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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.130 n.11 Santiago nov. 2002

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872002001100005 

Rev Méd Chile 2002; 130: 1232-1240

Diagrama de flujo inmunohistoquímico
para la diferenciación entre
adenocarcinomas primarios y tumores
metastásicos extraginecológicos más
frecuentes en el ovario

Yumay Pires N, Leonardo Andrade M1, Mauricio Cuello F,
Rodrigo Chuaqui F.

Immunohistochemical flow chart to
differentiate between primary
adenocarcinomas and the most frequent
extragynecological metastases in the ovary

Background: The pathological differential diagnosis between primary and metastatic ovarian malignant tumors is usually difficult, specially for tumors originating in the gastrointestinal system or breast. Aim: To define an immunohistochemical flow chart to discriminate these tumor types. Material and methods: We performed a immunostaining analysis using a panel of six antibodies (CK 7, CA 125, CEA, CK20, BRST-2 and CA 15-3) in 3 tumor groups: 11 ovarian, 14 breast and 12 colonic primary tumors and in a study group of 38 ovarian tumors whose primary origin was unknown. Results: We defined an ovarian immunohistochemical pattern (CEA-/CK20-, 45% in ovarian tumors, 0% in breast or colonic tumors, p <0.001); an ovary/breast pattern (CEA+/CK20-, 0% in colonic tumors, p <0.001): a breast pattern (CEA+/CK20-/BKST-2+, 64% in breast tumors and 0% in colonic and ovarian tumors, p <0.001) and a colonic pattern (CEA+/ CK20+/CK7-, 67% in colonic tumors and 0% in breast and ovarian tumors, p <0.001). Conclusions: Employing a simple panel of antibodies, characteristic immunohistochemical patterns were defined for ovarian, breast and colonic tumors. These patterns allowed the identification of the origin of most tumors of the study group (Rev Méd Chile 2002; 130: 1232-40).

(Key Words: Ovarin neoplasms; Immunohistochemistry; Neoplasm metastasis)

Recibido el 17 de diciembre, 2001. Aceptado en versión corregida el 29 de agosto, 2002.
Departamentos de Anatomía Patológica y de Obstetricia y Ginecología, Facultad de Medicina, Pontificia Universidad Católica de Chile.
1Tecnólogo Médico

Es clara la trascendencia de una precisa tipificación del origen tumoral para el adecuado manejo y evaluación pronóstica en pacientes con neoplasia primaria de origen incierto1. Las metástasis corresponden a 5-10% de los tumores malignos en el ovario2, siendo aproximadamente 75% de las extraginecológicas de origen gastrointestinal3 (52% del colon y el resto del estómago, páncreas, apéndice y vesícula biliar) y 17% de origen mamario4. La distinción entre tumores primarios y metastásicos poco diferenciados en el ovario, en lesiones unilaterales, sin ascitis, enfermedad pelviana u otras neoplasias ginecológicas, puede ser difícil. El estudio histológico convencional muchas veces permite la distinción entre carcinomas primarios y metastásicos extragenitales. Sin embargo, entre 5 y 15% de los tumores ováricos son indiferenciados5. La gran mayoría de los tumores primarios de origen incierto corresponde a tumores epiteliales, de ellos más de 60% son adenocarcinomas. Las técnicas inmunohistoquímicas constituyen un recurso complementario al estudio histológico convencional, de gran importancia en el diagnóstico anátomo-patológico actual, si bien son escasos los marcadores inmunohistoquímicos específicos y sensibles para precisar el origen tumoral. Sólo 6% de los adenocarcinomas de origen incierto cae en algún subgrupo inmunohistoquímico específico6,7. Entre los marcadores más útiles en su tipificación se cuentan las citoqueratinas, algunas de ellas con una distribución característica de ciertos tipos tumorales, considerando además que los tumores primarios y metastásicos tienden a retener los perfiles de expresión inmunohistoquímicos del epitelio del que se han originado8. Así, mediante la asociación de dos citoqueratinas, CK79-12 y CK2010-13, se puede discriminar entre distintos tipos tumorales: los adenocarcinomas colorrectales son negativos para CK7 y positivos para CK20, mientras que los carcinomas mamarios expresan CK7 pero no CK20. Finalmente, los carcinomas de ovario presentan un patrón de expresión diferente según el tipo histológico, así los mucinosos son positivos para ambas citoqueratinas, mientras que los endometrioides y serosos son positivos para CK7 y negativos para CK2014. Sin embargo, la sensibilidad y especificidad de estas citoqueratinas no alcanza 100%, debiendo ser complementadas con otros marcadores en algoritmos diagnósticos. Para discriminar entre adenocarcinomas primarios y metastásicos en el ovario de origen colónico y mamario, se han empleado paneles inmunohistoquímicos, que incluyen CK7, CK20, CA125, CEA, BRST-2, receptores de estrógenos, vimentina y CA19.915,16. CA 12517,18 se expresa en carcinomas ováricos predominantemente serosos (92%), en 13% de carcinomas mamarios y en 4% de carcinomas colónicos17-19. CEA20 se expresa en 100% de adenocarcinomas colorrectales y gástricos, en carcinomas de ovario, predominantemente mucinosos (97%) y en 30-90% de carcinomas ductales infiltrantes de la mama20-22. BRST-223, se expresa en 55-72% de carcinomas mamarios, 4% de carcinomas ováricos y 0% de carcinomas colónicos24,25. En ningún trabajo se ha incluido, para discriminar entre tumores primarios de ovario y metastásicos de origen mamario, un marcador originalmente introducido como específico de carcinoma de mama: CA 15-326, que se expresa en 20% de carcinomas ductales y 9% de lobulillares de la mama, en 26% de adenocarcinomas colónicos y 10% de adenocarcinomas ováricos27. Nuestro objetivo es definir un diagrama de flujo inmunohistoquímico para el diagnóstico diferencial en tumores ováricos de morfología incierta entre carcinomas primarios ováricos y metastásicos de origen colónico y mamario.

MATERIAL Y MÉTODO

El material se recolectó retrospectivamente de los archivos del Departamento de Anatomía Patológica de la Universidad Católica y consistió en tejidos fijados en formalina 10% buffer e incluidos en parafina "HISTOSEC". Estos casos se dividieron en 3 grupos controles: 12 adenocarcinomas primarios de colon, 14 primarios de mama y 11 primarios de ovario. Además se estudió un grupo problema, constituido por 38 tumores epiteliales en ovario, de origen incierto. Los criterios de inclusión en los primeros 3 grupos fueron morfológicos y se basaron en el informe anátomo-patológico, siguiendo para los carcinomas de ovario la clasificación histológica de la OMS y definiendo el grado histológico por sus características arquitecturales28. La clasificación histológica de los tumores de mama fue la adoptada por la OMS29, el grado nuclear según Bloom y la graduación histológica según Elston y Ellis30. Finalmente, los tumores de colon fueron tipificados según la clasificación histológica de la OMS y graduados de acuerdo con la extensión del componente de aspecto glandular31. Para el cuarto grupo se utilizaron criterios morfológicos y clínicos, ya que su presentación era compatible con una metástasis y no característica de un tumor primario. Sólo se incluyeron casos que correspondían a tumores epiteliales malignos y en los que histológicamente no se reconocía diferenciación mülleriana.

Se seleccionó la preparación más representativa de cada caso para estudio inmunohistoquímico. Se montaron cortes de 6 micrones de espesor en portaobjetos tratados con xilano, se secaron a 60°C y desparafinaron. Luego se trataron con perhidrol al 3% en metanol por 10 min, se lavaron en buffer APK, y se trataron con microonda por 7 min. Se utilizó un equipo de tinción automática "NEXES" (Ventana Med Syst, Tucson, AZ). Se emplearon los siguientes anticuerpos: CK7 (Dako, dilución 1:50), CK20 (Dako, dilución 1:100), CEA (BioGenex, dilución 1:150), BRST-2 (Signet, dilución 1:50), CA125 (Dako, dilución 1:100), CA15-3 (BioGenex, dilución 1:100). El sistema de tinción utiliza el complejo avidina-biotina con anticuerpo secundario polivalente, y como sustrato cromógeno la 3-3 diaminobenzidina (DAB) y tinción de contraste nuclear con hematoxilina. Todos los tumores fueron analizados inmunohistoquímicamente con los seis anticuerpos. En todos los casos, para cada marcador inmunohistoquímico estudiado, se emplearon los controles positivos correspondientes, mientras que para los controles negativos se sustituyó el anticuerpo primario por buffer para cada marcador con señal positiva.

Se evaluó la tinción por 2 patólogos, sin conocimiento del diagnóstico en cada caso, según intensidad y porcentaje de células positivas, llegándose a un consenso en todos los casos. Para la intensidad se consideró: negativo (sin señal), débil (tinción suave), intenso (señal acentuada). Para el porcentaje de células teñidas se consideró señal negativa: 0% de células positivas, +: hasta 10%, ++: hasta 50%, +++: más de 50% de las células positivas. Para la evaluación final de los resultados, éstos se agruparon en 3 categorías definitivas:

- Negativo: tinción negativa, tinción débil +;

- Positivo débil: tinción débil ++, tinción débil +++;

- Positivo intenso: tinción intensa ++, tinción intensa +++.

Para evaluar la significación de nuestros resultados se empleó la prueba de chi-cuadrado a los seis marcadores inmunohistoquímicos estudiados en los tres grupos de tumores de origen conocido (grupos control), adoptando como nivel de significación aceptable valor p <0,001.

RESULTADOS

En el grupo de tumores primarios del ovario, 4 eran endometrioides, 3 mucinosos y 4 serosos; 4 grado 1, 1 grado 2 y 6 grado 3. En el grupo de tumores mamarios, todos eran de tipo ductal infiltrante, 1 bien diferenciado, 8 moderadamente diferenciados y 5 poco diferenciados. Todos los tumores primarios de colon eran adenocarcinomas, 2 poco diferenciados, 5 moderadamente diferenciados y 5 bien diferenciados. La gran mayoría de casos del grupo de tumores de origen incierto en el ovario correspondía a carcinomas sólidos. Los resultados globales por anticuerpos individuales se muestran en las Tablas 1A-F. En la Tabla 1A se puede observar que CK7 fue positivo en todos los tumores de ovario, y en 86% de los tumores de mama, pero sólo en 33% de los carcinomas de colon, siendo sin embargo esta última cifra superior a la descrita en la literatura. En la Tabla 1B se aprecia que CA125 se expresó en tumores de ovario en menor porcentaje (73%), en relación con lo observado para CK7, aunque siempre intenso; fue positivo sólo en 25% de tumores de colon, siempre débil, mientras que en tumores de mama la positividad fue mayor que la esperada (43%) según lo expresado en trabajos recientes. En la Tabla 1C se muestra que CK20 siempre fue positivo en tumores de colon, negativo en 93% de tumores de mama y en 91% de tumores de ovario, esta última cifra concordante con lo esperado para un grupo de tumores primarios predominantemente no mucinosos. En la Tabla 1D observamos que CEA siempre fue positivo en tumores de colon y de mama, mientras que en ovario sólo en la mitad de los casos. En la Tabla 1E se muestra que CA 15-3 fue positivo en 100% de tumores de ovario, 93% de mama y 92% de colon, expresión mucho mayor que la esperada según la literatura, lo que demuestra su falta de especificidad para discriminar entre estos grupos de tumores. En la Tabla 1F podemos observar que BRST-2 siempre fue negativo en tumores de ovario. La Tabla 2 muestra el valor de chi-cuadrado de cada marcador inmunohistoquímico para la discriminación entre los tres grupos de tumores control, donde se aprecia que los anticuerpos de mayor utilidad son CK20, BRST-2, CK7 y CEA (p <0,001).

La combinación de resultados de CEA y CK20 fue la que mejor permitió agrupar los casos controles. Se reconocieron así 3 categorías (Figura 1):

a) CEA (-) y CK20 (-): donde se encontraron sólo tumores ováricos.

b) CEA (+) y CK20 (-): donde se observaron sólo tumores de ovario y mama.

c) CEA (+) y CK20 (+): donde se encontraron todos los tumores de colon y sólo 1 tumor de ovario y 1 de mama.

Dentro de la primera categoría, además todos los tumores expresaron CK7 (Figura 2). Dentro de la segunda categoría sólo los tumores de mama expresaron BRST-2 (Figura 3). La Figura 4 muestra un ejemplo de la tercera categoría.

CK7, CK20, CA125, CA 15-3 y CEA se expresaron con un patrón citoplasmático predominantemente apical y este último también luminal, mientras que BRST-2 presentó un patrón difuso o granular citoplasmático (Figuras 2, 3 y 4).

Aplicando estos patrones en el grupo de tumores en el ovario de origen incierto (Figura 5): 13 casos presentaron un patrón de tipo ovárico (negatividad para CEA y CK20), 11 de ellos con tinción para CK7, pero sin tinción para BRST-2. Otros 12 casos presentaron un patrón de tipo ovárico/mamario (positividad para CEA y negatividad para CK20), uno de ellos presentó un patrón de tipo mamario (positividad para BRST-2). Los 13 casos restantes presentaron un patrón que denominamos sugerente de colon (positividad para CEA y CK20), 11 de ellos sin tinción para CK7 (patrón de tipo colónico) y 2 con expresión para BRST-2, hallazgo que no se encontró en ninguno de los casos de tumores primarios del ovario. Los resultados mencionados para el grupo de tumores en ovario de origen incierto fueron comparados con los datos del seguimiento clínico de 24 de las 38 pacientes, de los cuales obtuvimos coincidencia entre el patrón inmunohistoquímico y los datos clínicos en 18 de 24 casos (75%) y de éstos 6 corresponden a los patrones que denominamos "de tipo ovárico" y 6 "de tipo colónico", mientras que el resto se distribuye en 4 casos para el patrón "de tipo ovárico-mamario" y los 2 restantes corresponden a los patrones "de tipo mamario" y "de tipo colon-mama", respectivamente.

Figura 2. Carcinoma endometrioide del ovario con "patrón de tinción ovárico"; A: (Hematoxilina - eosina x 200); B: CEA negativo (CEA x 200); C: CK20 negativo (CK20 x 200); D: CK7 positivo (CK7 x 200).

Figura 3. Carcinoma ductal infiltrante de la mama, moderadamente diferenciado, con "patrón de tinción mamario"; A: (Hematoxilina - eosina x 200); B: CEA positivo (CEA x 200); C: CK20 negativo (CK20 x 200); D: BRST-2 positivo (BRST-2 x 400).

Figura 4. Adenocarcinoma tubular de colon, bien diferenciado, con "patrón de tinción colónico"; A: (Hematoxilina-eosina x 100); B: CEA positivo (CEA x 200); C: CK20 positivo (CEA x 200); D: CK7 negativo (CK7 x 200).

DISCUSIÓN

Es sabido que puede ser difícil la distinción entre tumores primarios y metastásicos en el ovario, particularmente en tumores sin signos histológicos de diferenciación mülleriana. Los criterios morfológicos tradicionales no son siempre suficientes; en estos casos la aplicación de técnicas inmunohistoquímicas podría ser particularmente útil. En estudios recientes se ha sugerido que algunos marcadores pueden tener cierta especificidad respecto al epitelio glandular que los expresa, y podrían ser útiles en la distinción entre neoplasias primarias y secundarias en el ovario32. Así, CK20 y CEA se expresarían predominantemente en tumores digestivos13,20, CK7 y CA125 en tumores de ovario9,17 y BRST-2 y CA15-3 en tumores de mama23,26. Sin embargo, estudios más recientes han demostrado que estos anticuerpos no son específicos para cada órgano, existiendo en realidad una amplia gama de tumores en que cada uno se expresa33, por lo que se sugiere la combinación de varios anticuerpos16. Empleando estos marcadores en conjunto, elaboramos un diagrama de flujo para discriminar entre tumores primarios del ovario, mama y colon en la mayoría de los casos. El análisis por anticuerpos en los grupos control mostró que ningún marcador individual es suficientemente específico para realizar el diagnóstico diferencial entre tumores de colon, mama y ovario y también que CA15-3 se expresa ampliamente en estos 3 grupos de tumores, por lo que no fue un marcador útil en la discriminación entre ellos. Además, si bien CA125 no contribuyó para la discriminación entre los grupos control, pensamos que es igualmente un marcador útil, particularmente en la discriminación entre tumores de colon y ovario. Fueron finalmente cuatro anticuerpos (CEA, CK20, CK7 y BRST-2) los que nos permitieron distinguir entre tumores de colon, ovario y mama en la mayoría de los casos. El análisis estadístico de nuestros resultados para cada marcador inmunohistoquímico en los 3 grupos de tumores de origen conocido confirmó que CEA, CK20, CK7 y BRST-2 presentan valor significativo para la discriminación entre estos tumores (p <0,001). Así se definieron tres patrones de tinción: a) ovárico (CEA-/CK20-) en el que sólo se observaron tumores de origen ovárico (45%); b) patrón ovárico/mamario (CEA+/CK20-), que sólo estuvo presente en tumores de ovario y mama (45% y 93% respectivamente), y dentro del cual la positividad para BRST-2 permitió identificar los tumores de origen mamario y diferenciarlos así de los de origen ovárico, finalmente; c) patrón colónico (CEA+/CK20+) en el que se observaron todos los tumores de colon y sólo un tumor de ovario y uno de mama. Aplicando los patrones de tinción propuestos en el grupo de tumores de primario incierto en el ovario, fue posible plantear un origen en 56% de los casos. El seguimiento clínico y eventualmente el estudio necrópsico de las pacientes del grupo de casos en estudio constituyen el "gold standard" para confirmar los orígenes que se sugieren en cada caso con la aplicación del panel de marcadores empleado. De este modo, comparando los antecedentes y la evolución de un número importante de pacientes con tumores de origen incierto en el ovario con nuestros resultados observamos que existe concordancia de 85% para el patrón "de tipo ovárico"; 85% para el patrón "de tipo ovárico/mamario" y 85% para el patrón "de tipo colónico".

Debemos tener en cuenta además, que para la elaboración de los patrones de tinción propuestos en el presente trabajo se tomaron como referencia sólo tumores primarios de origen conocido de mama, ovario y colon, sin descartar por lo tanto que los tumores con patrón de "tipo ovárico" y de "tipo colónico" puedan corresponder a otro origen ginecológico o digestivo, respectivamente, lo cual podría explicar algunas de las discordancias entre el órgano de origen propuesto según el patrón de tinción y los hallazgos aportados por el seguimiento clínico de las pacientes. Esperamos que en el futuro podamos disponer de nuevos marcadores y entre ellos quizás el empleo de técnicas moleculares que contribuyan a discriminar entre tumores primarios y de origen incierto en el ovario.

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Correspondencia a: Dra. Yumay Pires N. Departamento de Anatomía Patológica, Escuela de Medicina, Pontificia Universidad Católica de Chile. Marcoleta 367, Fono/Fax: 6395101. Santiago, Chile. E-mail: ypires@med.puc.cl

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