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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.129 n.11 Santiago nov. 2001

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872001001100002 

El colágeno de la reestenosis post
angioplastia con stent: ¿se origina en la íntima o en la adventicia?

Origin of collagen in restenosis
post stenting. Intima or adventitia?

Eduardo Guarda S, Alejandro Fajuri N,
Alejandro Martínez S, Eugenio Marchant D,
Andrea Vecchiola C1, Edith Valenzuela S2,
Rosa Lazen V3.

Correspondencia a: Dr. Eduardo Guarda Salazar. Departamento de Enfermedades Cardiovasculares. Marcoleta 367 FAX 6333171. Email: eguarda@med.puc.cl

Background: Restenosis post stenting is due to the deposit of extracellular matrix, mainly collagen in the neointima. Controversy exists regarding if collagen is generated locally or by immigration from the adventitia. Aim: To study the fibrocellular response after stent implantation in rabbit iliac arteries. To observe, by immunohistochemistry and in situ hybridization, if collagen type I mRNA is expressed in the neointima, in the media or in the adventitia. Material and methods: Thirty eight white rabbits (New Zealand) of 4 kg received an hypercholesterolemic diet during 1 month. After this period, in all but 6 of them, an angioplasty with stent implantation was performed via right carotid artery in both iliac arteries, using a 1:1.3 relationship regarding the reference vessel. Angiograms were performed at day 0, 4, 21, and 40, followed by paraffin fixation of the injured segments, immunohistochemistry for a-actin and in situ hybridization to detect procollagen type I (a1R1) mRNA. Results: No hybridization was observed in non injured arteries or at day 0 (n= 6). Expression of a1R1 mRNA was observed in the neointima starting at day 4 after stenting (n= 8). At day 21 (n= 8) hybridization of procollagen type I was not only observed in the neointima, but also in the media, which became equally intense in both areas. At day 40 (n= 6) hybridization was observed similarly in the media and adventitia. Conclusions: In this model, hybridization of procollagen type I started in the neointima, then involved the media and finally the adventitia. This finding might be useful for designing therapies to be delivered locally at the end of an angioplasty to prevent collagen deposition in the neointima (Rev Méd Chile 2001; 129: 1241-7).
(Key-words: Angioplasty; Arterial occlusive diseases; Collagen).

Recibido el 6 de abril, 2001. Aceptado en versión corregida el 22 de agosto, 2001.
Trabajo financiado por Proyecto FONDECYT 1960919.
Departamento de Enfermedades Cardiovasculares. Pontificia Universidad Católica de Chile
1 Bioquímico
2 Tecnólogo Médico
3 Enfermera Universitaria

La reestenosis coronaria post angioplastia con stent es un problema significativo, tanto desde el punto de vista clínico como económico1. La hipótesis más aceptada hoy en día respecto de la reestenosis post stent consiste en que esta se debería al depósito de matriz extracelular, principalmente colágeno en la neoíntima2,3. Nuestro grupo ha publicado evidencias que el aumento del colágeno en la neoíntima se debería tanto a un aumento de la síntesis como a disminución de la degradación del colágeno4. Han habido publicaciones señalando que el colágeno se generaría a partir de células generadas en la misma neoíntima5,6, mientras que otros autores sostienen que habría migración de miofibroblastos desde la adventicia hasta la neoíntima7. El origen de las células productoras del colágeno en el proceso de reestenosis es potencialmente de gran importancia, debido a que posibles tratamientos vía endoluminal pueden tener un éxito muy diferente dependiendo de si la expresión del colágeno comienza en la neoíntima o proviene desde la adventicia.

En un intento por dilucidar el problema del origen del colágeno en un modelo de reestenosis, en el presente trabajo se localizaron las células que estuvieran expresando RNAm de colágeno tipo I en la neoíntima, en la media y en la adventicia mediante hibridización in situ post implante de stents en arterias ilíacas de conejo.

MATERIAL Y MÉTODO

Modelo animal: Daño arterial (ilíaca) en conejo con hipercolesterolemia: Se usaron conejos blancos (Nueva Zelandia) de 4 kg. Los animales recibieron durante 1 mes una dieta consistente en 2% colesterol y 6% de aceite de maní mezclado en sus pellets habituales, luego de lo cual se les practicó una angioplastia. Para ello, los animales fueron anestesiados vía intramuscular con ketamina (50 mg/kg) y xilazina (5 mg/kg). Se aisló la arteria carótida común derecha y se avanzó un catéter angiográfico 5F hasta la aorta infrarrenal. Se realizó una angiografía, la cual fue filmada con película de 35 mm, utilizando un cineangiógrafo Siemmens. Apoyados en una guía floppy 0,014 posicionada en una arteria femoral, bajo fluoroscopia se implantaron en ambas arterias ilíacas mitades de stents Palmaz-Schatz montados en un balón de angioplastia, de acuerdo a un protocolo detallado posteriormente. La angioplastia se realizó mediante 3 insuflaciones de 60 s c/1, a 10 Atm, con intervalos de 60 s entre la insuflaciones. El balón de angioplastia fue seleccionado de modo que permitiera una sobredistensión de la arteria con una relación 1:1,3 respecto del segmento de referencia. Después de una angiografía de control, la carótida fue ligada, se suturó la herida y se administraron 500 mg de cefazolina IM. Los animales fueron puestos en cajas individuales hasta el término del protocolo. Al día siguiente de la angioplastia los animales volvieron a su dieta habitual. Se realizaron angiografías de control en distintos conejos a los 0, 4, 21 y 40 días después de la angioplastia. Los animales fueron nuevamente anestesiados, y se les cateterizó la arteria carótida izquierda, repitiendo una angiografía de ambas femorales. Seis conejos fueron sacrificados en el momento de realizar la angiografía inicial, sin angioplastia, y que sirvieron como control de arteria no angioplastiada.

Posterior a esto, se realizó una canulación de la aorta abdominal y de la cava inferior, luego de lo cual los animales fueron sacrificados mediante una sobredosis de pentobarbital sódico. Se les perfundió con formalina al 10% buffer fosfato pH 7,0, a través del catéter posicionado en la aorta, bajo las arteria renales, a 100 mmHg, 100 ml por 15 min, recogiendo el retorno a través de 1 catéter posicionado en la vena cava. Luego se hizo una cuidadosa disección de las arteria femorales, con técnica quirúrgica estéril, evitando contaminación bacteriana y se tomaron las muestras de la arteria angioplastiada. Luego el tejido fue fijado en bloques de parafina, en los cuales se realizaron cortes coronales seriados de 5 µm, los cuales fueron hibridizados y analizados para sondas sense y antisense de colágeno tipo I (a1R1), dejando muestras para estudio histológicos e inmunohistológicos.

Angiografía Cuantitativa. Las angioplastias se efectuaron en un cineangiógrafo Siemmens, y las películas fueron filmadas a 25 cuadros/s. Se eligieron los cuadros más representativos para luego digitalizarlos por medio de un escáner Microteck Scanmaker IISp con módulo de transparencias, usando el programa PhotoShop 4.0 y un computador Macintosh Quadra. El módulo de transparencias permite escanear directamente la película de 35 mm, sin necesidad de realizar fotografías. Las imágenes fueron amplificadas hasta un tamaño de 700 Kb (14 bit/pixel). Luego se ingresaron al programa NIH-IMAGE. Tras amplificar nuevamente, se definió para cada imagen una escala según un patrón de referencia conocido (catéter guía 8 French) y se procedió a realizar las mediciones. Cada medición fue realizada en duplicado, según hemos descrito previamente8.

Inmunohistoquímica. Se estudió la distribución del colágeno tipo I en la pared vascular mediante un anticuerpo monoclonal específico y se identificaron posibles células productoras de colágeno (células musculares lisas o miofibroblastos) mediante anticuerpos monoclonales anti a-actina de célula muscular lisa (Sigma) en la pared arterial. Se usaron cortes de 4 µm de secciones de tejido fijado en parafina, los cuales fueron desparafinizados con xilol y tratados por 10 min con metanol con 0,3% de H2O2, para bloquear las peroxidasas endógenas. Los cortes fueron lavados con PBS e incubados por 60 min con el primer anticuerpo. Después de lavar nuevamente con PBS, se usaron segundos anticuerpos unidos a peroxidasa (DAKO); los anticuerpos fueron visualizados usando diaminobenzidina, además de hematoxilina-eosina, seguido de deshidratación y fijación.

Generación de sondas cRNA a1R1-T7 SP6. Las sondas de cRNA (DIG-cRNA), sense y antisense, de a1R1 se obtuvieron mediante la transcripción in vitro en presencia de Digoxigenina-UTP, del producto de PCR a1R1-SP6 T7. Dicho producto contiene los promotores de transcripción SP6 y T7 en los extremos 5' y 3' respectivamente, y fueron generados a partir de un plasmidio linealizado que contiene la siguiente secuencia: CCTGGAAGAG ATGGTGCTCC TGGTGCCAAG GGTGACCGTG CTGAGACTGG CCCTGGTGGC CCCCTGGNNN NNCCTGGTGC TCTTGGTGCT CCCGGCCCTG TTGGTCCTGC TGGCAAGAAT GGCGACCGTGGTGAACCGC, utilizando partidores híbridos (20 nucleótidos correspondientes a la secuencia del promotor seguidos por 20 nucleótidos correspondientes a la secuencia de a1R1)9.

RESULTADOS

Angiografía cuantitativa. El diámetro de referencia no varió significativamente entre el momento de la angioplastia vs el diámetro al seguimiento (1,66 ± 0,07 vs 1,70 ± 0,06 mm, respectivamente). El diámetro luminal intrastent fue de 0,98 ± 0,09 (p NS), constituyendo 40% de estenosis.

Inmunohistoquímica. La inmunotinción de anti a actina fue positiva desde los 7 días, y se desarrolló en concomitancia con la aparición de neoíntima. La tinción de estas células anti a actina (+) se mantuvo sin mayores cambios durante todos los períodos observados (Figura 1).


Figura 1. La tinción de a-actina de célula muscular lisa fue pesquisada en la neoíntima, media y en menor grado en la adventicia a partir del 4 día post angioplastia, sin variación significativa en el resto de los períodos estudiados. In: íntima; med: media; adv: adventicia.

Hibridización in situ de procolágeno tipo I. En la Figura 2 se presentan fotografías representativas de la hibridización in situ con la sonda [DIG]cRNA de a1R1 de la región sometida a angioplastia ilíaca en el día 4 (n= 8), 21 (n= 8) y 40 (n= 6). Con esta técnica la expresión del procolágeno tipo I en una arteria de conejo no sometido a angioplastia o en el día 0 (n= 6) fue nula (no mostrado). En cambio, en el recuadro superior de la Figura 2 se aprecia que 4 días después de la angioplastia ya se puede observar hibridización del procolágeno tipo I en la íntima de esta arteria.


Figura 2. Segmento Superior: Hibridización in situ de ilíacas de conejo con sonda [DIG]cRNA de a1R1 4 días post implante del stent (luego de 4 semanas de dieta hipercolesterolémica).

Segmento Medio: Hibridización de ilíacas de conejo 21 días post implante del stent.
Segmento Inferior: Hibridización de ilíacas de conejo 40 días post implante del stent.
A= hibridación con la sonda antisense; B= hibridación con sonda sense.
In= íntima; med= media; adv= adventicia
.

En el recuadro intermedio se aprecia que a los 21 días post angioplastia la hibridización del procolágeno tipo I no sólo se circunscribió a la neoíntima, sino que también abarcó la neoíntima y la media, sin tinción de la adventicia.

El recuadro inferior corresponde a la hibridización de conejos 40 días después de la angioplastia. Se observa que la expresión del procolágeno tipo I se produce preponderantemente en la capa media y adventicia, prácticamente sin tinción en la neoíntima. A los 60 días (n= 4) la tinción comprometió casi exclusivamente a la adventicia (no mostrado).

DISCUSIÓN

Si bien los stents han logrado reducir la incidencia de reestenosis post angioplastia10, han creado una nueva entidad, la reestenosis intrastent. El proceso reparativo que ocurre en respuesta al daño inducido por la angioplastia aún limita seriamente los diversos procedimientos angioplásticos. Aunque la patogenia exacta de este proceso reparativo no está totalmente aclarada, numerosos estudios han demostrado la importancia de la acumulación de proteínas de la matriz extracelular en diversos modelos de reestenosis post angioplastia, mientras que la proliferación celular no sería tan fundamental como inicialmente se había pensado11,12. Entre dichas proteínas destaca fundamentalmente el colágeno tipo I, el cual constituye más del 50% del colágeno fibrilar presente en la pared vascular post angioplastía13.

En un modelo experimental semejante al nuestro, Karim et al5 encontraron aumento de la expresión de RNAm de colágeno tipo I muy precozmente después de una angioplastia (antes de la primera semana), lo que fue seguido por acumulación de colágeno fibrilar tipo I y III en la neoíntima arterial. En dicho estudio, la activación temporal del RNAm de los colágenos tipo I y III fue realizada mediante northern blots, una técnica que si bien permite cuantificación bastante exacta del RNAm de interés, no permite identificar la zona de la arteria de donde proviene el RNA, ni las células que lo producen. Esto último ha sido también un punto de discusión. Inicialmente se pensó que serían células musculares lisas las que luego de migrar desde la media a la neoíntima presentarían una transformación fenotípica, con pérdida del aparato contráctil y aparición de un fenotipo secretor. Sin embargo, en los últimos años se ha sugerido que podría existir una migración de fibroblastos desde la adventicia hasta la neoíntima. Ciertamente hay una diferencia enorme si el colágeno es producido en la adventicia o en la neoíntima. Ello porque desde el punto de vista de la terapia local (endoluminal), sería más plausible intentar introducir medicamentos o genes vía endoluminal si las células que están produciendo el colágeno están más cerca del lumen, en la neoíntima. En cambio, si los fibroblastos de la adventicia fueran las células más importantes, sería más difícil lograr llegar a ellas con medicamentos vía endoluminal.

En nuestro estudio hemos observado aparición progresiva de la expresión del RNAm del procolágeno tipo I en los conejos sometidos a angioplastia ilíaca. Estos conejos fueron tratados durante 1 mes con dieta hiperlipémica. En el grupo control, con igual dieta, pero no sometido a angioplastia no se observó expresión de este gen. Este comenzó a expresarse a los 4 días después de la angioplastia. Interesantemente, en nuestros experimentos la hibridización comenzó en la neoíntima; a los 14 días comprometió la media y sólo recién a los 40 días abarcó la adventicia. De hecho, a los 60 días post angioplastia la hibridización quedó reducida a la adventicia.

Estos hallazgos concuerdan con lo publicado por otros autores5,6, y en cambio, no apoyan lo publicado por otros autores7,14. Es posible que estas diferencias se deban a diferentes modelos animales empleados. Shi et al realizaron sus observaciones en un modelo de daño endotelial en arterias coronarias de porcino, sin inducción de hipercolesterolemia. Este modelo se caracteriza por demostrar una gran reacción de la adventicia a la injuria, de modo que existe comparativamente semejante cantidad de colágeno fibrilar en la neoíntima y en la adventicia a los 1 y 3 meses post angioplastia. Respecto de estos investigadores compartimos el hallazgo de la presencia de células que tienen tinción positiva para a-actina de células musculares lisas en la neoíntima. Como se dijo anteriormente, se ha debatido si estas células son parte de la íntima, y que sufrirían una transformación fenotípica durante la cual comienzan a expresar este marcador, o si se trata de células musculares lisas transformadas provenientes desde la media hacia la neoíntima, o incluso de fibroblastos que migrarían desde la adventicia, adquiriendo este marcador de a-actina durante su migración. Estas células han sido denominadas miofibroblastos, y su presencia es común en diversos sitios en donde están ocurriendo fenómenos de reparación tisular. Aunque en nuestros experimentos no podemos descartar que la activación de las células que expresan RNAm de a1R1 pudiera corresponder a una muy rápida migración (< 4 días) de células provenientes de la adventicia, se podría especular que estas células o bien estaban en la íntima y se activaron, o en su defecto pudieron haber migrado desde las regiones más próximas en la media, aunque nuestro diseño experimental no permite afirmarlo con certeza.

Entre los mediadores más importantes que podrían estar involucrados en esta respuesta tisular han sido señalados el factor de crecimiento básico derivado de fibroblastos (bFGF)15, el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF)16, endotelina y el eje renina angiotensina17,18.

Limitaciones de este estudio. Aunque nuestros hallazgos coinciden con estudios que previamente han demostrado aumento de la expresión de RNAm mediante otras técnicas en este mismo modelo animal, una limitación de este estudio consiste en que no es posible extrapolar estos resultados al proceso de reestenosis en humanos. Por ejemplo, una de las características de este modelo, tal como ha sido descrito previamente, es que no se observa una reestenosis en el sentido de la definición dicotómica que señala como tales a arterias con estenosis > 50%. Sin embargo, nuestro interés es el estudiar principalmente la biología de la respuesta, lo cual se puede apreciar claramente con las magnitudes observadas (estenosis de 40%). Asimismo, nuestro estudio estuvo dirigido a establecer la secuencia temporal y la localización de las células que expresan RNAm de colágeno tipo I, pero no se investigaron otros elementos igualmente influyentes en el metabolismo del colágeno, tales como la expresión de las metaloproteinasas ni de los inhibidores tisulares de metaloproteinasas. El balance entre los elementos pro síntesis versus los factores pro degradación determina en último término el grado de acumulación de colágeno4,20,21. Finalmente, en nuestro diseño no hubo un grupo experimental de conejos sin angioplastia seguido en el tiempo, sino que solamente se hizo la hibridización al momento de la angiografía (tiempo 0). Nuestro razonamiento fue que este grupo, por no haber recibido injuria vascular, no debería haber presentado cambios en la expresión del RNA de colágeno. Aunque improbable, es teóricamente posible que la suspensión de la dieta hipercolesterolémica por si misma y no la angioplastia, fuera el estímulo para provocar los cambios secuenciales en la activación del colágeno.

En conclusión pensamos que: en este modelo de reestenosis intrastent observamos que la expresión de RNAm del procolágeno tipo I comienza en la neoíntima, luego abarca la media y muy tardíamente quedó circunscrita a la adventicia. De ser corroborado, este hallazgo estimula el desarrollo de posibles terapias locales endoluminales para evitar la producción de colágeno en el mismo momento de la PTCA. Recientemente, se ha logrado inhibir la proliferación de células musculares lisas y la formación de neoíntima mediante la introducción del gen de la óxido nítrico sintetasa en un modelo de daño arterial por balón en la rata22.

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