SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.130 número1Asociación entre el fenotipo fisura labiopalatina no sindrómica y marcadores de microsatélites ubicados en 6p, 17q y 19qGasto energético de reposo medido en obesos y no obesos: comparación con la estimación por fórmulas y ecuaciones propuestas para población chilena índice de autoresíndice de assuntospesquisa de artigos
Home Pagelista alfabética de periódicos  

Serviços Personalizados

Journal

Artigo

Indicadores

Links relacionados

Compartilhar


Revista médica de Chile

versão impressa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.130 n.1 Santiago jan. 2002

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872002000100006 

Metodología clásica y molecular en
la identificación de especies de
Enterococcus spp

Classic and molecular
methodologies for the identification
of Enterococcus species

Marcela Sepúlveda A1, Helia Bello T1,
Mery Ruiz C2, José Hormazábal F,
Mariana Domínguez Y1, Gerardo González R3, Sergio Mella M, Raúl Zemelman Z4.

Correspondencia a: Helia Bello Toledo. Laboratorio de Antibióticos, Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción. Casilla 152 C. Fono (41) 203237. Fax (41) 245975. E-mail: hbello@udec.cl

Background: Enterococcus is a bacterial genus with low virulence. However, in the last years, the importance of some enterococcus species as nosocomial pathogens has increased, specially due to their resistance to some antimicrobial. Aim: To identify enterococcus strains using classical biochemical techniques and genomic amplification with Polymerase Chain Reaction (PCR). Material and methods: Three hundred and five enterococcus strains, isolated between 1996 and 1999, from different clinical specimens in hospitals and other centers of the VIIIth Region of Chile, were studied. The isolates were identified, to the species level, according to the scheme proposed by Carvalho et al. Identification of some strains was confirmed by PCR. Results: Eighty nine percent of isolates were identified as E fæcalis, 10.2% as E fæcium and 3.3% as other species. Conclusions: PCR is a fast and promising technique, useful in the identification of Enterococcus species (Rev Méd Chile 2002; 130: 45-49).
(Key Words: Enterococcus; Enterococcus fæcalis; Enterococcus fæcium; Polymerase chain reaction)

Recibido el 6 de marzo, 2001. Aceptado en versión corregida el 30 de octubre, 2001.
Trabajo financiado por Proyecto DI Nº 98.036.011-1.0.
Dirección de Investigación Universidad de Concepción.
Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas,
Departamento de Medicina Interna, Facultad de Medicina,
Universidad de Concepción y Facultad de Medicina,
Universidad San Sebastián, Concepción.
1 Bioquímico, Magister en Microbiología
2 Químico Farmacéutico, Magister en Microbiología
3 Licenciado en Biología, Magister en Microbiología
4 Químico Farmacéutico, Dipl. Bacteriol., MSc Public Health

Históricamente las especies del género Enterococcus fueron consideradas como microorganismos de la flora normal del tracto intestinal de humanos y animales1. Sin embargo, en los últimos años, especies de este género han sido reconocidas como importantes patógenos intrahospitalarios y agentes etiológicos de diversos cuadros infecciosos2.

Las especies de Enterococcus spp fueron originalmente incluidas en el género Streptococcus3, en la actualidad, constituyen un género bacteriano distinto cuyas especies más destacadas por su frecuencia de aislamiento son E fæcalis y E fæcium, mientras que el resto de las especies del género se aíslan con menor frecuencia4. Las cepas de Enterococcus spp poseen propiedades fisiológicas que facilitan su caracterización fenotípica por métodos bioquímicos convencionales. Sin embargo, este tipo de identificación es compleja, dificultosa, demora al menos 48 h y, en algunos casos, debido a la similitud fenotípica no es posible una adecuada identificación5. Por esta razón, se han estandarizado diversos métodos moleculares, basados en el estudio de ácidos nucleicos, que permiten la identificación más rápida y precisa de los miembros del género Enterococcus. Entre éstos se distinguen los ensayos de amplificación genética por PCR, hibridación ADN-ADN, hibridación ADN-ARN y análisis de proteínas los cuales pueden convertirse en una alternativa a la serología y caracterización bioquímica para la identificación de estos microorganismos6.

La epidemiología de Enterococcus spp en nuestro país ha sido escasamente estudiada debido, en gran parte, a la dificultad que presenta la identificación de este microorganismo, por esto no existe información suficiente sobre las especies de Enterococcus presentes en nuestro medio4,5. En este trabajo se identificó un grupo de cepas de Enterococcus spp, aisladas en hospitales y centros extrahospitalarios de la VIII Región, a través de ensayos bioquímicos convencionales y amplificación genética por PCR-multiplex con el objeto de comparar metodologías que permitan identificar especies de importancia clínica.

MATERIAL Y MÉTODO

Cepas bacterianas. Se estudiaron 305 cepas de Enterococcus spp, recolectadas entre 1996 y 1999, de las cuales 244 fueron aisladas de muestras clínicas de pacientes hospitalizados en los siguientes centros: Hospital Clínico Regional de Concepción "Dr. Guillermo Grant B", Hospital Naval y Hospital Las Higueras de Talcahuano, Hospital Herminda Martín de Chillán, Hospital Víctor Ríos de Los Angeles, Hospital de Lebu, Arauco, Bulnes, y San Carlos. Además, 61 cepas fueron aisladas de muestras clínicas de pacientes ambulatorios controlados en Consultorios del Servicio de Salud de Concepción. Se utilizó como controles en los procesos de identificación las cepas: E fæcalis ATCC 29212 y E fæcium cepa Cernelle 68 (C-68) aislada de "Gastrofloraâ biocultivo intestinal".

Identificación. La identificación fenotípica de género se realizó según lo establecido por Facklam y co7 y a nivel de especie de acuerdo al esquema propuesto por Carvalho y col8. La identificación genotípica que permitió la confirmación de la especie fue realizada por PCR-multiplex, utilizando el protocolo recomendado por Dutka-Malen y col9. En breve, se resuspendieron dos colonias de la cepa en identificación en 200 µl de agua destilada estéril centrifugando luego por 5-10 s. Se agregó 2 µl del sobrenadante de la suspensión a la mezcla de reacción que contenía 1 µl de MgCl2 (50 mM), 2,5 µl dNTPs (1,25 mM), 2,0 µl de cada uno de los partidores (20 pmol), 2,5 µl de tampón PCR 10 X, 0,15 µl de Taq polimerasa (5 U/µl) y agua destilada estéril en cantidad suficiente para completar 25 µl de reacción. Las secuencias nucleotídicas de los partidores utilizados han sido publicadas con anterioridad9-11 y se muestran en la Tabla 1. Los productos de amplificación fueron separados por electroforesis en gel de agarosa (1,5%), se tiñeron con bromuro de etidio (0,5 µg/ml) y se visualizaron en un transiluminador UV.


RESULTADOS

La identificación fenotípica de las cepas de Enterococcus spp mostró que el 89,2% correspondió a E fæcalis, 10,2% a E fæcium y el 3,3% restante a otras especies, según se muestra en la Tabla 2. La identificación fenotípica fue confirmada por PCR en 30 cepas de E fæcalis. En la Figura 1.a se observa el producto de amplificación genética de ocho cepas previamente identificadas como E fæcalis por métodos bioquímicos. El fragmento de ADN amplificado (941 pb) fue comparable con aquel obtenido a partir de la cepa control de E fæcalis ATCC 29212.


La identificación fenotípica de E fæcium (25 cepas) fue confirmada por PCR en el 100% de los casos estudiados. En la Figura 1.b se muestra el producto de amplificación (550 pb), correspondiente a E fæcium y que fue comparable con el producto de amplificación de la cepa control E fæcium C-68.


Figura 1. (A) Carril 1 y 2, cepas control de E fæcalis y E fæcium; carriles 3 al 10, cepas clínicas identificadas como E fæcalis. (B) Carril 1 y 2 cepas control de E fæcalis y E fæcium, respectivamente. Carriles 3 al 8 cepas clínicas identificadas como E fæcium, en carriles 9 y 10 se incluyen controles negativos de mezcla de reacción y de cepa, E coli K-12. (C) Carril 1 y 2 cepas control de E fæcalis y E fæcium, respectivamente, carril 3 producto de amplificación correspondiente a E gallinarum, carriles 4 al 10 cepas identificadas fenotípicamente como especies de Enterococcus de aislamiento menos frecuentes (E raffinosus, E durans, E hiræ, E avium y una cepa de especie no identificada).

En la Figura 1.c se observa la amplificación positiva (822 pb) para E gallinarum en una cepa que fenotípicamente había sido identificada como el complejo E casseliflavus/E gallinarum, debido a que las pruebas bioquímicas disponibles no permiten diferenciar ambas especies en forma clara y precisa. En esta misma Figura se observa que siete cepas que fenotípicamente se identificaron como especies muy poco frecuentes en el conjunto de cepas estudiadas y, por lo tanto, con menor importancia clínica general, no dieron amplificación positiva con los partidores utilizados. La única cepa que fenotípicamente no pudo ser identificada al nivel de especie tampoco fue identificada por PCR.

DISCUSIÓN

En los últimos años, la técnica de PCR ha sido utilizada en la identificación de diferentes microorganismos de importancia clínica12 y es considerada por algunos autores como una adecuada alternativa a la caracterización bioquímica y serológica empleadas tradicionalmente en la identificación de Enterococcus13. Los métodos bioquímicos convencionales de identificación consideran el estudio de muchas características, lo que hace que esta identificación sea lenta, compleja y de un rendimiento limitado, ya que en algunas oportunidades no permite diferenciar adecuadamente especies fenotípicamente similares13.

Actualmente se definen 19 especies de Enterococcus, siendo varias de ellas importantes patógenos en humanos14. Sin embargo, E fæcalis y E fæcium son las especies más frecuentemente aisladas, aunque con marcadas diferencias epidemiológicas14-16. Si bien estas especies son las de mayor relevancia clínica, también es interesante el aislamiento creciente de E gallinarum y E casseliflavus, especies que presentan resistencia de bajo nivel a vancomicina y, además, pueden confundirse fenotípicamente con E fæcium4,5. Debe enfatizarse que esta última especie, a pesar de su menor frecuencia de aislamiento, se caracteriza por su mayor resistencia frente a una serie de agentes antibacterianos y, por tanto, las alternativas terapéuticas para el tratamiento de infecciones producidas por esta bacteria son limitadas15,16. Los antecedentes anteriormente expuestos explican el uso de partidores específicos para la identificación molecular a nivel de especie de E fæcium, E fæcalis, E gallinarum y E casseliflavus.

En este trabajo se estandarizó un protocolo de identificación por medio de amplificación por PCR de algunas especies de Enterococcus. Los resultados permitieron confirmar en 100% el estudio fenotípico, además de identificar especies en casos donde la identificación a través de las propiedades fisiológicas no fue concluyente. Esto puede observarse en las fotografías de los geles de agarosa respectivos (Figura 1.c).

De acuerdo a estos resultados y dado que la amplificación por PCR es un método rápido y preciso, planteamos que esta técnica podría ser de utilidad en la identificación de especies de Enterococcus, particularmente de aquellas cuya identificación fenotípica habitual es más compleja.

REFERENCIAS

1. Moellering R Jr. Emergence of Enterococcus as a significant pathogen. Clin Infect Dis 1992; 14: 1173-8.        [ Links ]

2. Chenoweth C, Schaberg D. The epidemiology of enterococci. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1990; 9: 80-9.        [ Links ]

3. Hardie J, Whiley R. Classification and overview of the genera Streptococcus and Enterococcus. J Appl Microbiol 1997; 83 (Symp Suppl): 1S-11S.        [ Links ]

4. Giglio MS, Pinto ME, Córdova E, Escandar P, Waman C. Identificación de especies de Enterococcus en muestras clínicas y susceptibilidad a agentes antimicrobianos. Rev Méd Chile 1996; 124: 70-6.        [ Links ]

5. Labarca JA, Mc Donald LC, Pinto ME, Palavecino E, González P, Cona E et al. Proficiency in detecting vancomycin resistance in enterococci among clinical laboratories in Santiago, Chile. Emerg Infect Dis 1999; 5: 143-6.        [ Links ]

6. Ke D, Picad F, Martineau F, Menard C, Roy P, Ouellette M et al. Development of a PCR assay for rapid detection of enterococci. J Clin Microbiol 1999; 37: 3497-503.        [ Links ]

7. Facklam R, Sham D, Texeira L. Enterococcus. En Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH, eds. Manual of Clinical Microbiology. Washington DC ASM Press 1999; 297-305.        [ Links ]

8. Carvalho M, Teixeira L, Facklam R. Use of tests for acidification of methyl-a-D-glucopyranoside and susceptibility to efrotomycin for differentiation of strains of Enterococcus and some related genera. J Clin Microbiol 1998; 36: 1584-7.        [ Links ]

9. Dutka-Malen S, Evers S, Courvalin P. Detection of glycopeptide resistance genotypes and identification to species level of clinically relevant enterococci by PCR. J Clin Microbiol 1995; 33: 24-7.        [ Links ]

10. Dutka-Malen S, Evers S, Courvalin P. Detection of glycopeptide resistance genotypes and identification to species level of clinically relevant enterococci by PCR (Erratum). J Clin Microbiol 1995; 33: 1434.        [ Links ]

11. Coque T, Seetulsingh P, Singh K, Murray B. Application of molecular techniques to the study of nosocomial infections caused by enterococci. En Woodford, N. and Johnson, A.P, Eds. Methods in Molecular Medicine, Vol 15: Molecular Bacteriology: Protocols and Clinical Applications. Tatowa, New Jersey: Human Press Inc, 1998; 469-93.        [ Links ]

12. Pedrari S, Ligozzi M, Fontana R. Genotypic identification of methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci by polymerase chain reaction. Antimicrob Agents Chemother 1991; 35: 2568-73.        [ Links ]

13. Donabedian S, Chow J, Shlaes D, Gren M, Zervos M. DNA Hybridization, and contour-clamped homogeneous electric field electrophoresis for identification of enterococci to the species level. J Clin Microbiol 1995; 33: 141-5.        [ Links ]

14. Mundy L, Sahm D, Gilmore M. Relationships between enterococcal virulence and antimicrobial resistance. Clin Microbiol Rev 2000; 13: 513-22.        [ Links ]

15. Spera R Jr, Farber B. Multidrug-resistant Enterococcus fæcium. Drugs 1994; 48: 678-688.        [ Links ]

16. Low DE, Keller N, Barth A, Jones RN. Clinical prevalence, antimicrobial susceptibility, and geographic resistance patterns of enterococci: results from SENTRY antimicrobial surveillance program, 1997-1999. Clin Infect Dis 2001; 32 (Suppl 2): S133-S145.        [ Links ]

Creative Commons License Todo o conteúdo deste periódico, exceto onde está identificado, está licenciado sob uma Licença Creative Commons