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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.131 n.2 Santiago feb. 2003

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872003000200003 

Rev Méd Chile 2003; 131: 145-154

 

Epidemiología molecular
de un brote de infecciones por
Streptococcus pyogenes en una
unidad de quemados

Alberto Fica C, Jorge Fernández O1, Germán Ebensperger D2,
Erna Cona T, Andrea Galanti D, Catalina Alonso M,
María Teresa Ulloa F
3, Ana María Frola M4,
Soledad Prat M3.

Molecular epidemiology of a
Streptococcus pyogenes related
nosocomial outbreak
in a burn unit

 

 

 

 

 

 

 

 

Background: Group A Streptococcal (GAS) infections have increased in frequency and severity worldwide. During April 1996, a nosocomial outbreak associated to GAS infections affected seven patients admitted to a pediatric burn unit. The causative organism was likely disseminated from the source patient to another child in the emergency room before he was transferred to the burn unit. Patients developed burn infections or invasive disease. One of them died due to a toxic shock syndrome and 3 other lost their skin grafts. Perineal and nasal microbiological surveillance of 42 related health care workers identified only one of them as carrier of S pyogenes. Aim: To report a molecular analysis of an apparently clonal outbreak. Material and methods: The available isolates were analyzed by molecular methods including random amplified polymorphic DNA analysis (RAPD) with 4 different primers, Sma-I pulsed field gel electrophoresis (PFGE) analysis, and speA, speB and speC detection by polymerase chain reaction (PCR). Results: Two phylogenetically distant and sequentially isolated bacterial groups were identified either by RAPD analysis with selected primers or by Smal-PFGE analysis. The first group involved isolates identified in two patients that included the lethal case. The second bacterial group comprised 5 clinical isolates and the perineal and nasal isolates obtained from a health care worker. Only strains belonging to the first group harbored the speA gene and were associated with invasive disease. The second group could be split further in two subgroups according to their speB profile. Conclusions: RAPD analysis with selected primers can reproduce the PFGE-discriminating ability on the epidemiological analysis of GAS infections (Rev Méd Chile 2003; 131: 145-54).

(Key Words: Disease outbreaks; Molecular probe technics; Molecular sequence data; Streptococcus pyogenes)

Recibido el 31 de julio, 2002. Aceptado en versión corregida el 12 de diciembre, 2002.
Sección de Infectología, Hospital Clínico Universidad de Chile, Subdepartamento de Microbiología
y Unidad de Desarrollo, Instituto de Salud Pública de Chile, Laboratorio de
Microbiología y Comité de Infecciones Intrahospitalarias, Hospital San Borja Arriarán y
Programa de Microbiología, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile.
1Bioquímico PhD. 2Licenciado en Bioquímica. 3Tecnólogo Médico. 4Enfermera Universitaria

Las infecciones por Streptococcus pyogenes han experimentado un aumento en la frecuencia y severidad en los últimos años1-4. Las infecciones invasoras por este agente se presentan como casos esporádicos5,6, brotes hospitalarios7-10, brotes comunitarios en grupos familiares o en instituciones de reposo7,9,11-14. Los brotes nosocomiales se han comunicado en salas de medicina, cirugía15 o ginecología16,17 y también en unidades intensivas18 o de quemados19. Estas infecciones incluyen celulitis, bacteremia, síndrome de shock tóxico, fasceitis necrotizante, infección del sitio quirúrgico y pérdida de injertos en pacientes quemados. Las infecciones por S pyogenes se han relacionado al personal de salud colonizado por este agente y asociado a la diseminación de un grupo bacteriano específico o a varios clones durante el mismo brote8,20-22. Los reportes de infecciones nosocomiales por esta especie han sido concomitantes a la reemergencia de infecciones comunitarias ligadas a este agente. Este fenómeno global se ha asociado a la emergencia de diferentes clones bacterianos que expresan predominantemente en su superficie las proteínas antifagocíticas M1 o M3 y que tienen la capacidad además de expresar el superantígeno SpeA23. Estos y otros factores patogénicos podrían explicar formas agresivas de enfermedad tales como la existencia de lesiones necróticas, bacteremia o el síndrome de shock tóxico. Los pacientes afectados por estos cuadros han sido observados en diferentes latitudes en ambos hemisferios pero la descripción molecular de los aislamientos involucrados se ha desarrollado fundamentalmente en países desarrollados9,17,24,25. En Chile también se ha observado una asociación significativa entre aislamientos portadores del gen speA con cuadros invasores severos26. Estudios moleculares mediante la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) también han logrado demostrar la relación clonal entre aislamientos obtenidos de contactos familiares y aquellos obtenidos en un paciente con shock tóxico estreptocócico5.

Las infecciones nosocomiales asociadas a S pyogenes han sido descritas ocasionalmente en nuestro país27, aunque sin estudios moleculares de respaldo. En este trabajo se reporta uno de estos brotes, observado en una unidad de quemados donde los estudios epidemiológicos fueron complementados con diferentes técnicas moleculares para analizar un brote aparentemente clonal.

Material y método

Descripción del brote. Siete niños fueron afectados por infecciones por S pyogenes durante el mes de abril de 1996 en el mismo recinto hospitalario. El paciente fuente sufrió una quemadura facial y fue ingresado a la unidad de emergencia. Posteriormente, desarrolló un cuadro de shock tóxico con un desenlace fatal. Otros 6 pacientes presentaron infecciones por este agente en la unidad de quemados, aunque solo uno de ellos estuvo en la misma sala de hospitalización en la unidad de emergencia en forma contemporánea (Tabla 1). La edad promedio de los afectados fue 6 años (rango 1-12 años, mediana: 2 años 3 meses) (Tabla 1). La mayor parte de los casos presentó infecciones superficiales y 3 de ellos perdieron los injertos cutáneos. Las formas severas de enfermedad fueron observadas en un paciente que falleció y en otro niño que presentó sepsis con hemocultivos positivos (Tabla 1). Las quemaduras afectaron entre 6% y 35% de la superficie corporal y una de las infecciones fue observada en un paciente reingresado para resección de una cicatriz previa con cirugía plástica reparadora. Tres de los casos se presentaron el mismo día, dos días después del aislamiento inicial en los hemocultivos obtenidos del primer paciente (Tabla 1). Otros tres casos fueron identificados entre el 19 y 25 de abril. Con excepción del paciente que falleció, los demás pacientes estuvieron hospitalizados en la misma sala de la unidad. Los cultivos que revelaron S pyogenes fueron obtenidos desde quemaduras (n=4), muestras de tejido (n=2), sangre (n=1) o simultáneamente de sangre y tejidos (n=1). Los cultivos señalaron la presencia de otras bacterias en 5 casos, aunque sin especies predominantes. Para propósitos comparativos se consideró como infección severa aquella asociada a shock o a un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica.

Vigilancia microbiológica del personal de salud. Se efectuó cultivo perineal y nasal de 42 funcionarios del mismo hospital que tuvieron contacto con los pacientes de esta unidad. Las muestras fueron obtenidas con tórula humedecida e inoculadas en placas de agar sangre. La identificación de la especie se efectuó de acuerdo a procedimientos de rutina28. En solo un funcionario se detectó S pyogenes (nasal y perineal simultáneamente).

Amplificación con partidores arbitrarios mediante RCP. Los aislamientos bacterianos disponibles en ambos brotes fueron analizados mediante tipificación con partidores arbitrarios por RCP, tal como ha sido descrito previamente5. Se utilizaron 4 partidores arbitrarios para las reacciones de amplificación: ERIC-2, Pn-1, 1247 y M13. El partidor ERIC-2 (5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3') corresponde a una región repetitiva inicialmente descrita como parte del genoma de enterobacterias29. Los partidores Pn-1 (5'-ACGTATCTGC) (Jeans ER et al, 95th General Meeting, ASM, Washington DC, USA, Mayo 1995) y 1247 (5'-AAGAGCCCGT), han sido descritos y utilizados previamente para el estudio molecular de infecciones por este agente30. Se incluyó también un partidor obtenido del bacteriófago M13 (partidor forward 5'-GTTTTCCCAGTCACGAC). La amplificación se realizó en una mezcla de RCP que contenía 100 mM Tris-HCl pH 8,3, 500 mM KCl, 200 µM de cada uno de los nucleótidos dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 25 mM MgCl2, 2 µM de partidor y 1U de Taq polimerasa (Gibco BRL). La amplificación consistió inicialmente en 2 ciclos de denaturación a 95ºC, hibridación a 36ºC y extensión a 72ºC por 5 min en cada etapa. Posteriormente, se realizaron 35 ciclos con un minuto en cada etapa de incubación (94ºC), hibridación (36ºC) y extensión (72ºC) con una extensión final de 10 min a 72ºC. Los productos fueron analizados por electroforesis en geles de agarosa, teñidos con bromuro de etidio, visualizados por transiluminador y fotografiados.

Detección de los genes speA, speB, speC mediante RCP. La detección de estos genes que codifican las toxinas respectivas fue efectuada de acuerdo a protocolos previamente publicados y sin modificaciones26,31.

Análisis mediante electroforesis de campos pulsados (ECP). Los aislamientos clínicos y aquellos identificados en un funcionario portador de S pyogenes, fueron analizados mediante esta técnica utilizando la enzima SmaI. El protocolo utilizado incluyó etapas de purificación del DNA, digestión enzimática y ECP. La purificación se realizó utilizando 5 ml de caldo tripticasa soya inoculado a 37ºC durante la noche. Las bacterias fueron centrifugadas (3500 rpm, 15 min), el sedimento puesto en hielo y resuspendido en 1,9 a 1,5 ml de solución PIV en hielo (PIV: Tris HCl 10 mM, pH 7,6, NaCl 1M). Los moldes fueron preparados con agarosa de bajo punto de fusión al 1,6% en agua destilada y fundidos a 65°C. Una alícuota de 150 µl de bacterias suspendidas en PIV fue mezclada con igual cantidad de agarosa fundida y vertida en los moldes respectivos y luego puestos a 4°C por 30 min. Posteriormente, las muestras fueron expuestas a 10 ml de solución de lisis EC (NaCl 1M, EDTA 100 mM pH 7,5, Brij-58 0,5% (Sigma), deoxicolato 0,2% (Sigma), Tris HCl 6 mM pH 7,6) e incubadas por 4 h a 37°C con agitación leve (50-70 rpm). La solución EC fue retirada y reemplazada por 10 ml de solución ESP (EDTA 0,5 M pH 9-9,5, Sarcosil 1%, Proteinasa K 50 µg/ml) e incubada toda la noche a 50°C con agitación leve. Luego, la solución ESP fue retirada y reemplazada con solución TE (Tris-EDTA) 3X a 55°C incubando con agitación leve por 30 min. Esta etapa fue repetida 5 veces. Las muestras en sus moldes fueron almacenadas en solución TE 3X a 4°C.

La digestión enzimática se efectuó utilizando 1/3 del molde de muestra, el que fue lavado 5 veces con 1 ml de agua destilada (15 min cada vez). El agua destilada fue reemplazada con 100 µl de solución de restricción N°4 (Gibco BRL) al 1X, incubando las muestras por 30 min a 30°C. Luego se agregaron 50 µl de la misma solución de restricción conteniendo 5 U de la enzima SmaI (Gibco BRL). La digestión se realizó durante toda la noche a 30°C. La solución de restricción fue retirada y se agregó a la muestra 50 µl de colorante de carga para electroforesis 1X. Posteriormente, el molde de agarosa se fundió a 65°C. La electroforesis de campos pulsados fue desarrollada en un equipo CHEF DR III (BioRad) en agarosa al 1% (calidad PFGE) y con solución TBE (tris-bórico-EDTA) 0,5X. Cada pocillo fue cargado con 30 µl del molde muestra fundido. Las condiciones de electroforesis fueron: pulsos iniciales de 8 s; pulsos finales de 30 s; voltaje 6 V/cm, ángulo 120º, duración 21 h a 10ºC.

Análisis filogenético. Los perfiles moleculares obtenidos por amplificación con partidores arbitrarios y ECP fueron comparados mediante el coeficiente de Dice17 o mediante porcentajes de diferencias. El agrupamiento fue realizado utilizando el algoritmo UPGMA ("unweighed pair group matching analysis")32, contenido en los programas Statistica (Statsoft, Inc, version 4.5, 1993) o Molecular Analyst (Bio Rad, versión 1.12).

Cepas controles. Las cepas de S pyogenes 93 y 691 identificadas el año 2000, fueron usadas como controles para la ECP (en ausencia de cepas del año 1996). Para la detección de los genes speA, speB y speC se utilizaron como controles positivos las cepas 1084 y 438 de S pyogenes.

Análisis estadístico. Las comparaciones señaladas en el texto fueron desarrolladas mediante la prueba bilateral de Fisher con un nivel de significación de 5%.

Resultados

Amplificación con partidores arbitrarios. Sólo los partidores ERIC-2 y M13 demostraron ser de utilidad epidemiológica. Los partidores Pn-1 y 1247 se descartaron debido a que los perfiles de bandas fueron indistinguibles entre las cepas controles o entre las muestras clínicas (datos no mostrados). Los amplicones obtenidos con el partidor M13 permitieron identificar 7 bandas totales y lograron separar las cepas controles de las cepas asociadas al brote. A su vez, los aislamientos identificados en los casos con enfermedad invasora (3 cepas de 2 pacientes) se agruparon en el análisis filogenético en la misma rama (grupo I, Figura 1) y los perfiles de los otros aislamientos clínicos y aquellos asociados al personal sanitario se agruparon en una rama distante (grupo II, Figura 1). La distancia obtenida entre los perfiles obtenidos con el partidor M13 fue superior a 0,60 entre los 2 grupos bacterianos identificados, equivalente a 60% de discordancia porcentual entre las bandas (Figura 1) y sólo una banda estaba presente en ambos grupos (coeficiente de Dice 0,14). En contraste, las cepas controles se agruparon con el primer grupo porque sólo se distinguían de éste en una sola banda. Los amplicones obtenidos con el partidor ERIC-2 señalaron 5 bandas posibles con 3 perfiles totales y al igual que lo observado con el partidor M13, permitieron discriminar dos grupos bacterianos entre los aislamientos del brote (datos no mostrados). Las muestras obtenidas del mismo paciente (cepas 180 A y 180 B) tuvieron el mismo perfil ERIC-2 o M13, respectivamente y además se agruparon junto al perfil asociado a la muestra del primer caso (Figura 1). Los 2 aislamientos identificados en el personal de salud, presentaron el mismo perfil y además se agruparon con el perfil bacteriano más frecuente (grupo II).

Electroforesis de campos pulsados. Un total de 17 fragmentos de DNA (~ 65Kb a ~ 270Kb) pudo ser identificado mediante ECP con SmaI. Al igual que lo observado con los partidores ERIC-2 y M13, las cepas del brote se distribuyeron en 2 grupos y quedaron separadas de las cepas controles (Figura 2). Los aislamientos de los dos grupos clínicos identificados sólo presentaron 2 bandas coincidentes (Figura 2). Las cepas asociadas a las infecciones severas se agruparon en la misma rama, en forma coincidente a lo observado con los partidores arbitrarios ERIC-2 y M13 (cepas 179, 180A y 180B). En contraste, las otras cepas del brote y las provenientes del personal de salud, se agruparon en una rama distante (Figura 2). El análisis filogenético demostró una distancia importante entre ambos grupos identificados en el brote (coeficiente de Dice <30) y el ordenamiento fue además coincidente con aquel obtenido mediante los partidores ERIC-2 o M13. Tal como se señala en la Figura 3, los aislamientos del grupo I fueron identificados al inicio del brote (8 al 10 de abril) y se presentaron como cuadros severos. El resto de las cepas integra el grupo II, no asociado a infecciones severas y aparece en forma posterior (Figura 3). Las 3 cepas identificadas el mismo día (10 de abril) no pertenecen al mismo grupo filogenético (una cepa asociada al agrupamiento I y las dos restantes al grupo II).

Detección de los genes speA, speB y speC. Sólo los aislamientos asociados al grupo I demostraron la presencia del gen speA que codifica por un superantígeno (Tabla 1 y Figura 2). Amplicones positivos para speB fueron detectados en las 3 cepas speA positivas y en 3 de los 5 aislamientos clínicos restantes (cepas 184, 216 y 217, Tabla 1). Ambas cepas del personal de salud fueron positivas para este gen. Ninguna cepa demostró amplificación para speC. Los aislamientos asociados al gen speA fueron observados sólo en pacientes con infecciones severas (p= 0,047; Tabla 2).

Figura 1. Ordenamiento filogenético obtenido mediante el algoritmo UPGMA, utilizando la información obtenida por amplificación con el partidor arbitrario forward M13 en las cepas disponibles. A la izquierda de la figura se presentan los aislamientos de los casos estudiados (C), incluyendo las muestras controles, los aislamientos nosocomiales, el caso fuente y los identificados en un portador. Se detallan las muestras sucesivas obtenidas del mismo paciente (180A-180B) y las muestras perineal y nasal obtenidas del funcionario portador de S pyogenes (PDS). La distancia se expresa como fracción porcentual (0,1 equivale a un 10% de diferencia en bandas). La línea vertical que une los diferentes aislamientos señala la distancia que los separa.

Figura 2. A la izquierda de la figura se presenta el árbol filogenético obtenido mediante ECP con SmaI entre diferentes aislamientos identificados en un brote nosocomial por S pyogenes. Se detallan las muestras controles, casos, las obtenidas del mismo paciente (A-B) y las obtenidas del funcionario portador de S pyogenes (PDS). La distancia se representa mediante el coeficiente de Dice. A la derecha de la figura, representación esquemática de los fragmentos de DNA obtenidos con SmaI, sus respectivos pesos moleculares y además las cepas speA positivas según estudios de RCP.

Figura 3. Distribución de casos con infecciones asociadas a S pyogenes. Como se indica, los casos señalados con barras de color negro o achuradas indican que los aislamientos respectivos pertenecen a los grupos filogenéticos I o II. Las 2 muestras obtenidas del mismo paciente sólo se señalan una vez en esta figura.

Discusión

Diferentes brotes de infecciones nosocomiales asociadas a S pyogenes han sido notificados en unidades de quemados y asociados a un desenlace fatal, bacteremia33-35 o pérdida de injertos cutáneos36. Estos brotes se han relacionado con la diseminación de uno o varios grupos bacterianos según diferentes estudios moleculares aplicados en estas circunstancias17,36,37. En algunos casos, los aislamientos involucrados en brotes han sido identificados en miembros del personal36.

En este trabajo se utilizaron varias técnicas para poder discriminar inequívocamente cepas de S pyogenes genéticamente diferentes y así confirmar sus implicaciones epidemiológicas. La ECP con la enzima SmaI fue aplicada por su conocido poder discriminatorio38, capacidad potencial de ser comparada con otras publicaciones17 y recomendaciones crecientes sobre su uso39. Más aún, la amplificación génica con un conjunto de 4 partidores arbitrarios, fue utilizada para complementar los resultados debido a su facilidad relativa, baja complejidad técnica y su demostrada capacidad de mejorar el análisis epidemiológico36,40,41. Tal como demuestran los resultados, dos grupos bacterianos distantes fueron identificados en forma independiente por dos partidores arbitrarios y por electroforesis de campos pulsados con SmaI. El bajo valor del coeficiente de Dice obtenido entre ambos grupos bacterianos, descarta mutaciones recientes como las responsables de este fenómeno. Más aún, estos grupos difieren en la presencia del gen speA y estuvieron además temporalmente separados, siendo el grupo portador de este gen aislado inicialmente.

Los resultados moleculares señalan la existencia de dos brotes secuenciales por S pyogenes, sin embargo, debido a que el grupo bacteriano de aparición más tardía (grupo II), pudo ser separado en dos subgrupos por sus resultados frente a la amplificación del gen speB, posiblemente 3 grupos bacterianos pudieron finalmente estar involucrados en estos casos. Notablemente, los 3 aislamientos identificados el mismo día en diferentes pacientes, no coincidieron en sus perfiles moleculares, un hecho que resalta la importancia de este tipo de estudios en brotes nosocomiales por este agente.

Los aislamientos del único personal positivo portador de S pyogenes, presentaron resultados compatibles con su pertenencia al grupo de aparición más tardía, no asociado a los casos más severos. En cualquier caso, los estudios moleculares no permiten establecer la dirección de la transmisión entre el personal de salud y sus pacientes sino que sólo su asociación. En algunos casos se ha logrado documentar la transmisión desde un paciente al personal de salud9.

La reemergencia de las infecciones por S pyogenes se ha asociado a una amplia variedad de clones bacterianos definidos por los perfiles obtenidos con la electroforesis de múltiples locus enzimáticos23. Sin embargo, las formas más graves, tales como el síndrome de shock tóxico, parecen asociarse predominantemente con sólo 2 de estos clones electroforéticos (tipos electroforéticos 1 y 2), que además son filogenéticamente cercanos y pertenecen a un misma rama o cluster23. Los aislamientos de esta rama se caracterizan por la presencia de los serotipos 1 ó 3 de la proteína antifagocítica M en la superficie (M1 o M3)23 y alelos específicos de los genes que codifican por la toxina eritrogénica SpeA23,25. De esta manera, los aislamientos del grupo electroforético 1 están asociados al serotipo M1 y al alelo speA2, mientras que los aislamientos del grupo electroforético 2 se asocian al serotipo M3 y al alelo speA3. Las cepas de los grupos M1-speA2 y M3-speA3 han sido identificadas en diferentes lugares42,43. Los aislamientos pertenecientes al grupo M1-speA2 se han asociado también a perfiles específicos en ECP desarrollados con la enzima SfiI, presentan un alelo propio para el gen codificante de la proteína M (gen emm) y se ha planteado además su diseminación mundial31.

La virulencia de S pyogenes es explicada por una diversidad de moléculas estructurales, enzimas y exotoxinas23,44-47. Las formas clínicas severas se han asociado a aislamientos portadores del gen speA, a una mayor producción o síntesis relativa de esta molécula en comparación con la observada para la exotoxina eritrogénica B o C y además, a una mayor letalidad en un modelo animal de virulencia al comparar cepas SpeA positivas contra cepas SpeC positivas44. La molécula SpeA ha sido documentada como un superantígeno y como un factor por lo tanto capaz de estimular la liberación de los factores de necrosis tumoral a o b y de interleukina 1b desde los monocitos8,30,48. Se han descrito otros superantígenos en esta especie46. La molécula SpeB, que participa como una cisteína-proteasa, está asociada a la inducción de daño tisular en un modelo animal de injuria pulmonar47.

A pesar de la progresiva caracterización molecular de aislamientos de S pyogenes en los últimos años, no se dispone de un marcador invasor universal inequívoco. Debido a que el superantígeno SpeA se ha asociado significativamente a las formas invasoras de la enfermedad en diferentes estudios23,24,26, aunque no necesariamente a un desenlace fatal2, decidimos estudiar este factor patogénico en los aislamientos involucrados. Muestras positivas para este rasgo, sólo fueron identificadas en pacientes con manifestaciones severas de enfermedad y asociadas en un caso a un desenlace fatal. Lamentablemente, la serotipificación para la proteína M no está disponible en Chile lo que impide conocer si las variantes M1 o M3 están presentes en nuestro medio. La comparación de nuestros resultados de ECP con aquellos disponibles en la literatura para los perfiles M1 o M3 no permitieron identificar patrones similares17 sugiriendo que nuestros aislamientos speA positivos no pertenecen a los clones invasores dispersos a nivel mundial.

La identificación molecular correcta de aislamientos invasores de S pyogenes no es sólo un problema de ciencia básica. Su disponibilidad podría permitir el diseño de ensayos terapéuticos y seleccionar pacientes para mejores modalidades de intervención. Estudios de tipo caso-control sugieren que una terapia estándar con antimicrobianos y cirugía en conjunto con inmunoglobulina endovenosa, está asociada a una mayor sobrevida que la obtenida en su ausencia49,50. Una prueba rápida que permita identificar aislamientos invasores es deseable y necesaria para seleccionar terapias efectivas.

Los hallazgos de este trabajo demuestran que brotes nosocomiales por S pyogenes pueden ser explicados por diferentes clones bacterianos circulantes que difieren en sus rasgos patogénicos y que los métodos basados en la amplificación de material genético pueden reproducir o mejorar el análisis por electroforesis de campos pulsados.

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Correspondencia a: Dr. Alberto Fica C. Departamento de Medicina, Hospital Clínico Universidad de Chile, Av. Santos Dumont 999, Independencia, Santiago.
E mail: afica@ns.hospital.uchile.cl

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