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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.130 n.11 Santiago nov. 2002

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872002001100016 

Rev Méd Chile 2002; 130: 1307-1315

ARTÍCULOS DE REVISIÓN

Uso de tríos caso-padres
en estudios epidemiológicos
de asociación entre polimorfismos
genéticos y enfermedades complejas

José Luis Santos1, Francisco Pérez2, Elena Carrasco3,
Cecilia Albala

Use of case-parenteral controls for
epidemiological studies of association
between genetic polymorphisms and
complex diseases

In case-control studies, spurious associations between allelic variants in candidate genes and disease may arise as a result of population stratification by ethnicity. In epidemiological terms, the ethnic group would act as a confounding factor if both the genotype frequency and the incidence/prevalence of a given chronic disease vary across ethnic groups. Population stratification is a key element in the study of population dynamics and the knowledge of the disparity in health-related conditions among strata has important social and public health implications. However, it would not be scientifically correct to conclude a causal gene-disease association in situations in which the association arises as a consequence of a particular population structure. Although the relevance and magnitude of the bias derived from this confounding, effect would be different depending on the population considered, there has been an increased use of study designs such as the case-parent study, that avoids the effect of population stratification by ethnicity. In this article, we review the analysis of case-parent trios using unrelated affected cases as an epidemiological study design for testing association between genetic polymorphisms and disease (Rev Méd Chile 2002; 130: 1307-15).

(Key Words: Genetics, medical; Genetics, population; Genotype; Polymorphinsm (Genetics))

Recibido el 30 de noviembre, 2001. Aceptado en versión corregida el 19 de septiembre, 2002.
Trabajo realizado con la ayuda de investigación Fondecyt 1000944.

Programa de Epidemiología Genética. Instituto de Nutrición y Tecnología de los Alimentos (INTA) de la Universidad de Chile. Unidad de Diabetes, Hospital San Juan de Dios, Facultad de Medicina, Campus Occidente. Universidad de Chile.
1Doctor en Biología. Magíster en Bioestadística y Master en Epidemiología Genética
2Doctor en Biología (Bioquímica y Biología Molecular)
3Nutricionista. Magíster en Nutrición

Uno de los problemas más comunes en epidemiología genética consiste en estimar el grado de asociación entre alelos de un gen candidato y la ocurrencia de una enfermedad en una población definida1. Los polimorfismos genéticos son especialmente apropiados para la investigación epidemiológica de enfermedades complejas a través de estudios de caso-control, dado que constituyen índices estables de susceptibilidad, al contrario que otros factores de riesgo de tipo nutricional u ocupacional2. En este tipo de estudios, las asociaciones genotipo-enfermedad son debidas básicamente a alguna de las siguientes circunstancias: a) el alelo sujeto a estudio forma parte de alguna de las causas suficientes de la enfermedad, b) el alelo se encuentra en desequilibrio de ligamiento con un alelo del verdadero gen de susceptibilidad, o c) la asociación genotipo-enfermedad podría surgir como un artefacto debido a la estratificación genética por etnia en la población. La primera circunstancia señalada se refiere a una asociación de tipo causal. En la situación siguiente, el alelo estudiado actuaría como un marcador, que indicaría proximidad al gen de susceptibilidad a través del desequilibrio de ligamiento. La última situación planteada correspondería a un tipo de asociación originada por la coexistencia de diferentes subpoblaciones que tienen distinta frecuencia génica y diferente incidencia/prevalencia de la enfermedad3.

El objetivo de este trabajo es describir el diseño y análisis de los estudios de tríos de caso-padres (TCP) como un tipo de estudio intrafamiliar adecuado para evaluar asociaciones genotipo-enfermedad que, en un estudio de caso-control, podrían depender de la estratificación genética de la población4-6.

ESTUDIOS DE CASO-CONTROL Y ESTRATIFICACIÓN
GENÉTICA EN LA POBLACIÓN

En los estudios de casos y controles aplicados a epidemiología genética, con frecuencia llamados simplemente "estudios de asociación", se toma una muestra representativa de sujetos enfermos (idealmente casos incidentes) y de controles en los que se calcula la frecuencia de los posibles alelos y genotipos de susceptibilidad. La Figura 1 muestra un esquema del proceso por el cual asociaciones genotipo-enfermedad debidas a estratificación poblacional pueden surgir en un estudio de caso-control. El dibujo muestra una población heterogénea con dos subpoblaciones 1 y 2 en la que se pretende estudiar un gen con cuatro alelos A, B, C y D, donde el alelo D representaría un posible alelo de susceptibilidad o un alelo en desequilibrio de ligamiento con una variante genética hipotética de susceptibilidad. Es posible comprobar en la Figura 1 que la frecuencia de la enfermedad (sujetos marcados en negro) y la frecuencia del alelo D son bajas en la subpoblación 1 mientras que esas mismas frecuencias son altas en la subpoblación 2. Sin embargo, no existe asociación entre el alelo D y la enfermedad dentro de la subpoblación 1 ni dentro de la subpoblación 2. Si se condujera un estudio de caso-control sin un adecuado pareamiento de los sujetos, es muy posible que la gran mayoría de los casos provengan de la subpoblación 2, donde la enfermedad es muy frecuente, y una proporción considerable de los controles provengan de la subpoblación 1. En este escenario, una mayor frecuencia del alelo D en casos con respecto a los controles no sería debida a un efecto causal originado por la presencia de este alelo, sino que reflejaría únicamente las diferencias en la composición genética entre la subpoblación 1 y la subpoblación 2. En muchas ocasiones, estas subpoblaciones o estratos suelen corresponder con grupos étnicos en los que existen diferencias tanto en frecuencias de alelos de marcadores genéticos como en la prevalencia/incidencia de ciertas enfermedades.

La subestructuración es un proceso fundamental en la evolución dinámica de las poblaciones, y la identificación de disparidades en la frecuencia de enfermedades y sus factores de riesgo en estas subestructuras o estratos poblacionales es importante tanto desde el punto de vista social como desde la salud pública7. Es importante resaltar que los diferentes grupos étnicos no sólo pueden diferir entre sí respecto a las frecuencias génicas de ciertos en marcadores sino que, adicionalmente, la estratificación étnica puede llevar asociada una estratificación social, cultural, económica e incluso geográfica que podría explicar gran parte de las diferencias en los estados de salud en los distintos estratos que componen la población8. Sin embargo, no sería científicamente correcto en estudios de epidemiología genética concluir una asociación causal genotipo-enfermedad en situaciones donde en realidad se trata de una asociación de tipo subestructural originada por la estratificación étnica de la población, tal y como se ejemplifica en la Figura 1. En términos epidemiológicos y centrándonos nuevamente en la Figura 1, se dice entonces que la etnia es una variable confundente o un factor de confusión en la evaluación de la asociación genotipo-enfermedad, dado que se encontraría asociada simultáneamente con el factor de riesgo (polimorfismo genético) y con la frecuencia de la enfermedad. En caso de detectar estratificación poblacional por etnia, lo más apropiado sería llevar a cabo un estudio de caso-control homogeneizado o pareado por ese factor en el que existiera una cuidadosa selección de los participantes del estudio. Sin embargo, la pertenencia a un grupo étnico y el grado de mezcla genética es difícil de medir9. Por ello, sería deseable disponer de un diseño de estudio que permitiera evaluar asociaciones entre genotipos y enfermedades, sin que esta asociación sea afectada por la posible estratificación étnica en la población. En este sentido, los estudios de asociación de base familiar, entre los que se encuentra el diseño TCP, cumplen esa función10.

Figura 1. Estratificación poblacional y su efecto en estudios de caso control.
* Figura modificada con permiso del autor (Dr. David Curtis). Ver texto para la explicación de la figura.

ESTUDIOS DE TRÍOS CASO-PADRES (TCP):
CREACIÓN DE PSEUDOCONTROLES

Con el fin de evitar la aparición de asociaciones no causales debidas a la estratificación genética por etnia, se ha extendido el uso de diseños de estudio insensibles a este efecto de confusión, como el diseño de tríos de casos y padres (TCP)11. En este tipo de estudio, se seleccionan familias a través del caso índice, y a partir de ese caso se obtiene la información de los padres. La Figura 2 representa un ejemplo de una familia participante en un estudio TCP. En esta familia ejemplo, el caso tiene genotipo NS, el padre tiene genotipo NN, mientras que la madre tiene un genotipo NS. En adelante, definiremos N como el alelo normal o neutro y S como el posible alelo de susceptibilidad. En este artículo, nos centraremos en situaciones en las que un único caso es averiguado o seleccionado por cada familia y por tanto, los casos no tienen relación familiar entre sí. En este escenario sería posible evaluar la asociación entre polimorfismos en genes candidatos y la enfermedad en estudio, así como estimar la magnitud del riesgo relativo asociado a ciertos alelos.

El uso de la información proveniente de los padres en estudios de asociación de base familiar, fue inicialmente propuesto por Rubinstein12 y posteriormente desarrollado por Falk y Rubinstein por una parte, y Terwellinger y Ott por otra parte13,14. Los tríos compuestos por casos y padres pueden analizarse en el contexto de un estudio de caso-control pareado por origen étnico. En el tipo de pareamiento más sencillo, un pseudocontrol se construye con los alelos que los padres no transmitieron a su hijo enfermo (en la familia ejemplo, el caso tiene un genotipo N/S, y el pseudocontrol sería N/N). Hay que señalar que el pseudocontrol no es un individuo concreto, sino que se trata de un genotipo construido con los alelos que los padres no transmiten a sus hijos. Aunque se trata de un diseño de tipo pareado, Falk y Rubinstein13 propusieron originalmente un análisis no pareado de los datos (Tabla 1). La significación en esta Tabla se calcula a través de la habitual estadística chi-cuadrado con un grado de libertad. Schaid y Sommer15 hacen una revisión completa de las pruebas estadísticas usadas en estudios de casos y padres en diferentes acercamientos complementarios al originalmente descrito por Falk y Rubinstein13.

Khoury16 propuso un método alternativo. Cada sujeto (casos o pseudocontroles) puede cargar con 0, 1 ó 2 copias del alelo de susceptibilidad (Tabla 2). Al parear cada caso con un control, formado por los alelos no transmitidos por los padres, podemos construir esta tabla de 3x3, donde la celda que contiene "a" representa el número de pares caso-pseudocontrol en los que ni el caso ni el control poseen copias del alelo S. Por el contrario, la celda con una "b" representa al número de pares caso-pseudocontrol donde el pseudocontrol no posee copias del alelo S y el caso posee una copia de dicho alelo. Schaid y Sommer15 propusieron la siguiente estadística para evaluar asociación en esta tabla: (s - t)2 / (s + t), que sigue una distribución chi-cuadrado con un grado de libertad, y donde s = b +c, y t = d +g + h.

Figura 2. Ejemplo de trío caso-padres.

 

TEST DE DESEQUILIBRIO DE TRANSMISIÓN (TDT)

Un acercamiento diferente fue propuesto por Spielman y cols17 a través de la prueba conocida como Test de Desequilibrio de Transmisión (TDT, "Transmission disequilibrium test") en el que se evalúa la transmisión de alelos desde los padres heterocigotos hacia los hijos enfermos18. Tomemos nuevamente el ejemplo de la familia de la Figura 1. Al seleccionar familias a través del caso índice, la asociación entre el factor genético y enfermedad origina que, en estas familias, la transmisión de alelos desde padres heterocigotos hacia sus hijos enfermos se aparten del valor esperado (probabilidad de transmisión=50%). En nuestra familia ejemplo, la madre puede transmitir N o S. Si el gen no está asociado con la enfermedad, N y S tienen la misma probabilidad de transmisión. Por el contrario, si el alelo S está asociado con un mayor riesgo de enfermar, entonces S será encontrado más frecuentemente que N en los hijos enfermos y con una probabilidad de transmisión aparente superior a 50%. El padre sólo puede transmitir el alelo N, de modo que no es informativo en este tipo de análisis (los padres homocigotos no entregan información en el análisis de TDT). En un conjunto de tríos caso-padres, la estadística TDT se calcula de la siguiente forma TDT = (b - c)2 / (b + c) (Tabla 3)19. Existen también versiones de la estadística TDT para evaluar genes con más de dos alelos20. En las situaciones donde existe un reducido número de padres heterocigotos, es recomendable el uso de métodos estadísticos exactos21. El acercamiento originalmente planteado para la Tabla 1 se refería a un análisis que no tenía en cuenta el diseño pareado del estudio de casos y padres, por lo que el método de análisis más ampliamente utilizado en este tipo de estudios es el TDT.

CÁLCULO DEL RIESGO RELATIVO GENOTÍPICO

Una vez aceptada la existencia de asociación entre un polimorfismo genético y una enfermedad, el siguiente paso sería estimar cuál es la magnitud de dicha asociación. Una de las características más interesantes del análisis TDT es que las desviaciones en la transmisión del alelo (o alelos) de susceptibilidad con respecto al valor esperado bajo la hipótesis nula (50%) dependen del cociente de las penetrancias (probabilidad de contraer la enfermedad específica para cada genotipo) por lo que es posible estimar el riesgo relativo genotípico (genotype relative risk, GRR) en estudios TCP. En este contexto, diferentes autores22-24 han hecho una detallada descripción de los métodos estadísticos apropiados para la obtención de estimadores de máxima verosimilitud para los GRR a partir de la probabilidad de transmisión de los alelos de susceptibilidad. Es posible estimar dos parámetros: por un lado GRR1 que estima el riesgo relativo de genotipos heterocigotos (NS) respecto a genotipos homocigotos para el alelo normal (NN). Por otro lado, GRR2 estima el riesgo relativo de genotipos homocigotos para el alelo de susceptibilidad (SS) respecto a los genotipos homocigotos para el alelo normal (NN). En un modelo más sencillo, sería posible estimar un sólo parámetro llamado frecuentemente riesgo relativo alélico si suponemos que existe una relación multiplicativa entre el número de alelos de susceptibilidad y el riesgo de contraer la enfermedad (es decir, GRR2 = GRR12).

REGRESIÓN LOGÍSTICA PARA EL CÁLCULO DEL RIESGO
RELATIVO GENOTÍPICO

Schaid11,25 plantea el uso de técnicas de regresión logística condicional en estudios de tríos de casos y padres. Con este fin, se considera un pareamiento 1:3 con la creación de 3 pseudohermanos controles pareados por cada caso. Estos pseudohermanos controles se construyen con las combinaciones de los alelos de los padres: una de estas combinaciones es el caso, y las otras tres son los pseudohermanos controles. Por ejemplo, en la familia de la Figura 1, el caso tiene genotipo NS, y los padres tienen genotipos NS y NN, entonces las cuatro combinaciones posibles creadas con los alelos de los padres son NN, NN, NS y NS. Una de estas configuraciones es el caso (NS) y las otras tres combinaciones representan a los pseudohermanos controles (NN, NN y NS).

El análisis de regresión logística condicional en casos y pseudohermanos controles permite estimar los riesgos relativos genotípicos (GRR´s) y sus intervalos de confianza. En primer lugar, consideraremos el caso más simple en el que se asume que el número de alelos de susceptibilidad tiene un efecto multiplicativo sobre el riesgo relativo genotípico (GRR2 = GRR12). En esta situación, es necesario estimar un solo parámetro. La ecuación del modelo logístico se ajusta mediante el uso de una variable independiente llamada "AleloS", que toma el valor "0" si el alelo S no está presente, "1" si existe una copia del alelo S, y "2" si el sujeto (caso o pseudohermano control) tiene dos copias del alelo S. En esta situación, el antilogaritmo del coeficiente de la variable "AleloS" estimaría el riesgo relativo alélico (GRR1), mientras que GRR2 = GRR12.

La variable independiente puede hacerse dicotómica y definir así otros dos modelos: el modelo dominante y el modelo recesivo. En el modelo dominante, la variable independiente toma el valor 1 si el caso o pseudohermano control tiene 1 ó 2 copias del alelo S, y toma el valor 0 si no existe ninguna copia del alelo de susceptibilidad. En el modelo recesivo, la variable independiente toma el valor 1 si existen las dos copias del alelo S en el genotipo, y 0 si es heterocigoto u homocigoto para la ausencia del alelo de susceptibilidad. Otro modelo que se puede construir es el basado en genotipos. Si existen dos alelos en un gen candidato (S: alelo de susceptibilidad) y N (alelo normal), es posible encontrar tres genotipos (NN, NS y SS). Se pueden construir tres variables binarias (GenNN GenNS y GenSS) que indiquen la presencia o ausencia de estos genotipos. Si el genotipo NN es considerado como el genotipo de referencia, construiríamos un modelo con las variables GenNS y GenSS. El antilogaritmo del coeficiente de la variable "GenNS" estimaría GRR1 mientras que el antilogaritmo de la variable "GenSS" estimaría GRR2. La Tabla 4 presenta un esquema de los diferentes tipos de codificación presentados. En genes con más de dos alelos es posible definir un número de variables igual al número de alelos y que cada una de estas variables indiquen el número de copias de cada alelo presentes en un genotipo particular. La inclusión de estas variables en un modelo de regresión logística condicional (dejando fuera la variable correspondiente al alelo de referencia) nos permitiría estimar el riesgo relativo asociado a cada uno de los alelos en relación con el alelo de referencia, asumiendo un modelo multiplicativo en el riesgo relativo genotípico. En teoría, también sería posible definir variables indicadoras para cada genotipo, pero generalmente el número de genotipos es demasiado grande y las estimaciones resultan muy inestables.

Es importante señalar que, aunque el análisis estadístico utilizado (regresión logística condicional) es el mismo que el usado en estudios de casos y controles pareados, el parámetro estimado en estudios TCP no es el odds ratio, sino el riesgo relativo genotípico26. Este hecho ha provocado cierta confusión y discusión en la literatura epidemiológica26-28. Algunos autores han señalado que el pareamiento 1:3 de casos y pseudohermanos controles no pueden considerarse como parte del diseño del estudio y por tanto, este pareamiento y su uso en regresión logística condicional sería únicamente una forma de análisis de los datos que representa un "truco computacional"26 que permite la estimación de riesgos relativos idénticos a los estimados según el método de máxima verosimilitud mencionado anteriormente22-24.

COMENTARIOS

Un estudio frecuentemente citado para ejemplificar el efecto de confusión de la estratificación genética por etnia es la asociación entre los haplotipos Gm y la diabetes tipo 2 en sujetos con un variable grado de mezcla étnica amerindia y europea29. Inicialmente, se publicó una fuerte asociación entre haplotipos Gm y diabetes. Sin embargo, después de estratificar según un índice de clasificación étnica basado en el número de ancestros, la asociación entre ambos factores dejó de ser significativa. En Chile, poblaciones de origen amerindio se amalgamaron con poblaciones migrantes europeas, especialmente provenientes de España30. En el área metropolitana de Santiago, Valenzuela y cols31 utilizaron la frecuencia de grupos sanguíneos para estimar que existía un grado de mezcla de 30-40% de genes amerindios que se mezclaron con genes procedentes de poblaciones europeas en la población de los estratos socioeconómicos medio-bajo y bajo, con un porcentaje de genes amerindios menor en los estratos socioeconómicos altos. Debido a esta estratificación étnica y a la existencia de diferencias en la frecuencia de ciertas enfermedades según el grupo étnico, la población chilena constituye un escenario adecuado para el uso de diseños de estudio de casos y padres en la evaluación de la asociación entre factores genéticos y enfermedades4.

Algunos autores han llegado a proponer que cualquier asociación significativa encontrada en estudios de casos y controles debería ser considerada como transitoria en espera de su confirmación en estudios de TCP10. Sin embargo, otros autores defienden el uso de estudios de casos y controles y han sugerido que el sesgo producido por la estratificación genética por etnia en poblaciones multiétnicas es pequeño y admisible para la gran mayoría de las situaciones32. En este mismo sentido, se ha propuesto el empleo de un adecuado pareamiento caso-control en el diseño de estudios epidemiológicos de base poblacional, y el uso de marcadores genéticos no ligados a la enfermedad considerada con el objeto de estimar el grado de estratificación genética e inferir detalles relativos a la estructura de la población33.

El cálculo de tamaño de muestra es factible en estudios TCP mediante el uso de fórmulas relativamente simples, si consideramos una relación multiplicativa entre los alelos de susceptibilidad y el riesgo relativo19. Recientemente ha sido descrito un software que realiza cálculos de tamaño muestral en estudios de asociación e interacción en el contexto del diseño de casos y padres y en otros diseños de estudio34. También se ha descrito el cálculo del tamaño de muestra necesario para estudios TCP a partir de información obtenida en estudios de caso-control35. Gran parte de las aproximaciones de análisis estadísticos presentadas en este artículo son realizables usando el programa STATA, que incluye la regresión logística condicional para la estimación del riesgo relativo genotípico (comando "clogit") y TDT para genes con dos o más alelos en tests exactos y en test basados en el uso de la distribución chi-cuadrado (comando "symmetry")36. Usando el modelo multiplicativo en la regresión logística condicional, los p-values y los coeficientes del modelo logístico entregados por STATA son idénticos a los entregados por el programa ETDT (opción "allele-wise")23,24. La entrada de datos en ETDT usa un formato habitual para programas de ligamiento tales como LINKAGE37. Es posible calcular los riesgos relativos genotípicos a partir de ejemplos publicados en la literatura24 y comprobar que las estimaciones de STATA son idénticas a las calculadas mediante la herramienta "Solver" de Microsoft Excel al maximizar la correspondiente función de verosimilitud (los archivos en formato Excel, LINKAGE y STATA están disponibles para su uso desde los autores). Otro paquete estadístico llamado MCETDT calcula p-values empíricos basados en simulaciones que son útiles en situaciones en las que es cuestionable el uso de la distribución chi-cuadrado para la prueba de cociente de verosimilitudes38. Otros métodos no iterativos y de fácil cálculo han sido desarrollados para estimar riesgos relativos genotípicos en estudios de casos y padres39,40.

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Agradecimientos

Este trabajo ha sido realizado con la ayuda de investigación FONDECYT 1000944. Los autores agradecen los interesantes comentarios del revisor anónimo que evaluó la versión preliminar de este trabajo.

Correspondencia a: José Luis Santos. Instituto de Nutrición y Tecnología de los Alimentos (INTA). Universidad de Chile. Programa de Epidemiología Genética. Macul 5540. Santiago. Chile. Teléfono: 56-2-6781454. Fax: 56-2-2214030. E-mail: jsantos@uec.inta.uchile.cl

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