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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.130 n.6 Santiago jun. 2002

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872002000600001 

Rev Méd Chile 2002; 130: 603-609

Evaluación de técnicas moleculares e
inmunoenzimáticas para la detección
de E coli enterohemorrágico
en brotes de toxi-infecciones alimentarias

Maricel Vidal O 1, Mónica Carreño C 2, Roberto Vidal A 1, Carolina Arellano C 2, Verónica Solari G 3, Valeria Prado J.

Evaluation of molecular and
immunoenzymatic assays for detecting
Enterohemorrhagic E coli in food borne
outbreaks

Background: Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), is an emergent pathogen that causes sporadic infections and outbreaks of gastroenteritis associated with consumption of contaminated food products. Because detection of EHEC in diarrhea patients is not routinely performed, infection is most probably underestimated. Aim: To compare three techniques to detect EHEC: Colony hybridization with DNA probes, polymerase chain reaction (PCR) for the detection of stx1 and stx2 genes and immunoenzymatic detection by ELISA (Premier EHEC) of Stx1 and Stx2 toxins. Material and methods: Four outbreaks of food-borne gastroenteritis were studied including 16 patients and 78 strains of E coli. Twenty one (26,9%) strains, hybridized with the stx1 probe, 1 (1,3%) hybridized only with the stx2 probe and 36 (46,1%) with both probes. PCR amplification for cytotoxin genes was observed in 6 strains (7,7%) from the second outbreak studied. The immunoenzimatic assay detected the cytotoxins in 18 (23,0%), of the 78 studied strains. Agreement between probes and ELISA was 44,8%, between PCR and probes 34,7% and 82,4% between ELISA and PCR. Conclusions: These results indicate a variable yield among different EHEC detection techniques. Considering PCR as the gold standard, ELISA technique showed a better sensitivity and specificity than probes (Rev Méd Chile 2002; 130: 603-9).
(Key-words: DNA probes; Enzyme-linked immunosorbent assay; Escherichia coli infections; Escherichia coli O157)

Recibido el 4 de enero, 2002. Aceptado en versión corregida el 25 de marzo, 2002.
Trabajo financiado por Proyecto FONDECYT #1000636.
Programa de Microbiología, Instituto de Ciencias Biomédicas (ICBM),
Facultad de Medicina de la Universidad de Chile. Servicio de Salud
Metropolitano del Ambiente (SESMA). Santiago de Chile.
1 Biólogo, Magíster en Ciencias
2 Técnico en Microbiología de Alimentos
3 Médico Veterinario

El concepto de enfermedades transmitidas por los alimentos (ETA), en términos genéricos, se aplica a ciertas afecciones de aparición esporádica y evolución rápida, generalmente de naturaleza entérica adquiridas por el consumo de alimentos y/o agua contaminada. Entre los agentes bacterianos asociados a las ETA, se encuentran las diferentes categorías de E coli diarreogénicos: E coli enterotoxigénico (ECET), E coli enteropatogénico (ECEP) y E coli enterohemorrágico (ECEH); Salmonella spp, Shigella spp, Clostridium spp, Yersinia enterocolítica, y Vibrio cholerae, entre otros1,2.

Dentro de las categorías de E coli diarreogénicos, ECEH, en especial el serotipo O157:H7, representa en la actualidad uno de los patógenos emergentes de mayor importancia en el ámbito mundial3-5. Los factores de virulencia que la caracterizan son: la presencia del locus LEE, que codifica para una serie de proteínas involucradas en la adhesión y destrucción (A/E) de las microvellosidades intestinales de la célula huésped6, y la producción de dos citotoxinas denominadas toxinas Shiga-like (Stx1 y Stx2), Shigatoxinas, Citotoxinas o Verotoxinas7. Los cuadros clínicos que produce van desde una infección asintomática a diarrea acuosa o colitis hemorrágica. De los pacientes infectados por ECEH, principalmente niños, entre 7% a 10% desarrollan como complicación el Síndrome Hemolítico Urémico (SHU), que se caracteriza por anemia hemolítica microangiopática, trombocitopenia e insuficiencia renal aguda8, y que es una patología que tiene una tasa de incidencia de 3,2 por 100.000 niños menores de 5 años en la Región Metropolitana9.

En países industrializados, la ECEH es una causa importante de brotes de ETA, sin embargo en Latinoamérica y específicamente en Chile, muy pocos laboratorios han incorporado la identificación de este patógeno, lo cual se traduce en una subestimación de su impacto epidemiológico y dificulta la implementación de medidas de control y prevención. Existen diversos problemas para el diagnóstico de ECEH, ya que no hay un estándar de oro que permita diagnosticar con exactitud este microorganismo y diferenciarlo de otras E coli. A partir del año 2000, el Servicio de Salud Metropolitano del Ambiente (SESMA) en conjunto con el laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile, reforzó la vigilancia epidemiológica y microbiológica de los brotes de toxi-infección alimentaria registrados en la Región Metropolitana, incorporando la detección de patógenos como ECEH, con el fin de mejorar el diagnóstico microbiológico de los agentes causantes o involucrados en las toxi-infecciones. En los últimos años, se han implementado diversos métodos que permiten la detección de ECEH en forma rápida, utilizando técnicas de biología molecular o ensayos inmunoenzimáticos10-12. Estas técnicas representan estrategias diferentes, cada una con sus ventajas y desventajas, y han sido útiles para detectar las infecciones por ECEH.

En este sentido, nuestro interés se orientó a comparar técnicas disponibles para identificar ECEH en pacientes involucrados en brotes de gastroenteritis, para contar con una herramienta diagnóstica útil frente a sospecha de infecciones por este patógeno.

MATERIAL Y MÉTODO

Muestras clínicas. Para este estudio se analizaron 4 brotes de toxi-infecciones alimentarias ocurridos en la Región Metropolitana entre julio de 2000 y marzo de 2001, que comprometieron a un total de 86 pacientes, de los cuales fue posible recolectar muestras para estudio microbiológico en 16 de ellos. A cada paciente ingresado al estudio se le tomó una muestra de deposición por hisopado rectal y fue transportada al laboratorio en medio Cary Blair. Estas muestras fueron procesadas para búsqueda de bacterias enteropatógenas, virus entéricos y enteroparásitos. El objetivo de este estudio está enfocado a la identificación de ECEH y para ello las muestras fueron sembradas directamente en agar MacConkey, incubadas por 18 a 24 h a 37°C y se seleccionaron cinco colonias lactosa positivas de cada muestra. A cada colonia se le efectuaron pruebas bioquímicas diferenciales internacionalmente recomendadas para la identificación de E coli13. Cada colonia de E coli fue analizada en paralelo por tres técnicas diferentes: hibridación con sondas, PCR y ELISA.

Hibridización con sondas. Las cepas de E coli aisladas de deposiciones, junto con controles positivos y negativos para cada sonda (stx1 y stx2), fueron sembradas en agar TSA usando una plantilla, y se incubaron a 37°C por 18 a 24 h. Posteriormente se traspasaron a un papel filtro (colony blot) y se procedió a denaturar el DNA bacteriano, eliminar restos celulares, realizar la hibridación y el proceso de revelado siguiendo el protocolo descrito previamente por Gicquelais y cols14.

Obtención de DNA templado para la realización de PCR. El DNA se obtuvo a partir de colonias bacterianas desarrolladas en agar MacConkey, que fueron resuspendidas en Tritón X-100 1% y luego lisadas por ebullición 20 min a 100°C. Posteriormente se centrifugó a 9.000 rpm por 5 min y se tomaron 3 ul del sobrenadante para ser utilizado como templado en la reacción de PCR.

Amplificación por PCR. Se realizó una PCR de tamizaje para determinar si cada colonia era o no productora de citotoxinas (Stxs). Como control positivo se utilizó la cepa de E coli 933W que contiene los genes stx1 y stx2; el control negativo fue una cepa de E coli HS negativo para genes stx. La reacción se llevó a cabo amplificando una región conservada para ambas toxinas utilizando los oligonucleótidos descritos por Lin y col15. Se utilizó un programa combinado que constaba de: denaturación inicial a 94°C por 5 min, seguido por 15 ciclos de denaturación a 94°C por 2 min, alineamiento a 40°C por 1,30 min y extensión a 72°C por 1 min; posteriormente 10 ciclos de denaturación a 94°C por 2 min, alineamiento a 42°C por 1,30 min y extensión a 72°C por 1 min; y la extensión final a 72°C fue de 7 min. La PCR fue llevada a cabo en un volumen de 50 ul por muestra que contenía MgCl2 1,5 mM, Buffer 1X, dNTPs 1 mM, 0,25 U de Taq DNA Polimerasa, 10 pmoles de cada uno de los oligonucleótidos (stx5’ y stx3’) y 3 ul de DNA templado. Para las cepas positivas en la PCR de tamizaje, se realizó una subtipificación de las citotoxinas mediante una reacción de PCR múltiple, que incorpora los oligonucleótidos para stx1 y stx2 (Tabla 1). Los componentes de la mezcla fueron utilizados en las mismas concentraciones descritas para la PCR de tamizaje. Se utilizó el programa de amplificación descrito por Cebula y col10.


Visualización de los productos de amplificación. La observación de los productos de amplificación se realizó en geles de agarosa al 0,8% y 2%, para las muestras amplificadas por PCR individual y múltiple, respectivamente. Los geles fueron cargados con 7 ul del amplificado y 3 ul de buffer de siembra y se corrieron a 90 Volts en buffer TAE 0.5X. Posteriormente se tiñeron con bromuro de etidio 0,5 ug/ul y se visualizaron en un transiluminador UV.

Inmunoensayo. Se realizó in vitro, directo desde colonias. Se utilizó una técnica comercial de ELISA (Premier EHEC Meridian Diagnostics Inc. Cincinnati, USA) y se siguió el procedimiento recomendado por el fabricante. La lectura de los resultados se realizó en un espectrofotómetro, a una longitud de onda de 450 nm (negativo DO <0,180, positivo DO >0,180).

RESULTADOS

De las muestras de deposición de los 16 pacientes estudiados se identificaron 78 cepas de E coli, que constituyeron el material para este estudio.

Hibridización con sondas. De las 78 cepas analizadas 58 (74,3%) hibridizaron con una o ambas sondas para las citotoxinas. En 21 cepas (26,9%) se identificó exclusivamente el gen que codifica para la toxina stx1, una cepa (1,3%) hibridizó solamente con la sonda stx2, y 36 cepas (46,1%) fueron positivas con ambas sondas (Tabla 2). Las restantes 20 cepas (25,6%) dieron resultados negativos.


Amplificación de genes de citotoxinas (PCR). En seis de las 78 cepas de E coli analizadas, se observó la amplificación de un fragmento de 900 pb aproximadamente por PCR de tamizaje, correspondiente a la región conservada que incluye los genes para stx1 y stx2 (7,7%) aisladas de pacientes del brote número 2 (Figura 1A) (Tabla 2). De estas seis cepas, 2 amplificaron sólo para el gen stx2 y 4 lo hicieron para ambos genes (stx1 y stx2) (Figura 1B). Las 72 cepas restantes (92,3%) fueron negativas.

Figura 1. Amplificación por PCR de tamizaje para el gen stx (A) y por PCR múltiple para los genes stx1 y stx2 (B). Carriles: A 1) Marcador de peso molecular (100 pb); 2) C1; 3) C6; 4) C7; 5) C8; 6) C10; 7) C18; 8) Control positivo; 9) Control negativo. B 1) Marcador de peso molecular (100 pb); 2) C1; 3) C6; 4) C7; 5) C8; 6) C10; 7) C18; 8) Control positivo stx1; 9) Control positivo stx2; 10) Control negativo.
stx: región conservada que contiene las secuencias nucleotídicas para ambas toxinas stx1 y stx2.
C: colonia bacteriana.

Técnica inmunoenzimática. Se pudo detectar presencia de las citotoxinas en 18 cepas (23%) de las 78 cepas de E coli estudiadas (Tabla 2). Las lecturas fluctuaron entre DO 0,290 y 1,870 a 450 nm.

Comparación en el rendimiento de las tres técnicas. En la Tabla 3 se analiza el rendimiento comparativo de cada técnica y la concordancia entre ellas. La concordancia entre sondas y ELISA fue de 44,8%; entre PCR y sondas de 34,7% y 82,4% entre ELISA y PCR. Considerando la PCR como patrón de referencia (gold standard), la sensibilidad establecida para ELISA fue de 83% y para sondas de DNA 100%. La especificidad de ELISA fue de 82% con un valor predictivo positivo de 28% y negativo de 98% y para las sondas de DNA la especificidad fue de 29,1%, el valor predictivo positivo de 10,5% y el negativo de 100%.


DISCUSIÓN

Como consecuencia de cambios socio-económicos y culturales que han afectado la tradición de la vida familiar, hoy en día un gran número de personas comen fuera del hogar y se encuentran expuestas a las enfermedades trasmitidas por los alimentos (ETA). Es así, que en los países industrializados se ha puesto mucho énfasis en la vigilancia y control de brotes de toxi-infección alimentaria en los cuales E coli enterohemorrágico aparece como protagonista importante.

En Chile, muy pocos laboratorios clínicos han incorporado algún método de diagnóstico para ECEH, y aquellos que lo han hecho utilizan el cultivo en medios selectivos (agar MacConkey sorbitol) orientado sólo al diagnóstico presuntivo del serogrupo O157.

En este trabajo, se analizaron comparativamente, tres técnicas recomendadas y utilizadas para la detección de las citotoxinas producidas por ECEH. Dos de estas técnicas identifican los genes que codifican para las citotoxinas, sondas de DNA y la PCR; en cambio la tercera que es un inmunoensayo, detecta la presencia del producto de estos genes, es decir las citotoxinas.

La técnica de PCR se ha planteado como una herramienta molecular muy útil en el diagnóstico de enfermedades producidas por patógenos bacterianos. En este caso se utilizaron partidores que amplifican una región conservada que contiene las secuencias para ambas citotoxinas descritas (Stx1 y Stx2), como un método de tamizaje para detectar cepas toxigénicas. Por este ensayo sólo se detectaron 6 cepas de E coli (7,7%) positivas, en las cuales se amplificó un fragmento de 900 pb aproximadamente. Posteriormente a estas cepas se les realizó una subtipificación de las citotoxinas, en donde se observó que el patrón característico fue stx1-stx2, similar a los resultados obtenidos con el uso de sondas. Esta segunda PCR confirmó en todos los casos los resultados obtenidos con la PCR de tamizaje. Esta técnica fue considerada como el patrón de referencia para analizar el rendimiento de las tres metodologías incluidas en el estudio.

De las 78 cepas (colonias) estudiadas, 58 de ellas hibridizaron con una o ambas sondas utilizadas, en las cuales el patrón genotípico más prevalente fue stx1-stx2 (46,1%), seguido de stx1 (26,9%) y finalmente stx2 (1,28%). La sensibilidad de esta técnica resultó en 100%, no así la especificidad que fue 29,1%.

El ensayo de ELISA es uno de los métodos más utilizados para la detección de diferentes antígenos, en este caso se utilizó para detectar la presencia de citotoxinas en colonias bacterianas previamente aisladas desde deposiciones de pacientes involucrados en brotes de toxi-infección alimentaria. En este estudio tanto la sensibilidad de esta técnica como la especificidad resultaron muy adecuadas, 83% y 82%, respectivamente. Como se observa en la Tabla 3, tiene una baja frecuencia de resultados falsos negativos, 1,3%, y 16,7% de falsos positivos. Entre las ventajas prácticas hay que señalar que los resultados se obtienen en 24 h y no requiere de una infraestructura compleja ni de personal altamente calificado. Los resultados obtenidos por ELISA deben ser confirmados por técnicas moleculares.

Comparativamente los resultados obtenidos con las tres técnicas fueron dispares, el uso de sondas fue lo que entregó un mayor porcentaje de cepas positivas, sin embargo esta técnica presentó un valor de especificidad muy bajo (29,1%), respecto a las otras dos técnicas y por lo tanto la interpretación es que tiene un alto porcentaje de resultados falsos positivos (65,4%) (Tabla 3). Por otro lado, esta técnica requiere de mayor tiempo para la obtención de resultados (72 h), a diferencia de la técnica de ELISA (24 h) y de la PCR (30 h).

Los resultados de la Tabla 3 muestran que el mayor porcentaje de concordancia entre resultados positivos y negativos se observó entre ELISA y PCR y corresponde a un 82,4%. Por lo tanto, consideramos estas dos últimas técnicas como las más recomendables para ser utilizadas como herramientas de diagnóstico de ECEH.

Al considerar los resultados obtenidos con cada una de las técnicas evaluadas en conjunto con otros parámetros de laboratorio, clínicos y epidemiológicos, la técnica de PCR resulta la de mayor coherencia, ya que sólo identificó cepas de ECEH en pacientes de un brote (Nº 2), la serogrupificación correspondió a O157, fue el único enteropatógeno aislado, el grupo afectado fue niños de un jardín infantil y se asoció a consumo de tallarines con carne molida. En los restantes 3 brotes de los cuales se estudiaron pacientes, fueron identificados otros enteropatógenos, en un brote E coli enteropatogénico serogrupo O26 y Salmonella spp en los restantes dos brotes asociados al consumo de queso de cabra artesanal.

Diversos estudios han mostrado que la PCR es una técnica confiable y de una alta sensibilidad, y se ha descrito su utilidad en el diagnóstico precoz de infecciones por ECEH16,17. De acuerdo a esto, y sobre la base de los resultados obtenidos, se ha considerado a la PCR como la técnica más ventajosa para ser utilizada en el diagnóstico de ECEH en muestras de pacientes involucrados en brotes de toxi-infecciones alimentarias. Su utilización en el ámbito de laboratorios clínicos puede no ser factible todavía en nuestro país, pero debería ser implementada en laboratorios de referencia y estar disponible para confirmar los resultados obtenidos por otras técnicas.

Finalmente, cada laboratorio debe elegir la técnica que le resulte más apropiada de acuerdo a la infraestructura que posea, la capacitación del personal y los recursos disponibles para la adquisición del equipamiento necesario, entre otros factores.

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Correspondencia a: Valeria Prado J. Programa de Microbiología. Av. Independencia 1027. Teléfono: 56-2-678 6641. Fax: 56-2- 735 5855. E-mail: vprado@machi.med.uchile.cl

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