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Revista médica de Chile

versão impressa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.130 n.4 Santiago abr. 2002

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872002000400002 

Inmunofenotipificación
de linfocitos en sangre periférica
de pacientes chagásicos
crónicos chilenos
mediante citometría de flujo

Gittith Sánchez1, Inés Zulantay2, Marta Gajardo3,
Juan Venegas1, Roxana Villanueva4, Andrés Pérez4,
Federico Liendo, Werner Apt, Aldo Solari1

Immunophenotyping by flow
cytometry of peripheral blood
lymphocytes from
Chilean chronic chagasic patients

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Background: Cellular immune mechanisms of the resistance to infection by T cruzi as well as the pathogenesis of Chagas disease are still controversial. Aim: To quantify and analyse the peripheral blood immune cells from chagasic and non chagasic patients by flow cytometry. Patients and methods: Peripheral blood samples were taken from 21 individuals seropositive for Chagas disease, under no specific treatment. Control samples from 21 healthy blood donors were also obtained. To quantify immune cells populations by flow cytometry, antibodies against CD3, CD4, CD8, CD16/56, CD45/14, CD19 and HLA-DR markers were used. Results: The percentage of CD8+ cells was low and the CD4+/CD8+ ratio was high in chagasic patients, compared to their non infected counterparts. No statistically significant differences in the number of CD4+, NK, B, CD4+HLADR+ and CD8+HLADR+ cells, were observed within the two groups. Conclusions: These results show that Chilean chronic chagasic patients have lower percentage of CD8+ cells and higher CD4+/CD8+ ratio than non infected individuals (Rev Méd Chile 2002; 130: 363-367).
(Key Words: CD4-positive T-lymphocytes; CD4-CD8 ratio; CD8-positive T-lymphocytes; Chagas disease; Flow cytometry)

Recibido el 29 de junio, 2001. Aceptado en versión corregida el 17 de enero, 2002.
Programa Biología Celular y Molecular, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile.
1 Doctor en Ciencias
2 Magíster en Ciencias
3 Biólogo
4 Tecnólogo Médico

El agente etiológico de la enfermedad de Chagas, que afecta a más de 20 millones de latinoamericanos, es el Trypanosoma cruzi. Esta infección presenta cursos variables, entre los cuales se han descrito las formas asintomática, aguda grave y severa crónica. Esta última puede manifestarse con compromiso cardiovascular y/o gastrointestinal (megaesófago o megacolon)1. Se han comunicado variaciones geográficas significativas tanto en la severidad como en la prevalencia de las diversas formas clínicas2. En Chile hay aproximadamente 150.000 personas infectadas, 30% de las cuales tienen algún grado de cardiopatía, estimándose que un tercio de ellas requerirían marcapaso3. En este contexto, dilucidar los mecanismos inmunológicos involucrados tanto en la resistencia del huésped humano a la infección por T cruzi, como en la patogénesis de la enfermedad de Chagas crónica, permitirá comprender mejor esta enfermedad.

La relación entre el parásito y la patología chagásica crónica todavía no está clara, pero la evidencia actualmente disponible apunta a los mecanismos inmunes, inducidos por el parásito, especialmente los de tipo celular como responsables del daño en los tejidos del huésped4. Linfocitos CD8+ supresores/citotóxicos, IFN-g y macrófagos controlarían la replicación del parásito durante la fase aguda. Anticuerpos líticos específicos mantendrían latente la infección en la etapa crónica. En ambas fases de la infección, linfocitos CD4+, principalmente TH1, otorgarían inmunidad protectora. Al mismo tiempo, linfocitos CD8+ y CD4+ podrían ser los principales responsables del daño a los tejidos del huésped y de la respuesta inmunoinflamatoria crónica, respectivamente, asociada con T cruzi5.

En Chile no se conoce el estado inmunitario de los individuos chagásicos crónicos y, por lo tanto, el objetivo principal de este trabajo es determinar el número y porcentaje de las diferentes poblaciones de linfocitos que circulan en la sangre periférica de estos pacientes. Con este fin se cuantificó por citometría de flujo, las poblaciones CD3+, CD4+, CD8+, B y NK en un grupo de pacientes chagásicos crónicos en comparación con un grupo de individuos no-chagásicos. Además, se comparó el porcentaje de linfocitos CD4+ y CD8+ activados, en ambos grupos.

MATERIAL Y MÉTODO

Chagásicos crónicos: Todas las personas involucradas en este estudio provenían del Hospital Barros Luco-Trudeau, Servicio de Salud Sur. Se seleccionaron 21 individuos chagásicos crónicos pesquisados por serología convencional (IFI y ELISA IgG), que no habían sido sometidos a tratamiento específico. La edad promedio fue de 40 años con un rango entre 26 y 58 años. De éstos, 38,1% eran de sexo femenino.

Grupo control: Se seleccionó a 21 donantes de sangre que no presentaban patología reciente de ningún tipo y negativos por serología convencional para enfermedad de Chagas, HIV, virus hepatitis B, C y Treponema pallidum. La edad promedio fue 31 años, con un rango entre 21 y 56 años de edad. El 9,5% era de sexo femenino. El estudio se realizó bajo consentimiento informado.

Muestra de sangre: Se recolectó 1 ml de sangre periférica mediante punción venosa usando EDTA K3 como anticoagulante para ser usado en la inmunotipificación de células y 3 ml de sangre sin anticoagulante, para serología convencional.

Cuantificación de poblaciones y subpoblaciones celulares: Se realizó por citometría de flujo mediante la detección de marcadores fenotípicos y antígenos de activación usando anticuerpos monoclonales fluoresceinados (FITC) o ligados a ficoeritrina (PE) (Bencton Dickinson): CD45-PE/CD14-FITC; CD3-FITC; CD4-PE; CD8-PE, CD16/56-PE; CD19-PE; HLA-DR-FITC. En todos los casos se usó un control de isotipos g1-PE y g2-FITC. A 30 µl de sangre total se agregaron 6 µl del anticuerpo monoclonal respectivo y se incubaron por 15 min en oscuridad a temperatura ambiente. Luego se agregaron 500 µl de buffer de lisis 1x. La mezcla se centrifugó a 300 g por 5 min, se descartó el sobrenadante y el sedimento fue lavado con PBS 0,1% de azida de sodio. Se centrifugó a 200 g por 5 min y luego el sedimento se resuspendió en formaldehído al 1% . Para el ensayo de citometría, las células marcadas con los diferentes anticuerpos monoclonales fueron sometidas a adquisición en un citómetro FACScan TM, con software Simultest, y luego analizadas con el Software Lysis II.

Estadística: Se realizó por las pruebas de t-Studen't y Mann-Withney de acuerdo a la distribución de las poblaciones linfocitarias: normal o aleatoria con intervalo de confianza de 95%.

RESULTADOS

El recuento absoluto de leucocitos se obtuvo en un contador hematológico. Mediante citometría de flujo se determinó tanto el número absoluto como el porcentaje de linfocitos: linfocitos T totales, CD3+, linfocitos CD4+, linfocitos CD8+, linfocitos CD4+/HLA-DR+ (activados), linfocitos CD8+/HLA-DR+ (activados), células NK y linfocitos B.

Como se muestra en la Figura 1, se detectaron diferencias significativas en el porcentaje promedio de células TCD8+ en ambos grupos, siendo menor en los individuos chagásicos (24,62%) en relación a los individuos controles (29,9%) (p <0,03). Como consecuencia de lo anterior, se encontró diferencia en la proporción CD4+/CD8+, teniendo un promedio mayor el grupo de los individuos chagásicos (2,06), en relación al grupo control (1,53) (p <0,009).

Figura 1. Distribución del porcentaje de linfocitos TCD8+ en el grupo control (N) y en los pacientes chagásicos (CH) (p <0,03). La ordenada representa los porcentajes y la abcisa los grupos de individuos en estudio.

Figura 2. Distribución del índice TCD4+/TCD8+ en el grupo control (N) y en los pacientes chagásicos (CH) (p <0,009). La ordenada representa el índice en unidades y la abcisa representa los grupos de individuos en estudio.

En el resto de los tipos celulares evaluados, tanto en proporción como en números absolutos, no hubo diferencias significativas entre los individuos chagásicos y el grupo control (p >0,05), a pesar que sus respectivos promedios fueron diferentes (Figuras 3 y 4). El porcentaje promedio de las células NK fue más alto en el grupo chagásico, pero la dispersión de los valores hizo que éste no fuese significativo. Por otra parte, tampoco se encontraron diferencias significativas en la relación porcentual de linfocitos CD4+ activados y CD8+ activados entre ambos grupos de individuos.

Figura 3. Comparación del número absoluto de las distintas subpoblaciones linfocitarias. La ordenada representa el número de células por microlitro, y la abcisa las diferentes subpoblaciones linfocitarias. El número sobre las barras representa el valor promedio.

Figura 4. Comparación del porcentaje de las distintas subpoblaciones linfocitarias. La ordenada representa el porcentaje de células, y la abcisa las distintas subpoblaciones. El número sobre las barras representa el valor promedio.

DISCUSIÓN

El objetivo principal de los estudios sobre la inmunidad frente a T cruzi es comprender los mecanismos inmunológicos involucrados tanto en la resistencia a este parásito como en la patogénesis de la enfermedad de Chagas6.

Diferentes estudios han mostrado que linfocitos CD8+ y CD4+ cumplen funciones importantes controlando la multiplicación de los parásitos durante las fases aguda y crónica de la infección, pero también tendrían un papel importante, mediado por citoquinas, en la inmunopatogénesis de la enfermedad de Chagas crónica5,7.

Nuestros resultados muestran una disminución significativa del porcentaje de linfocitos CD8+ y un aumento concomitante CD4+/CD8+, en el grupo de pacientes chagásicos, comparado con el grupo de individuos no-chagásicos. Estos resultados contrastan con aquellos en que se ha reportado un mayor número de linfocitos CD8+ que se correlacionan con la presencia de antígenos parasitarios en pacientes con miocarditis por lo cual se ha sugerido un papel importante de éstos en la patogénesis de la enfermedad6. Otros resultados muestran que linfocitos CD4+ son más numerosos que los CD8+, sugiriendo que una reacción del tipo hipersensibilidad retardada, mediada por CD4+ sería responsable de la inmunopatología de la enfermedad de Chagas8.

Los porcentajes inferiores de linfocitos CD8+, en pacientes chagásicos también podrían atribuirse a alteraciones en la expresión de estas moléculas, provocadas por T cruzi y que explicarían el desarrollo de inmunosupresión observado en la infección por este parásito9.

En relación con la población NK, la mayoría de los pacientes chagásicos estudiados mostró un número elevado de estas células, con respecto al grupo control, por lo que se encontraron diferencias importantes en los promedios de ambos grupos, sin embargo, la dispersión de los datos no permitió establecer diferencias significativas. Durante la infección experimental por T cruzi se ha descrito un aumento de citotoxicidad por células NK10, por lo que sería relevante cuantificar esta población celular en pacientes agrupados según la presencia o ausencia de signos clínicos.

El análisis del estado de activación de las subpoblaciones CD4+ y CD8+ no mostró diferencias significativas entre los grupos, en contraste con los resultados en pacientes brasileños, donde se reportó un aumento en los porcentajes y números absolutos de células CD3+/HLA-DR+11.

Actualmente, el rol patogénico directo del parásito ha sido fuertemente apoyado por la utilización tanto de técnicas inmunohistoquímicas sensibles como por PCR, las que muestran una estricta correlación entre la presencia del parásito y las lesiones en los tejidos12. De esta manera se ha debilitado la idea antes preponderante, que adjudicaba la patogénesis de la enfermedad de Chagas a mecanismos de autoinmunidad13. Debido a esto, se ha rescatado la noción que debido a la gran variabilidad genética de T cruzi, podrían existir clones y cepas con diferente capacidad para inducir respuesta inmune protectora y/o patogénica, lo que determinaría el curso de la enfermedad. Al respecto, los porcentajes inferiores de linfocitos CD8+, supresores/citolíticos, encontrados en este trabajo con respecto a lo descrito en pacientes de otros países, como Brasil, podría reflejar la inducción de mecanismos defensivos y/o patogénicos que son propios para las cepas de T cruzi que circulan localmente14. Diferencias geográficas también podrían reflejar diferencias genéticas del huésped, las que podrían influir en el tipo de respuesta inmune y así determinar el curso de la infección y las eventuales manifestaciones clínicas de la enfermedad15.

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Correspondencia a: Dra. Gittith Sánchez. Independencia 1027. Casilla 70086 Santiago 7. Chile. E-mail: gsanchez@machi.med.uchile.cl - Fono: 6786757. Fax: 6786124.

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