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Revista médica de Chile

versão impressa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.130 n.4 Santiago abr. 2002

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872002000400009 

Identificación y susceptibilidad
antifúngica de Candida spp aisladas de
micosis invasora. Influencia del
porcentaje de inhibición del crecimiento
para la determinación de CIM

Daniel Alvarado P1, María C Díaz J2, Víctor Silva3

Identification and antifungal susceptibility
of Candida spp isolated from invasive
mycoses. Influence of growth inhibition
percentage to determine minimal
inhibitory concentration

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Background: An increase in the frequency of resistant strains to antifungal drugs has been detected in the last decade. Aim: To report the minimal inhibitory concentration (MIC) to amphotericin B, fluconazole, ketoconazole and itraconazole. To compare the MIC obtained with 80% and 50% of growth inhibition to the azoles. Material and methods: Fifty yeast strains isolated between 1998 and 1999, from 17 adults and 33 children with invasive mycosis were studied. Susceptibility was determined by broth microdilution method with RPMI 1640 plus glucose 2% according to the National Committee for Clinical Laboratory Standards (1997). Results: The most frequently isolated strains were C albicans in 27 cases and C parapsilosis in 12. All isolates were susceptible to amphotericin B. According to the MICs obtained with 80% of inhibition, 12 strains had MICs considered as resistant to azoles. Five strains were resistant both to fluconazole and itraconazole. Considering MICs obtained with 50% of inhibition, only five strains were found resistant to azoles (p <0.05). Using this criterion, only one C glabrata strain was found to be simultaneously resistant to fluconazole and itraconazole. Conclusions: Similar results in the pattern of susceptibility of Candida spp to azoles, to those reported abroad, are obtained when the MIC is calculated using 50% inhibition (Rev Méd Chile 2002; 130: 416-423).
(Key Words: Antifungal agents; Candida; Mycoses)

Recibido el 30 de agosto, 2001. Aceptado en versión corregida el 14 de marzo, 2002.
Programa de Microbiología y Micología, Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina. Universidad de Chile. Santiago, Chile.
1 Tecnólogo Médico, Licenciado en Tecnología Médica.
2 Tecnólogo Médico.
3 Tecnólogo Médico, Magister en Microbiología e Inmunología, Doctor en Ciencias.

En los últimos 20 años se ha observado un aumento progresivo de infecciones invasoras y sistémicas por hongos, siendo estas infecciones una causa importante de letalidad, principalmente en pacientes inmunodeprimidos y hospitalizados en unidades de cuidados intensivos. Las levaduras del género Candida son los principales agentes asociados a estos cuadros y al formar parte de la microbiota del hombre son considerados patógenos oportunistas1-4. Banerjee et al, estudiaron la infección sanguínea en unidades de terapia intensiva en 124 hospitales que participaron del programa "National Nosocomial Infection Surveillance System" (NNISS) entre 1980 a 1989, registrando 25.000 infecciones fúngicas del torrente sanguíneo, de las cuales los procesos debidos a Candida spp en hospitales universitarios de pequeño y gran tamaño aumentaron en 219 y 487%, respectivamente, y en 370% en hospitales no universitarios de gran tamaño5. El incremento de infecciones por levaduras del género Candida fue mayor que el de S aureus, Enterococcus spp y bacilos aerobios Gram negativos. C albicans es responsable de 10 a 15% de las infecciones nosocomiales con aislamiento primario en hemocultivos4. En la década de los 90 se observó además, un cambio en el patrón etiológico de estas micosis, asociado probablemente a la selección de cepas menos sensibles a determinadas drogas antifúngicas3,6-11. El creciente surgimiento de levaduras resistentes es un fenómeno esperado ya que el tratamiento con antimicóticos es realizado por períodos prolongados12,13. Este fenómeno se ha observado en cepas de C albicans, C glabrata y principalmente C krusei, aisladas de candidiasis orofaríngeas en pacientes con SIDA, y en levaduras aisladas de infección urinaria en pacientes cateterizados e internados en unidades de tratamiento intensivo (UTI)7,12-16. Estudios recientes han revelado que el resultado de la clínica y evolución del paciente dependen de su susceptibilidad in vitro17,18. Por tal motivo, el diagnóstico específico del agente y la determinación del perfil de susceptibilidad in vitro tiene consecuencias prácticas para el clínico, en la elección rápida y certera de una mejor conducta

terapéutica6,7,19. Apoyado, además, por la determinación de los puntos de corte para los principales antifúngicos, traduciéndose en los criterios de susceptibilidad, sensibilidad dosis dependiente (SDD) y resistencia13,20. La concentración inhibitoria mínima (CIM) obtenida por microdilución en caldo RPMI 1640 para los azólicos, se considera con el 80% de inhibición del crecimiento, comparándose con el tubo control de crecimiento20. Sin embargo, al introducir nuevas variables que mejoren el rendimiento del método, se interfiere en el procedimiento estandarizado, pudiendo alterar la determinación final de la CIM. Así, recientemente se recomendó la incorporación de glucosa al medio, en concentración de 2%, lo cual ha traído ventajas al favorecer el desarrollo de la levadura, disminuyendo el tiempo de incubación y facilitando la lectura21. Como consecuencia, se ha visto la necesidad de establecer un nuevo porcentaje de inhibición del crecimiento de la cepa para establecer la CIM. En base a estos antecedentes, nuestro trabajo pretendió identificar y evaluar el patrón de susceptibilidad in vitro en cepas de Candida aisladas en nuestro medio a partir de candidiasis invasoras, comparando la CIM obtenida con el 80 y 50% de inhibición del crecimiento para los azólicos, utilizando el método estándar más la incorporación de glucosa al 2% al medio.

MATERIAL Y MÉTODO

Durante 1998 y 1999 fueron remitidas 50 cepas de Candida spp, aisladas de cuadros invasivos de pacientes pediátricos y adultos internados en unidades críticas de hospitales chilenos. Del total de cepas, 36 fueron aisladas de sangre, 10 de lavado bronqueoalveolar (LBA), 2 de catéter, 1 de punción renal y 1 de fístula abdominal. El criterio de inclusión de cepas aisladas de LBA se basó en aspectos clínicos, como un cuadro pulmonar sugerente de infección y microbiológicos, como el aislamiento de levaduras sobre 105 UFC/ml, sin la presencia de otro microorganismo patógeno19.

Identificación de Candida. Las especies de levaduras se identificaron según los procedimientos estándares empleados en micología médica, analizando las características fisiológicas (tubo germinal), bioquímicas (asimilación de azúcares) y micromorfológicas (microcultivo en agar maíz + Tween 80 al 1%) a partir de cultivos jóvenes de 24 h de incubación en agar Sabouraud-glucosa22.

Susceptibilidad antifúngica. La susceptibilidad fue determinada por microdilución en caldo, según el método estándar recomendado por el National Committee for Clinical Laboratory Standards20.

Fueron analizadas cuatro drogas de administración sistémica disponibles en Chile: anfotericina B (Squib), ketoconazol (Janssen), itraconazol (Janssen) y fluconazol (Pfizer). Los antifúngicos se obtuvieron en su presentación original de polvo, proporcionados por cada laboratorio que tiene su respectiva patente. Cada antifúngico fue preparado diluyendo la droga en dimetilsulfóxido (DMSO), obteniendo una concentración de 7,68 mg/ml para fluconazol y de 0,96 mg/ml para itraconazol, ketoconazol y anfotericina B, conservándose a –20°C. A partir de esta solución, se realizaron dos series de diluciones con agua destilada y DMSO para finalmente cargar las microplacas con 50 µL de las distintas concentraciones de cada fármaco. Al agregar 100 µL de inóculo, presentaron los siguientes rangos: fluconazol de 0,05 a 128 µg/ml, mientras que para itraconazol, ketoconazol y anfotericina B fue de 0,03 a 160 µg/ml. Como medio de cultivo se utilizó caldo RPMI 1640 con L-glutamina, tamponado con MOPS a pH 7,0, enriquecido con glucosa al 2%, luego se esterilizó por filtración y se almacenó a 4°C por un período máximo de dos semanas hasta su uso21.

El inóculo se preparó a partir de colonias de levaduras incubadas durante 24 h, para obtener una concentración de 1-5 x 106 UFC/ml, la cual fue determinada por espectrofotómetro. El inóculo fue diluido 1:50 en agua destilada estéril y posteriormente 1:20 en medio RPMI 1640 más glucosa 2% para su uso. Luego se agregó 100 µl del inóculo diluido en las placas de microtitulación que contenían las drogas en distintas concentraciones. La concentración de levaduras final obtenida por pocillo fue 0,5 a 2,5 x 103 UFC/ml. Como control de crecimiento se utilizó el solvente más inóculo en RPMI 1640 y el control negativo fue agua destilada.

Control de calidad. Cada microplaca se cargó con cepas control ATCC con CIM conocidas para las cuatro drogas antifúngicas probadas, correspondiendo la primera a C krusei, Nº 6258 y la segunda a C parapsilosis, Nº 22019.

Incubación y lectura. Las microplacas fueron incubadas a 37°C durante 24 a 48 h. La disminución del crecimiento fue evaluada visualmente, comparándose con los pocillos controles. Además, la lectura de las placas se realizó en un lector de ELISA a 530 nm de absorbancia, para corroborar los resultados. La menor concentración capaz de inhibir el 80% y 50% del crecimiento del microorganismo, fue identificada como la CIM para cada azólico. La menor concentración capaz de inhibir ≥90% del crecimiento del microorganismo fue identificada como la CIM para anfotericina B. Las CIM50 y CIM90 para cada antifúngico fueron determinadas para cada especie.

La susceptibilidad de las cepas frente a cada droga fue clasificada como sensible (S), susceptibilidad dosis dependiente (SDD) y resistente (R), según los criterios establecidos18,20 (Tabla 1).

El análisis estadístico de los resultados de distribución de especies por grupo de pacientes y el número de cepas resistentes según porcentaje de inhibición de crecimiento, fue realizado por el método de Chi2 para tablas de 2x2 con 95% de seguridad de hipótesis nula.

RESULTADOS

Estudiamos un total de 50 cepas de levaduras aisladas entre 1998 y 1999, obtenidas de muestras clínicas representativas de infecciones fúngicas invasoras en 17 pacientes adultos y 33 niños internados en unidades críticas de centros hospitalarios chilenos. Los organismos correspondieron al primer aislamiento de la levadura en cada paciente, siendo representativos del primer episodio de la micosis. La distribución de las especies fue como sigue: C albicans (54%), C parapsilosis (24%), C tropicalis (12%) y C glabrata (10%). Sin embargo, la frecuencia de cada especie difiere entre niños y adultos, observándose a C albicans como el principal agente con 48,5 y 64,7%, respectivamente. Las especies de C no-albicans prevalentes fueron C parapsilosis (27,3%) en niños y la misma especie comparte la frecuencia con C tropicalis (17,6%) en adultos. Por otro lado, cabe resaltar que C glabrata fue aislada sólo en niños, representando el tercer agente en frecuencia con 15,2% en esta población. Todas las cepas presentaron CIM ≤1 µg/mL, frente a anfotericina B, valor considerado sensible (Tabla 2).

Las CIM obtenidas con el 80% de inhibición de crecimiento muestran amplios rangos, donde los valores extremos se presentan en C albicans frente a ketoconazol e itraconazol (0,03-16 µg/mL) y en C tropicalis frente a fluconazol (0,25-128 µg/mL). Frente a itraconazol y fluconazol, 3 especies de Candida, presentaron CIM90 con valores considerados resistentes. C parapsilosis se evidenció como la especie más susceptible a los azólicos (Tabla 3).

Al analizar las CIM para los azólicos con el 50% de inhibición de crecimiento, evidenciamos rangos más próximos, que los observados anteriormente. Al igual que en la Tabla anterior, los valores extremos se observaron en C albicans frente a ketoconazol e itraconazol con valores CIM de 0,03 a 1 µg/mL y 0,03 a 16 µg/mL, respectivamente. Frente a fluconazol, las especies de C glabrata y C tropicalis presentaron rangos de 0,25 a 64 µg/mL. Entre las especies, no se observó ninguna CIM90 con valores considerados resistentes a los azólicos (Tabla 4).

Analizando las CIM para los azólicos, según los criterios de susceptibilidad, obtenidos con el 80 y 50% de inhibición de crecimiento, evidenciamos 12 y 5 cepas resistentes, respectivamente, siendo esta diferencia significativa (p <0,05). Co-resistencia con CIM obtenida con el 80% de inhibición, para fluconazol e itraconazol, fue observada en 5 cepas, siendo 3 C albicans, 1 C glabrata y 1 C tropicalis, por lo cual obtuvimos 17 CIM resistentes. Sin embargo, co-resistencia con CIM obtenida con el 50% de inhibición, frente a estos fármacos fue observada solamente en 1 cepa de C glabrata, dando un total de 6 CIM resistentes (Tabla 5).

DISCUSIÓN

Nuestros datos, al igual que lo publicado por la mayoría de los grupos, evidencian a C albicans como el principal agente de candidiasis invasora con una frecuencia cercana al 50%. Por otro lado, los autores enfatizan el rol de las especies de C no-albicans, como importantes patógenos3,6,8-11,14. En nuestro estudio la especie de C no-albicans prevalente fue C parapsilosis (24%), con una mayor frecuencia en niños (27,3%) que en adultos (17,6%). Datos similares se observaron en Canadá y Latinoamérica durante 19978,14. Sin embargo, en 1998, C glabrata y C tropicalis fueron, respectivamente, las especies de C no-albicans más frecuentes en ambas regiones8,11,14. Durante ese año en USA, C glabrata y C parapsilosis fueron el segundo y tercer agente prevalente, respectivamente8,14. Por otro lado, encontramos a C tropicalis como el tercer agente aislado (12%), prevaleciendo en los adultos (17,6%) en relación a los niños (9,1%). Estudios recientes realizados en Argentina y Brasil muestran que C tropicalis es tan frecuente como C parapsilosis6,10. C glabrata, comienza a ser aislada con relativa frecuencia en nuestro medio, observándose en esta serie, su presencia sólo en la población pediátrica (15,2%). Concordamos con los autores que demuestran un cambio epidemiológico continuo en la etiología de las candidiasis invasoras. Además, hemos observado una tendencia particular en la distribución de las especies de Candida de acuerdo al tipo de paciente. Por ejemplo, en pediátricos las especies de C no-albicans superan el 50% de frecuencia y C glabrata aparece como la tercera especie prevalente. En cambio en los adultos C albicans representó el 64,7% de los aislamientos y no se identificó C glabrata.

Todas las cepas presentaron CIM ≤1 µg/mL frente a anfotericina B, valor considerado sensible, concordando con lo reportado por otros autores7,15. Estos datos in vitro muestran la estabilidad en la susceptibilidad de las especies de Candida, aisladas de cuadros invasores, frente a este fármaco en Chile. Sin embargo, en otros países, recientemente se ha reportado resistencia a este antifúngico en cepas de C no-albicans11,13. Del mismo modo es importante tener en cuenta que, para algunos autores, el método estandarizado por el NCCLS M27-A puede no ser muy eficiente en la detección de resistencia a la anfotericina B11,13,20.

Al analizar la susceptibilidad de las cepas frente a los azólicos, comparando la CIM obtenida con el 80% y 50% de inhibición del crecimiento, observamos un mayor rango de CIM y de valores considerados resistentes con el 80% de inhibición, en el cual las especies C albicans, C tropicalis y C glabrata presentaron CIM90 de 1 µg/mL para itraconazol y 64 µg/L para fluconazol.

Al analizar las CIM para los azólicos obtenidas con el 50% de inhibición de crecimiento, evidenciamos que las CIM90 para fluconazol y ketoconazol fueron sensibles, mientras que para itraconazol, C albicans y C glabrata presentaron CIM90 con valores de 0,5 µg/mL, valor considerado susceptibilidad dosis dependiente (SDD). En un contexto global C parapsilosis se presentó como la especie más sensible a los azólicos. Los resultados de CIM obtenidos con el 50% de inhibición se asemejan a los obtenidos en trabajos de diversos grupos, los cuales relatan el aumento de cepas de C no-albicans con elevados valores de CIM frente a los azólicos7,9,13,14,17.

Al analizar las CIM para los azólicos, según los criterios de susceptibilidad obtenidos con el 80% y 50% de inhibición, evidenciamos 12 y 5 cepas resistentes, respectivamente, siendo esta diferencia significativa (p <0,05). En 5 cepas se observó resistencia simultánea o co-resistencia frente a fluconazol e itraconazol con el 80% de inhibición, lo cual suma un total de 17 CIM resistentes. Por otro lado, co-resistencia con 50% de inhibición, fue observada solamente en una cepa, dando un total de 6 CIM resistentes. Este fenómeno de co-resistencia no ha sido reportado previamente en nuestro país; no obstante, los resultados entregados recientemente por el Programa Internacional de Vigilancia de las Candidemias (SENTRY) muestran este nuevo problema de resistencia, como una alarma epidemiológica8,9,14. Si bien los resultados obtenidos con el 80% de crecimiento, se asemejan a los estudios realizados por ARAJ et al12, en cuanto al elevado número de cepas resistentes a los azólicos (12 de 50), los resultados conseguidos con el 50% de inhibición (5 de 50) concuerdan con trabajos realizados por la mayoría de los grupos, donde se evidencia el alto grado de susceptibilidad de las Candida spp frente a estas drogas8,11,14,15.

A raíz de los resultados obtenidos, podemos decir que en Chile existen varias especies de levaduras del género Candida, responsables de infecciones invasoras, siendo C albicans la más frecuente, seguida de C parapsilosis. La determinación de la CIM con distintos porcentajes de inhibición del crecimiento, influyó significativamente en la clasificación de sensibilidad de las cepas de Candida frente a los azólicos, encontrando que la CIM obtenida con el 50% de inhibición, otorga un patrón de sensibilidad comparable con la realidad extranjera. Además, resaltamos la detección de co-resistencia, siendo este nuevo fenómeno, observado in vitro, de gran interés para el clínico y el laboratorio de Micología Médica, quienes deben prepararse para enfrentar los nuevos desafíos diagnósticos y terapéuticos en las candidiasis invasoras del siglo XXI. Anterior a este estudio, en Chile no existían datos sobre el patrón etiológico y de susceptibilidad en las candidiasis invasoras, por lo cual no podemos realizar una comparación. Esta primera aproximación es de suma importancia para nuestra región, ya que evidencia la presencia de varias especies de Candida aisladas de cuadros invasivos, entre las cuales, algunas cepas presentan elevados perfiles de susceptibilidad frente a los azólicos de administración sistémica. Estos datos ratifican la importancia del diagnóstico precoz de especie y refuerzan la necesidad de estructurar un programa de vigilancia de los agentes aislados, para evaluar continuamente el patrón de susceptibilidad de los agentes de candidiasis invasoras en Chile.

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Correspondencia a: Víctor Silva, Programa de Microbiología y Micología, Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. Independencia 1027, Santiago, Chile. Fono:
56-2-6786427. Fax: 56-2-7355855. E Mail: vsilva@machi.med.uchile.cl

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