímico similar a los controles, por lo cual en 50 casos fue posible comparar simultáneamente la intensidad entre células epiteliales no tumorales y neoplásicas. De esta manera, y de acuerdo con otros autores30,32 se consideró en los tumores una tinción positiva normal, aumentada y disminuida.


Análisis estadístico. Se realizó mediante prueba de chi cuadrado y exacta de Fisher para las tablas de contingencia. En 81 casos se obtuvo seguimiento de hasta 150 meses. Se realizaron curvas de sobrevida actuarial de Kaplan-Meier con análisis de significación mediante prueba Log-rank (Cox-Mantel).

RESULTADOS

Las características del grupo estudiado se resumen en la Tabla 2. El promedio de edad fue de 62,6 años, el 89% eran mujeres, y todos los tumores adenocarcinomas, 87% de ellos con un bajo grado de diferenciación histológica (moderadamente o poco diferenciados).


Se observó expresión de CD44 en la totalidad de los controles, en casi todas las células epiteliales de la mucosa y en los linfocitos del corion (Figuras 1A-1B). En 3 casos (9%) se observó una alteración en la intensidad de la expresión de CD44 (en 1 caso aumento y en 2 disminución).



Figura 1A. Ganglio linfático utilizado control. Presenta intensa positividad para CD44 predominantemente en las áreas interfoliculares (X 32).
000001B. Colecistitis crónica con positividad en todas las células epiteliales y en linfocitos del estroma (X 32). En el recuadro características de la positividad de membrana, lineal y homogénea en relación a la unión célula-célula.

En los 50 casos en que había mucosa no tumoral adyacente al tumor, se observó positividad en todos los casos, con una leve disminución en intensidad respecto de los controles, sin que esta diferencia fuese significativa. Por su lado, en los 105 tumores, se observó positividad en 80 casos y en sólo 25 casos (24%), hubo ausencia de expresión de molécula de adhesión en las células tumorales. Todos los casos negativos lo fueron en presencia de positividad de los linfocitos del estroma o en la mucosa no tumoral. Respecto de intensidad de la tinción de acuerdo a los criterios mencionados, en 45 tumores se estimó como normal, en 52 casos como francamente disminuida y sólo en 8 casos como aumentada (Tabla 3). En los tumores se observó una tinción frecuentemente irregular, con una distribución aberrante con pérdida de la polaridad respecto de las células epiteliales no tumorales (Figuras 2A-2B). El aumento de la positividad de CD44 (8 casos), no fue significativo respecto de lo observado en los controles (1/33), en cambio, la disminución de la positividad presente en 52 casos fue significativamente mayor en los tumores, respecto de lo observado en los controles (2/33) (p <0,0001).




Figuras 2 C y D. Carcinomas poco diferenciados de la vesícula biliar con positividad para CD44 (X 400). La tinción de membrana es irregular, con áreas sin tinción que contrastan con otras de tinción gruesa, granular e irregular.

En 81 casos se logró seguimiento hasta 150 meses posterior al diagnóstico. La sobrevida global para este grupo de pacientes con carcinomas subserosos fue de 38% a 5 años (Figura 3), observándose marcadas diferencias de acuerdo al grado de diferenciación histológica. Así los tumores bien diferenciados tuvieron una sobrevida del 70% a 5 años y los tumores moderadamente o poco diferenciados de 38% a 5 años. Los pacientes con tumores CD44 negativos (23 casos) tuvieron una sobrevida de 53% a 5 años en comparación con los CD44 positivos (58 casos) con 32% de sobrevida a los 5 años, sin embargo, esta diferencia no fue significativa. De los 8 casos en que la tinción fue considerada como aumento o sobreexpresión de CD44, en 6 se logró seguimiento, de los cuales 5 habían fallecido antes de los 20 meses posteriores al diagnóstico. Aun cuando los pacientes con disminución de la intensidad de la tinción tuvieron un leve mejor pronóstico, ésta no fue significativa.


Figura 3. Tabla de sobrevida en pacientes con carcinoma subseroso. Sobrevida global 38% a 5 años.

DISCUSIÓN

El carcinoma subseroso de la vesícula biliar es un grupo de tumores que muestra un comportamiento variable e impredecible4-8. No existe mucha información al respecto, sin embargo, hemos demostrado en nuestros casos una estrecha relación entre el grado de diferenciación histológica y la presencia de infiltración tumoral vascular linfática y sanguínea con el pronóstico y sobrevida de este grupo de cánceres (Roa 2000, datos no publicados). De hecho la exacta caracterización de los carcinomas subserosos no está exenta de discusión, particularmente por la forma de cómo se realiza su diagnóstico, que a nuestro entender siempre requiere el mapeo de la pieza quirúrgica. Sin embargo, y a pesar de ello, la mala delimitación con la túnica muscular, la presencia de los senos de Rokitansky-Aschoff y la ausencia de serosa en la cara hepática de la vesícula biliar, dificultan aún más su exacto diagnóstico2,33.

La expresión anómala de la comunicación intercelular homo o heterotípica y la relación que se establece con la matriz extracelular juegan un rol en la progresión de la enfermedad neoplásica y la determinación del CD44 ha demostrado su utilidad en variadas neoplasias9,11,26.

Nuestros resultados muestran la expresión del CD44 estándar en el epitelio vesicular no tumoral y en el 86% de los carcinomas subserosos de la vesícula biliar, aun cuando, en 50% de ellos hubo signos de disminución de la intensidad y la mayoría presentaron un patrón de tinción francamente alterado. En segundo lugar, aun cuando existe una tendencia a la relación entre la sobreexpresión del CD44 con un peor pronóstico de la enfermedad y la ausencia o disminución de la expresión con una mejor sobrevida, estas diferencias no resultaron significativas. Este hecho pudiese tener variadas explicaciones como son: un insuficiente número de casos, o bien, la variedad o isoforma del CD44 pudiese no ser la específica para esta neoplasia. Se ha demostrado que las distintas variedades o isoformas de CD44, producto de la expresión variable de los distintos exones que constituyen a este gen, determinan, no sólo particularidades estructurales, sino que de función y localización20,22,24. Los tumores originados en estos órganos también presentan y expresan variadas isoformas de CD44, como ocurre en colon17, esófago34, hígado32 y recientemente en la vesícula biliar31. Las isoformas v2 v8 y v10, se han demostrado como marcadores y factores pronósticos independientes en algunas neoplasias. En el cáncer de la vesícula biliar no existe información suficiente como para comparar nuestros hallazgos, sin embargo, Yamaguchi31, demostró la positividad para las isoformas v8-10 en 18 de 37 cánceres vesiculares. A pesar del bajo número de observaciones, demostró relación con la presencia de compromiso tumoral vascular y linfático, así como un peor pronóstico en los casos positivos.

De esta manera, podemos concluir que en el carcinoma subseroso de la vesícula biliar, el 76% de los casos muestran positividad para la expresión de CD44, observándose, en a lo menos la mitad de los casos, una disminución de la expresión. En segundo lugar, se observa una tendencia que sugiere que la sobreexpresión de esta molécula se asocia a una evolución más agresiva de la enfermedad, lo que debería confirmarse con un mayor número de observaciones y que el estudio de algunas isoformas de esta molécula, pudiese contribuir a una mejor caracterización de este grupo de tumores de la vesícula biliar.

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