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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.130 n.9 Santiago sep. 2002

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872002000900001 

Rev Méd Chile 2002; 130: 957-963

Efecto de la vitamina E(DL a-tocoferol)
sobre el daño cromosómico en linfocitos
de pacientes con ataxia telangiectasia

Katherine Marcelain C1a, Carmen Luz Navarrete Sb,
Mireya Bravo Lc, Manuel Santos Ad, Cecilia Be R2e y
Juana Pincheira V3a

Effect of vitamin E (DL a-tocopherol)
on chromosomal damage in lymphocytes
from patients with ataxia telangiectasia

Background: In ataxia telangiectasia (A-T), the lack of a functional ATM kinase is associated with disturbances in the processing of DNA damage and a chronic oxidative stress. These disturbances may be responsible for an increment of chromosomal damage in A-T cells. Aim: To study the in vitro effect of vitamin E (DL-a-tocopherol) on the frequency of chromosomal damage of lymphocytes from patients with A-T. Patients and methods: Seven patients with A-T and age-sex matched controls were studied. Chromosomal damage in mitosis was evaluated in lymphocytes cultures both under basal conditions and when G2 repair was prevented by 5 mM caffeine. Results: In cells from patients with A-T, vitamin E induced a 57.1 and 47.9% decrease in chromosomal damage under basal and inhibited G2 repair conditions, respectively. However, there was a non significant improvement in their repair activity. Vitamin E effects on chromosomal damage was not significant in control subjects. Conclusions: Vitamin E reduces chromosomal damage in lymphocytes from patients with ataxia telangiectasia (Rev Med Chile 2002; 130: 957-63).

(Key Words: Ataxia telangiectasia; Chromosome fragility; Vitamin E)

Recibido el 14 de enero, 2002. Aceptado en versión corregida el 23 de julio, 2002.

aPrograma de Genética Humana, ICBM. bServicio de Pediatría, Unidad de Inmunorreumatología, Hospital Roberto del Río. Santiago - Chile. cCentro de Bioética, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. Santiago - Chile. dDepartamento de Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias Biológicas. Pontificia Universidad Católica de Chile. Santiago - Chile. Laboratorio de Citogenética. eClínica Las Condes. Santiago - Chile.

1 Médico Veterinario. Tesista del Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas. Facultad de Medicina - Universidad de Chile

2 Tecnológo Médico

3 PhD

La ataxia telangiectasia (A-T) es una enfermedad genética, autosómica recesiva, con una incidencia estimada de 1 en 40.000 a 300.000 nacidos vivos1. Las características clínicas y celulares más frecuentes en los afectados son: Ataxia cerebelar progresiva, telangiectasias óculo-cutáneas, inmunodeficiencia, hipersensibilidad a las radiaciones ionizantes y predisposición a neoplasias, especialmente linfomas y leucemias2.

El fenotipo A-T ha sido correlacionado con mutaciones en el gen que codifica para la proteína ATM, ubicado en el brazo largo del cromosoma 11 (11q 22.23)3. La ATM (A-T mutado) es una proteína quinasa, que participa en la detección de daño en el DNA y en la activación de diferentes vías de transducción de señales, algunas de las cuales forman parte del procesamiento de las lesiones que afectan al DNA.

En células proliferantes normales, la eliminación del daño presente en el DNA requiere una actividad coordinada de las vías de chequeo (checkpoints) que regulan la progresión de las células a través del ciclo celular y de los mecanismos encargados de reparar los distintos tipos de lesiones en el DNA4. En presencia de fracturas bicatenarias en el DNA, la ATM activa las vías de chequeo a través de la fosforilación de las proteínas p53; RPA y Chk2 o p53 y Chk1, lo cual trae consigo la detención de la progresión del ciclo proliferativo en G1/S; S/G2 o G2M, respectivamente5,6. Esta detención transiente permite que los mecanismos de reparación puedan remover el daño durante un tiempo adicional. Dos de estos mecanismos de reparación encargados de reparar las fracturas mono y bicatenarias en el DNA son la recombinación homóloga (HR) y la reunión de extremos libres por recombinación no homóloga (NHEJ). La actividad de estos mecanismos depende de la presencia del complejo proteico constituido por nibrina (Nbs1), el factor Mre 11 y el factor Rad 50. La formación y activación de este complejo requiere la fosforilación de la Nbs1, la cual es realizada por la ATM7,8.

En las células A-T la falta de ATM funcional resulta en un bloqueo de las vías señaladas, lo que determina un incremento del daño no reparado en el DNA, que conduce a una inestabilidad genómica en estas células y a una alta predisposición al desarrollo de neoplasias en los pacientes A-T. Además, la ausencia de ATM en las células A-T también sería determinante de un estado de estrés oxidativo crónico, aun en ausencia de agentes inductores de daño oxidativo9-11. Ello conduciría a la acumulación de daño oxidativo sin reparar, lo cual sumado a la inactividad de los mecanismos de chequeo serían responsables del envejecimiento prematuro12, y de las alteraciones en la proliferación celular observadas en las células A-T1,2.

En estudios previos hemos mostrado que en linfocitos de pacientes con patologías genéticas, tales como síndrome de Down y anemia de Fanconi, cuyas células presentan un elevado nivel de radicales oxidantes, el tratamiento con vitamina E disminuyó la frecuencia de daño cromosómico y mejoró la actividad reparativa en linfocitos cultivados in vitro13,14.

Por lo tanto, considerando que algunas de las características clínicas y citológicas de los pacientes A-T puedan ser consecuencia del incremento de daño oxidativo, estudiamos el efecto in vitro de la vitamina E en la frecuencia de daño cromosómico basal y en G2, en linfocitos de pacientes A-T. La frecuencia de daño cromosómico en G2 fue estimada mediante el tratamiento de las células con cafeína, un inhibidor de la reparación del DNA dañado durante G2. Encontramos que en las células A-T la alta frecuencia de daño cromosómico basal y en G2 es disminuida por la vitamina E en alrededor de 50%.

MATERIALES Y MÉTODOS

Pacientes: Se estudiaron 7 pacientes con ataxia telangiectasia (A-T), cuyas edades y sexo se encuentran especificadas en la Tabla 1. Cada paciente A-T y su respectivo control normal (igual edad y sexo), fueron estudiados en paralelo. Los criterios de diagnóstico para los probandos A-T fueron: i) Manifestaciones clínicas (ataxia troncal, apraxia óculo-motora, telangiectasia óculo-cutánea y niveles elevados de a feto proteína); ii) Datos citogenéticos obtenidos en linfocitos cultivados in vitro: elevada radiosensibilidad cromosómica y presencia de reordenamiento cromosómico involucrando a los cromosomas 7 y 14. Estos últimos fueron diagnosticados en placas metafásicas bandeadas G con tripsina, según técnica de Chiarelli15.

La muestra de los pacientes (5 ml de sangre periférica) fue obtenida después que sus respectivos padres fueran informados y firmaran el protocolo de Consentimiento Informado aprobado por el Comité de Ética, de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile.

Cultivo de linfocitos y tratamientos

Linfocitos de sangre periférica de los pacientes y de sus controles fueron cultivados in vitro en medio de cultivo TC-Chromosome (Difco, USA). De cada uno de los pacientes A-T y de sus respectivos controles normales se establecieron cuatro cultivos. Uno de ellos fue utilizado para estimar la frecuencia de aberraciones cromosómicas basales y un segundo cultivo fue empleado para evaluar la cantidad de daño cromosómico presente en G2. Para estos efectos, este segundo cultivo fue tratado con cafeína 5 mM durante las dos últimas horas antes de ser procesado. Los otros dos cultivos restantes fueron tratados desde el inicio con vitamina E (DL-a-tocoferol) 100 µM, para evaluar el efecto de esta vitamina E en la frecuencia de daño cromosómico basal y en G2 (células tratadas con cafeína), respectivamente. La concentración de vitamina E utilizada fue seleccionada en base a resultados de estudios previos13,14.

Los cultivos fueron incubados por 72 h a 37ºC, al final de lo cual se procedió a la obtención de cromosomas metafásicos, de acuerdo a la metodología usual, descrita previamente16. Dos horas antes de completarse las 72 h se agregó colcemide (TC-Arresting solution, Difco USA) a una concentración final de 5 x 10-7M.

Las soluciones de cafeína (Merck, Alemania) y de vitamina E (solución coloidal de acetato de DL-a-tocoferilo, EphynalÒ, Roche, España) fueron diluidas en TC-199 (Difco, USA), filtradas y esterilizadas (filtro Millipore 0,2 µm). En cada experimento se utilizaron soluciones recién preparadas.

Análisis de la frecuencia de aberraciones cromosómicas y del efecto de la vitamina E

Para el recuento de aberraciones cromosómicas se utilizaron preparados cromosómicos teñidos con Giemsa (Merck, Alemania) 2%, en tampón fosfato. Se analizó un mínimo de 100 placas metafásicas por cada cultivo. Las aberraciones cromosómicas encuestadas incluyeron fracturas cromatídicas e isocromatídicas/cromosómicas, dicéntricos, translocaciones y reordenamientos cromatídicos. El criterio aplicado para diagnosticar una fractura cromatídica o isocromatídica fue que el segmento cromatídico distal estuviera separado del eje cromosómico o bien que el segmento sin teñir en una o ambas cromátidas fuera mayor que el ancho de éstas. Un cromosoma dicéntrico, más uno o dos fragmentos acéntricos fue considerado como una sola aberración. Los reordenamientos cromatídicos, independiente del número de fracturas cromatídicas involucradas en su formación, también fueron considerados como una sola aberración.

Para estimar la cantidad de lesiones cromosómicas reparadas en G2 (LRG2) se utilizó la siguiente relación:

Donde ¦ (caf) corresponde a la frecuencia de aberración en cultivos tratados con cafeína, y ¦ (b) la frecuencia de aberración cromosómica basal.

El efecto de la vitamina E en la frecuencia de daño cromosómico basal o en G2 (tratamiento con cafeína) fue denominado efecto de reversión, ER (vit b) o ER (vit G2), respectivamente. De acuerdo a estudios previos13,14, éste fue definido como el porcentaje en el cual disminuyen las aberraciones cromosómicas detectadas en ausencia de vitamina E y fue calculado de acuerdo a las siguientes ecuaciones:

Donde ¦ (b) y ¦ (caf) corresponden a la frecuencia de aberraciones cromosómicas basales y las detectadas en linfocitos tratados con cafeína (G2) respectivamente. ¦ (vit) y ¦ (caf + vit) corresponden a la frecuencia de aberraciones de linfocitos tratados sólo con vitamina E y con vitamina más cafeína respectivamente.

Análisis estadístico. La significación del incremento de aberraciones cromosómicas basales o en G2 en los linfocitos de los pacientes con A-T, con respecto a los respectivos promedios en las células controles, fue estimada mediante el test de c2. La significación del efecto de reversión por la vitamina E fue determinada mediante la prueba t de Student.

RESULTADOS

Los resultados presentados en la Tabla 1 muestran la frecuencia de daño cromosómico basal y en G2 en linfocitos A-T. En ella se observa que la frecuencia de aberraciones cromosómicas basales, en cada uno de los pacientes A-T estudiados, fue mayor que el promedio obtenido en los controles (p <0,05, prueba de c2). La frecuencia de daño cromosómico en G2, puesta de manifiesto en linfocitos tratados con cafeína (5 mM) durante G2, fue también significativamente mayor en linfocitos A-T (p <0,05, prueba de c2). La cafeína es una metilxantina que inhibe el proceso de reparación de las lesiones en el DNA durante G2. Por lo tanto, la frecuencia de aberraciones cromosómicas detectadas en los cultivos tratados con cafeína durante G2 es una medida de la cantidad de lesiones cromosómicas presentes en esta fase del ciclo celular y que pasaron sin reparar a mitosis, debido a la presencia del inhibidor.

Con respecto a la actividad reparativa, la Tabla 1 también muestra que el porcentaje de lesiones reparadas en G2 [Ec 1] para cada uno de los pacientes A-T mostró una variación que fue desde 57,7 a 77,6%, con un promedio (68%) inferior al observado en los controles (84,9%) (p <0,001, prueba t de Student).

La Tabla 2 muestra los resultados sobre el efecto de la vitamina E en la frecuencia de aberraciones cromosómicas en linfocitos A-T, con y sin tratar con cafeína. En ellos se observa que el tratamiento de los cultivos con vitamina E disminuyó significativamente la frecuencia de daño cromosómico basal y en G2 en los linfocitos A-T (p <0,05, prueba de t de Student). Esta disminución expresada como porcentaje de reversión fue 57,1% para el daño basal y 47,9% para el daño en G2 (tratamiento con cafeína). En los linfocitos normales, la frecuencia de daño cromosómico también fue disminuido por la vitamina E, sin embargo, el promedio de esta disminución (daño basal y en G2) no alcanzó valores significativos (p ≥0,05, prueba Student).

El porcentaje promedio de lesiones cromosómicas reparadas en G2 en linfocitos A-T tratados con vitamina E aumentó cerca de 5% (de 68 a 72,8%) mientras que en los linfocitos controles éste se mantuvo (de 84,9 a 84,6%).

DISCUSIÓN

En células proliferantes, las aberraciones cromosómicas detectadas en situación basal (daño basal) derivan de lesiones en el DNA presentes en G2 (daño en G2), que pasan sin reparar a mitosis. Estas lesiones forman parte del daño endógeno inducido por producto de la actividad metabólica celular o por agentes lesionantes ambientales17. Nuestros resultados muestran que en linfocitos A-T, la frecuencia de aberraciones cromosómicas basales y en G2 (tratamiento con cafeína) es significativamente mayor que el promedio de las células controles. Este hallazgo implica que la cantidad de daño endógeno que afecta a las células A-T es superior a lo normal.

Un nivel elevado de daño endógeno puede obedecer a una acumulación de lesiones en el DNA, que quedan sin reparar, debido a trastornos en el procesamiento de las lesiones y/o a un continuo incremento del daño oxidativo que sobrepasa la capacidad reparativa celular12.

Al respecto, nuestros resultados muestran que en situación basal, el porcentaje de lesiones reparadas en los linfocitos A-T fue inferior (68%) al de las células normales (84,6%). En las células A-T, la ausencia de una ATM funcional determina el bloqueo de las vías involucradas en el procesamiento del daño en el DNA dependientes de ATM6. Por lo tanto, el bajo porcentaje de reparación del daño cromosómico endógeno en los linfocitos A-T puede ser explicado, en parte, por el trastorno en el procesamiento de las lesiones debido a la falta de ATM activa en estas células. Sin embargo, la existencia de 68% de lesiones reparadas en ausencia de ATM, apoya la posibilidad que vías alternativas, independientes de ATM sean responsables de sensar y procesar las lesiones incluidas en este porcentaje de daño reparado18.

En relación a un incremento del daño oxidativo, este tipo de daño corresponde a alteraciones de bases y fracturas mono y bicatenarias del DNA inducidas por especies reactivas del oxígeno generadas durante el metabolismo celular19. En las células A-T, la ausencia de ATM activa sería responsable de un incremento de lipoperoxidación11, importante fuente productora de daño oxidativo en el DNA20.

Al respecto, nuestros resultados revelan que en los linfocitos A-T, el tratamiento con un antioxidante como vitamina E disminuye significativamente la frecuencia de daño cromosómico basal y en G2, no así en las células control. Ello constituye una de las primeras evaluaciones in vivo del efecto de la vitamina E en células A-T e indica que parte del incremento del daño cromosómico en los linfocitos A-T sería consecuencia del estrés oxidativo crónico en estas células9,11. A su vez, la existencia de un remanente de daño cromosómico basal en G2 que permanece sin reparar en los linfocitos A-T tratados con vitamina E (4,6 y 16,5% respectivamente), superior al presente en los controles sometidos al mismo tratamiento (0,8 y 5,2% respectivamente), apoyarían también la existencia de trastornos en las vías de procesamiento del daño dependiente de ATM.

Los resultados del presente trabajo también muestran que la eficiencia reparativa, responsable de la estabilidad genómica, es mejorada parcialmente en las células A-T por la vitamina E. Considerando que muchas de las características clínicas de esta patología derivan de la inestabilidad genómica generada por la falta de eliminación del daño oxidativo, debido a la inactividad de la ATM, estos resultados apoyan la utilización de vitamina E como un tratamiento paliativo de los pacientes A-T. Es así como, la capacidad antioxidante21 de la vitamina E podría contrarrestar el deterioro neurológico y el envejecimiento prematuro en estos pacientes. Más aún, la actividad inmunoestimulante de esta vitamina22 podría también atenuar la inmunodeficiencia característica de los afectados de esta patología.

Agradecimientos

Los autores agradecen la participación de los Drs. Mónica Cornejo, Juan Carlos Faúndez, Julia Oroz, Simón Ponce, María Gabriela Pumarino, en el diagnóstico y envío de las muestras de los pacientes estudiados.

El presente trabajo fue parcialmente financiado por el Proyecto 99 CL009 del Acuerdo de Cooperación Científica y Tecnológica entre CSIC (España) y Universidad de Chile y por el proyecto PB98-0072 del Ministerio de Educación y Cultura. España.

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Correspondencia a: Juana Pincheira. Programa de Genética Humana - ICBM, Facultad de Medicina - Universidad de Chile. Casilla 70061 Santiago 7, Santiago Chile. Fono: 678 6463, Fax: 737 3158, E-mail: jpincheira@machi.med.uchile.cl

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