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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.130 n.7 Santiago jul. 2002

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872002000700004 

Rev Méd Chile 2002; 130: 737-744

Estudio piloto de la fusión PML/RARa
por el método de hibridación in situ
con fluorescencia (FISH) en leucemia
aguda promielocítica

María Eugenia Legües S1, Giannina Franco C1,
Pablo Bertin C.

Pilot study of PML/RARa fusion by
fluorescence in situ hybridization
(FISH) method in acute
promyelocytic leukemia

Background: Acute promyelocytic leukemia (APL) is characterized cytogenetically by t(15;17) (q22;q21) and its molecular consequence, fusion of PML and RARa genes. The detection of this genetic marker confirms the diagnosis and allows monitoring of the leukemic clone during treatment, which has prognostic value. Cytogenetics fails in some cases due to the absence of metaphases in cultures or their bad morphology. Southern blot and PCR methods require trained personnel and adequate equipment. FISH method allows the identification of chromosomic rearrangements in 24 to 48 h and is simple to set up in a cytogenetics laboratory. Aim: To evaluate the FISH method to detect PML/RARa fusion, compared to cytogenetic analysis. Patients and methods: Fifteen bone marrow specimens from APL patients with previous cytogenetic analysis were studied, using a commercial probe to detect PML/RARa fusion. Results: We obtained a normal cut-off value of 9.1%. Specificity and sensibility were 100%. Six positive cytogenetic cases at diagnosis were FISH positive. Six negative cytogenetic cases, one APL at diagnosis and five normal controls were FISH negative. One case in remission, that was negative by cytogenetics, was positive near the cut-off value by FISH. Two other cases in remission, not conclusive by cytogenetics, were negative by FISH. Conclusions: FISH is a reliable, rapid and relatively low cost method that can be used as an adjunct to conventional cytogenetics (Rev Méd Chile 2002; 130: 737-44).
(Key Words: Cytogenetics; In situ hybridization, fluorescence; Leukemia, promyelocytic, acute)

Recibido el 26 de diciembre, 2001. Aceptado en versión corregida el 15 de mayo, 2002.
Trabajo financiado parcialmente por la Dirección de Investigación y Postgrado,
Pontificia Universidad Católica de Chile (proyecto 98/13E).
Laboratorio de Hematología, Departamento de Hematología-Oncología,
Pontificia Universidad Católica de Chile.
1 Tecnóloga Médica

La leucemia aguda promielocítica (LAP) o leucemia mieloide aguda subtipo M3 según la clasificación Franco Americano Británica1 representa aproximadamente 20 a 30% de las leucemias mieloides agudas de los adultos en la población de origen hispano en Estados Unidos de América2,3. Fue reconocida como una entidad clínica en el año 19574. Tiene características únicas en cuanto a presentación clínica, morfología, citogenética y pronóstico. La enfermedad se presenta típicamente con una diátesis hemorrágica que frecuentemente es exacerbada por la quimioterapia citotóxica, llevando a una tasa relativamente alta de mortalidad temprana, principalmente por hemorragia intracraneal5.

El tratamiento con ATRA (all-trans-retinoic acid) que produce maduración de los blastos mieloides, en combinación con quimioterapia con idarubicina, logra sobre 90% de remisión completa y una sobrevida actuarial a 2 años libre de eventos de 79%6. Los pacientes que recaen son fácilmente rescatables en segunda remisión y sobreviven largo tiempo con mayor frecuencia que pacientes con otras leucemias mieloides. Actualmente la sobrevida a largo plazo de los pacientes con LAP es más de 60%7 con una morbilidad aceptable relacionada al tratamiento.

En el año 1977, Rowley y cols8 comunicaron que en la LAP se encontraba constantemente una anormalidad cromosómica consistente en una translocación recíproca y balanceada entre los brazos largos de los cromosomas 15 y 17 (Figura 1).


FIGURA 1. Cariotipo de una LAP:
46,XX,t(15;17)(q22;q21).

Como consecuencia de esta translocación, se produce una fusión de parte del gen PML (Promyelocytic Leukemia) que se ubica en 15q22, con parte del gen RARA o RARa (receptor alfa del Acido Retinoico), ubicado en 17q219,10 (Figura 2).


FIGURA 2. Ideograma que representa la ubicación de los genes PML y RARa en los cromosomas 15 y 17 normales (lado izquierdo) y translocados (lado derecho).

Esta alteración genética es altamente específica ya que se presenta sólo en este tipo de leucemia y presumiblemente está involucrada en su génesis.

El porcentaje de casos con translocación t(15;17) (q22;q21) detectados por citogenética varía entre 70 y 90% en las distintas series publicadas11. Estas variaciones se deben a las dificultades que presenta el análisis citogenético de alteraciones sutiles en leucemias, donde es frecuente la obtención de metafases de mala morfología.

La fusión PML/RARa puede ser detectada por métodos de biología molecular como Southern blot y RT PCR (reacción en cadena de la polimerasa, de transcripción reversa). Sin embargo, estos métodos requieren personal altamente experimentado e infraestructura adecuada12.

La metodología que ha aumentado notablemente el potencial de la citogenética en la identificación de rearreglos cromosómicos en células metafásicas e interfásicas, es la hibridación in situ con fluorescencia (FISH), que se basa en la hibridación de un ADN problema con un trozo de ADN de secuencia conocida llamado sonda, marcado con un fluorocromo, que permite la detección y localización de una secuencia específica de ácidos nucleicos dentro del núcleo sin que éste pierda su estructura13.

El presente trabajo es un estudio piloto que pretende estandarizar una técnica de citogenética molecular a través de la metodología FISH, empleando un reactivo comercial para detectar la fusión PML/RARa, evaluando además su sensibilidad y especificidad con respecto a la citogenética clásica como método de referencia, en muestras de células guardadas, sobrantes de estudios citogenéticos. El objeto es disponer de ella en forma expedita para estudios de diagnóstico de LAP que hayan tenido citogenética no informativa por ausencia de mitosis en los cultivos o metafases de mala morfología, ausencia de muestra para estudio molecular por PCR, o casos citogenéticamente negativos que no coinciden con la clínica y otros parámetros del paciente, además de su utilidad en el estudio de pacientes en remisión clínica (enfermedad residual mínima).

MATERIAL Y MÉTODO

Pacientes. Se analizaron 15 muestras de células de médula ósea fijadas en ácido acético-metanol, de 14 pacientes con estudio citogenético previo en el Laboratorio de Hematología del Hospital Clínico de la Pontificia Universidad Católica de Chile, conservadas a -45°C desde el año 1993 hasta 1999.

Las muestras se dividieron en cuatro categorías. Las primeras tres incluían pacientes con LAP diagnosticados por criterios clínicos y morfológicos. La cuarta, controles negativos.

1. Seis pacientes con LAP al diagnóstico, t(15;17) (q22;q21) positivo por citogenética. 2. Un paciente con LAP al diagnóstico, t(15;17)(q22;q21) negativo por citogenética. 3. Tres muestras de 2 pacientes con LAP en remisión clínica y hematológica: uno con citogenética normal8, el otro con dos muestras estudiadas con 15 meses de diferencia (9a, 9b) con resultado no concluyente por mala morfología de los cromosomas. 4. En esta categoría se incluyeron 5 muestras correspondientes a 5 pacientes con Síndrome Mieloproliferativo Crónico (SMPC) tipo trombocitemia esencial, sin alteraciones citogenéticas, que fueron los controles negativos.

Estudios citogenéticos. Se realizaron según el método descrito anteriormente14 analizando un mínimo de 25 metafases y siguiendo las normas del ISCN (International System for Human Cytogenetic Nomenclature)15.

Hibridación in situ con fluorescencia (FISH). Para este trabajo se utilizó el reactivo específico para detectar el reordenamiento PML/RARa (Vysis Inc.) que contiene dos sondas de ADN: una para el gen PML que comienza en el intron 7, un tramo de 5,8 Kb y se extiende hacia el centrómero del cromosoma 15 aproximadamente 180 Kb y una para el gen RARa que comienza menos de 6 Kb en el lado 3' hacia el intron 2 y se extiende aproximadamente 400 Kb hacia el telómero del cromosoma 17, ambas marcadas en forma directa con un fluorocromo diferente. La sonda PML está marcada con uno de espectro de emisión naranjo y la sonda RARa con uno de espectro de emisión verde. Además contiene solución tampón para diluir y ADN bloqueador para minimizar la hibridación con secuencias repetitivas ubicadas en otros cromosomas.

El método consistió en la extensión de unas gotas de muestra de células suspendidas en fijador (ácido acético-metanol) conservadas a -45°C, en un portaobjetos. Esta preparación se sometió a un pretratamiento de 30' con SSC 2x (citrato salino estándar) a 37°C para envejecer los cromosomas, denaturación del ADN con formamida al 70%/SSC 2x por 5' a 73°C, deshidratación por incubación de 1' en una serie de etanoles (70, 85 y 100%). Simultáneamente se denaturó la sonda de ADN por 5' a 73°C. Luego se aplicó 10 µl de la sonda sobre la lámina, se cubrió con cubreobjetos de vidrio, se selló con parafina líquida e incubó en cámara húmeda a 37°C durante 12 a 16 h para dar tiempo a la hibridación.

Al día siguiente se retiró el cubreobjetos para efectuar los lavados post hibridación con SSC 0,4x/NP-40 (detergente no iónico) 0,3% por 2' a 73°C, luego con SSC 2x/NP40 0,1% por 5'' a t° ambiente.

Las láminas se secaron en oscuridad y se les aplicó 10 µl de medio de montaje consistente en DAPI (4,6-diamino-2 fenilindole) 125 ng/µl con antifade (p-fenilendiamino y glicerol en buffer fosfato salino). El DAPI se une al ADN y emite fluorescencia azul. Permite ver la cromatina nuclear de fondo. El antifade disminuye el blanqueado o decolorado que sufre el fluorocromo al ser iluminado. Luego se cubre el área con cubreobjetos de vidrio para ser examinada.

Las preparaciones se protegieron de la luz y se mantuvieron a -20°C entre las observaciones. El análisis se realizó en un microscopio Nikon de epifluorescencia, con lámpara de mercurio de 100 watt y filtro triple adecuado para observar señales fluorescentes rojo, verde y azul. Dos observadores (MEL y GF) analizaron 100 células interfásicas en forma incógnita e independiente, calculando el porcentaje de células negativas y positivas para la fusión PML/RAR_ en cada muestra. En una serie aparte registraron las metafases encontradas.

En las células interfásicas, cada señal de hibridación se observó como una mancha o un punteado más disperso, dependiendo del estado de condensación del ADN. Las células negativas para la fusión PML/RARa, se observaron con dos señales rojas y dos señales verdes separadas e independientes (patrón normal de señales) (Figura 3a). Las células positivas mostraron una señal roja y una verde independiente y una señal de fusión verderroja, a veces amarilla por blanqueamiento de la luz al estar los dos fluorocromos juntos (Figura 3b).


FIGURA 3. A. Célula interfásica negativa para el reordenamiento PML/RARa, que muestra dos señales rojas (PML) y dos verdes (RARa), independientes. B. Célula interfásica positiva, con una señal roja, una verde y una amarilla de fusión PML/RARa.

En las células metafásicas, cada señal podía observarse como doble si estaban separadas las cromátidas de los cromosomas.

Las imágenes para esta publicación fueron capturadas con un equipo Cytovision de Applied Imaging Corporation.

RESULTADOS

En el proceso de análisis se encontró una proporción de células que no tenían las señales claramente visibles, consideradas no analizables. El promedio entre los dos observadores, fue 13% con un rango de 5 a 24%. Este valor es variable de un laboratorio a otro, debido a diferencias en la preparación de las muestras, filtros utilizados en el microscopio y uso de equipos computarizados o simples para observar la fluorescencia.

Al comparar los porcentajes de células con señal de fusión PML/RAR_ obtenidos para las 15 muestras entre ambos observadores, se encontraron diferencias no significativas. El coeficiente de correlación de Spearman fue 0,69 (p <0,005). Los resultados se calcularon con el promedio de los dos observadores.

La eficiencia de hibridación, que se define como el porcentaje promedio de células que muestran un patrón normal de señales en los controles negativos, para nuestro estudio fue 94% (rango = 92,3 - 94,8 DS = 1,02).

El valor de corte normal, que se define como el porcentaje máximo de células positivas presentes en los controles negativos (células que por coincidencia o sobreposición muestran las dos señales juntas simulando una fusión), se calculó del porcentaje promedio de células positivas obtenidas en los cinco controles negativos, más 3 DS y fue 9,1% (Tabla 1). Por lo tanto un valor igual o mayor a éste de señales de fusión fue considerado positivo en nuestro estudio.


Resultados de pacientes. Los resultados de FISH realizado a los 14 pacientes se muestran en la Tabla 2, en conjunto con el estudio citogenético. Algunos fueron analizados además por PCR y se incluye el resultado. Los 6 pacientes con LAP al diagnóstico (Categoría 1) fueron positivos en un alto porcentaje de células para la señal de fusión. Los 5 pacientes controles negativos (Categoría 4) fueron negativos en alto porcentaje de células. El caso 7, LAP al diagnóstico, con citogenética normal resultó FISH negativo, corroborando el resultado citogenético. Llama la atención que un PCR realizado a este paciente en recaída, dos años después, fue positivo.


De las 3 muestras de LAP en remisión (Categoría 3), la 8 fue positiva, cercana al valor de corte. Las dos restantes fueron negativas, como también lo fue el PCR.

En 9 pacientes se pudo analizar además células en metafase. En la Tabla 3 se presentan los resultados. Existe una correspondencia de las células metafásicas con el resultado obtenido en interfases, salvo en el paciente 8, estudiado en remisión, que presenta 10,4% de células interfásicas positivas y tres metafases negativas, cuyo hallazgo se explica por ser cercano al valor de corte.


La Figura 3 muestra una célula negativa (A) y una positiva (B) para el reordenamiento PML/RARa.

Sensibilidad y especificidad. En este trabajo, la sensibilidad y especificidad se calcularon tomando en cuenta los pacientes de las categorías 1, 2 y 4 (total= 12) por ser estudiados al diagnóstico, situación en que el resultado citogenético y de FISH es consistente.

Tanto la sensibilidad como la especificidad encontradas correspondió a 100%.

DISCUSIÓN

En este estudio se encontró un coeficiente de correlación de Spearman entre los 2 observadores, cercano a 0,7 con un alto grado de significación. La mayor variación estuvo en el componente de células positivas que presentaron los casos negativos para la fusión PML/RARa. Por esto es importante definir a priori el tipo de señal que se dará como positiva y cuál como negativa. Es decir, si hay una señal roja y una verde muy cerca pero sin sobreponerse, se tomará siempre como negativa o siempre como positiva según el criterio preestablecido.

Al montar el método se observó que la cantidad de reactivo (sonda) necesaria para el examen en el área de 22 x 22 mm (cubreobjetos) podía reducirse a 5 µl (mitad de lo sugerido por los fabricantes) sin alterar su buen funcionamiento. Esto se puso en práctica con la consiguiente baja en el costo del examen prácticamente en 50%.

Se logró una buena estandarización de los procedimientos y confiabilidad de los resultados. Se observó que el análisis de 100 núcleos interfásicos es suficiente para establecer el resultado de una muestra, similar a lo encontrado por otros autores, como también el valor de corte normal16.

El método FISH en la práctica rutinaria de los laboratorios dedicados a citogenética onco-hematológica, presenta muchas ventajas. Su relativa sencillez de realizar, costo moderado, equipamiento no muy sofisticado, tiempo total de procesamiento de 24 a 48 h. Puede ser utilizado en células frescas como también conservadas en fijador durante años en un congelador.

Otro aspecto destacable es que la investigación de células tanto en interfase como metafase, aumenta la posibilidad de encontrar la fusión PML/RARa, lo cual en citogenética clásica se ve limitado a la cantidad y calidad de las metafases obtenidas.

Los casos con t(15;17) al diagnóstico (1 al 6) mostraron alta proporción de células con señal de fusión, como era lo esperado y los de citogenética normal (11 al 15), alta proporción de células negativas.

El caso 7, en que no se detectó la fusión PML/RARa al diagnóstico, pero sí en la recaída (por PCR) fue interpretado como una aparición tardía de la fusión, evento raro, similar al publicado por Temperani17. Este caso se incluyó en el estudio, justamente por tratarse de una LAP típica por clínica y morfología, en que no se encontró la t(15;17) presentando cromosomas de buena calidad. La citogenética en la recaída mostró cariotipo normal. Por escasez de muestra de la recaída no se realizó FISH.

Los 2 pacientes de la categoría 3 mostraron otro aspecto de la sensibilidad del método FISH, que se refiere a niveles mínimos de detección de la alteración. Los resultados son similares entre FISH y PCR. Por citogenética el paciente 8 mostró resultado normal y el 9 en sus dos muestras fue no concluyente. Estos casos se incluyeron en el estudio para observar la tendencia del método FISH en la detección de la enfermedad residual mínima, ya que el resultado es cuantitativo. Aunque es escaso el número de muestras, se aprecia cierto poder de detección, comparando los resultados con el PCR. La citogenética es menos eficiente porque estudia menor cantidad de células y no es informativa cuando las metafases no son analizables. Por las observaciones señaladas, recomendamos el uso del método FISH en casos como los siguientes: necesidad urgente del resultado para el pronto inicio del tratamiento del paciente, rendimiento inferior a lo esperado en el estudio citogenético clásico y en caso de no contar con un laboratorio de biología molecular de experiencia, para monitoreo de la enfermedad residual mínima.

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Agradecimientos:

Agradecemos al Dr. Eduardo Guarda por facilitar el uso del microscopio de fluorescencia y a la Dra. Gabriela Repetto por la lectura crítica del manuscrito.


Correspondencia a: María E Legües. Departamento de Hematología-Oncología, Facultad de Medicina, Pontificia Universidad Católica de Chile. Lira 44, Santiago. Fax: (56-2) 6392544.