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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.131 n.5 Santiago mayo 2003

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872003000500006 

Rev Méd Chile 2003; 131: 515-519

Susceptibilidad antifúngica de
Candida albicans recuperadas de
pacientes con SIDA y candidiasis
orofaríngea y esofágica.
Experiencia con Etest®

Cecilia Tapia P, Patricia González A, Angélica Pereira Aa,
Jorge Pérez G, Luis M Noriega R, Elizabeth Palavecino R.

Antifungal susceptibility testing of
Candida albicans isolates from AIDS
patients with oropharyngeal and
esophageal candidiasis.
Experience with Etest®

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Background: Oropharyngeal candidiasis (OPC) and esophageal candidiasis (EPC) are frequent complications in AIDS patients. The use of Fluconazole, an effective and a low toxicity drug, has been associated to the emergency of secondary resistant strains. For this reason, in vitro antifungal susceptibility tests are necessary to predict a therapeutic failure. Etest® is an easy to perform alternative test, that has showed a good agreement with the broth microdilution reference method (NCCLS, document M27-A). Aim: To measure the susceptibility of C. albicans isolates from AIDS patients complicated with OPC and EPC to Amphotericin B (AmB) and Fluconazole (Flu) using Etest®. Material and methods: Twenty strains from 20 AIDS patients were studied. AmB was tested in RPMI 1640 agar and Flu in Casitone agar. Results: All studied strains showed minimal inhibitory concentrations (MICs) <1 mg/mL for AmB. A highly resistant strain to Flu (>256 mg/mL) was isolated from a patient previously treated with Flu. Conclusions: In AIDS patients with OPC and EPC, the susceptibility to Flu of the isolates should be screened, to detect resistant strains. Etest®; is a reliable alternative in these cases, for laboratories that cannot use the reference method (Rev Méd Chile 2003; 131: 515-19).
(Key Words: Acquired immunodeficiency syndrome; Amphotericin B; Candida albicans; Fluconazole)

Recibido el 9 de septiembre, 2002. Aceptado en versión corregida el 1 de abril, 2003.
Laboratorio de Microbiología y Servicio de Medicina del Hospital Dr. Sótero del Río, Laboratorio de Microbiología de la Pontificia Universidad Católica de Chile.
aTecnólogo médico

La candidiasis orofaríngea (COF) es la infección oportunista más frecuente de los pacientes con Síndrome de la Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). La mayoría de los pacientes (más de 90%) sufre al menos un episodio durante el curso de su enfermedad, lo cual se relaciona directamente con un recuento de linfocitos T CD4 (+) inferior a 200 células/mm3 e inversamente con el inicio de una terapia antirretroviral1-3.

Las manifestaciones de enfermedad diseminada son raras con Candida albicans, sin embargo, aproximadamente 20% de los pacientes desarrolla candidiasis esofágica (CE)2.

El agente más frecuentemente aislado de COF es C. albicans, aunque, otras especies como C glabrata, C. tropicalis y C. krusei han sido identificadas en esta infección1,4-6. Una especie que ha cobrado relevancia en el último tiempo y que también es agente causal de COF tanto en pacientes VIH negativos como en pacientes con SIDA es C dubliniensis. Se ha observado que C dubliniensis reemplaza a C. albicans en pacientes con SIDA y COF tratados previamente con fluconazol. Esta especie es similar fenotípicamente a C. albicans (produce clamidoconidios y tubo germinativo), por lo cual, inicialmente fue difícil la diferenciación entre ambos7.

El uso de fluconazol (FZ), triazol altamente efectivo y de baja toxicidad ampliamente utilizado en prevención y terapia de estas complicaciones, se ha asociado a la aparición de resistencia secundaria de las especies aisladas2,3,8,9. Los factores de riesgo más importantes de adquirir resistencia secundaria a fluconazol son los episodios recurrentes de COF y el tratamiento previo con la droga. Se ha demostrado que existe una buena correlación entre la concentración inhibitoria mínima (CIM) y la respuesta a tratamiento en pacientes con SIDA y COF3,8-10. Debido a esto, surgió la necesidad de medir la sensibilidad de las cepas aisladas de COF (fundamentalmente a azoles) mediante el uso de técnicas estandarizadas de susceptibilidad antifúngica8-10.

En la actualidad existen dos estándares internacionales que utilizan el método de microdilución en caldo con este propósito. El estándar más utilizado por laboratorios de referencia es el del National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), documento M27-A11. La técnica es difícil de realizar y ocupa mucho tiempo de personal entrenado. Por este motivo, han aparecido en el mercado nuevos métodos más fáciles de realizar, mostrando una buena concordancia con los estándares. Etest®, es un método comercial (AB Biodisk, Solna, Suecia) de difusión en agar que utiliza una tira con concentraciones crecientes del antifúngico a estudiar y que permite obtener la concentración inhibitoria mínima (CIM) mediante una lectura visual. Diversos estudios han descrito un nivel de concordancia entre 86 y 100%, comparando Etest® y el método del NCCLS12-14.

El objetivo de este estudio fue medir sensibilidad a Anfotericina-B (AnfB) y Fluconazol (FZ) de C. albicans aisladas de pacientes con SIDA complicados con COF y CE mediante Etest®, con el fin de detectar cepas resistentes que eventualmente determinen una falla terapéutica.

MATERIAL Y MÉTODO

El estudio fue realizado en el Hospital Dr. Sótero del Río en junio de 1999.

Cepas. Se estudiaron 20 cepas correspondientes a 20 pacientes con SIDA (17 hombres y 3 mujeres) aisladas de orofaringe (6), cepillado esofágico (3) y biopsia esofágica (11) (Tabla 1). La identificación de las cepas se realizó mediante la prueba de tubo germinativo y agar cromogénico (Albicans ID, BioMèrieux).

Pacientes. Se estudiaron pacientes con SIDA afectados por candidiasis orofaríngea y/o esofágica y en un estado avanzado de enfermedad (estadio C3). Las muestras fueron recolectadas entre agosto de 1997 y marzo de 1998. Se determinó el recuento de linfocitos T CD4 (+) de los pacientes al momento de la toma de muestra (Tabla 1).

Estudio de susceptibilidad a antifúngicos. Se realizó una suspensión de levaduras 0,5 unidades Mc Farland, se inocularon las placas y se aplicaron las tiras de Etest®, según las especificaciones del fabricante. Se utilizaron los medios RPMI 1640 (American Biorganics) y agar Casitona (Difco) para AnfB y FZ respectivamente. Las placas fueron incubadas toda la noche a 35°C. Para validar cada ensayo se utilizó la cepa ATCC Candida parapsilosis 22019 como control.

Las lecturas de los elipses se realizaron a las 24 h de incubación y se usó el criterio de 95 a 100% de inhibición para AnfB y 80% de inhibición para FZ (AB Biodisk, Solna, Sweden, Antifungal susceptibility testing of yeasts, Appendix. Etest® technical guide 4B, 1994).

Los puntos de corte fueron interpretados de acuerdo al documento M27-A de la NCCLS, clasificando a las cepas como susceptibles (S), susceptibles dosis dependiente (SDD) y resistente (R), según correspondiera (Tabla 2).

RESULTADOS

Todas las cepas estudiadas mostraron CIMs <1 µg/mL para AnfB, con un rango entre 0,047 y 0,94 µg/mL (Figura 1). Las CIMs obtenidas para FZ fueron más elevadas con un rango más amplio, sin embargo la mayoría de las cepas (18/20) fue susceptible in vitro a esta droga (Figura 2). Dos cepas mostraron algún grado de resistencia a FZ; una fue susceptible dosis dependiente (CIM de 16 µg/mL) y otra francamente resistente (CIM >256 µg/mL), de acuerdo a los criterios establecidos en el documento M27-A del NCCLS (Tabla 1).

Figura 1. Distribución de las Concentraciones Inhibitorias Mínimas (CIMs) a Anfotericina B (AnfB) de 20 cepas de C. albicans aisladas de candidiasis orofaríngea y esofágica de pacientes con SIDA. Rango de CIMs para AnfB: 0,047-0,94 µg/mL.

Figura 2. Distribución de las Concentraciones Inhibitorias Mínimas (CIMs) a Fluconazol (FZ) de 19 cepas de C. albicans aisladas de candidiasis orofaríngea y esofágica de pacientes con SIDA. La mayoría de las cepas fue susceptible in vitro a FZ. Rango de CIMs de cepas susceptibles a FZ: 1-4 µg/mL. Una cepa con una CIM >256 µg/mL, no fue incluida en el histograma.

DISCUSIÓN

Los pacientes afectados se encontraban en estadio C3 de su enfermedad con recuentos bajos de linfocitos T CD4 (+) (mediana 25/mm3), lo que favoreció el desarrollo de COF o CE (Tabla 1).

Todas las cepas estudiadas presentaron CIMs inferiores a 1 µg/mL de AnfB, lo cual concuerda con lo observado en otros estudios; los casos de resistencia en COF se han descrito fundamentalmente en relación a FZ. Sólo una cepa mostró una franca resistencia a FZ (CIM >256 µg/mL) y se aisló de biopsia esofágica de un paciente que había recibido tratamiento previo con ese antifúngico (vía oral). Considerando la gravedad del cuadro (candidiasis esofágica) la determinación de la CIM es fundamental para modificar el esquema terapéutico en estos pacientes, dada la correlación que existe entre la CIM de la cepa y la respuesta a tratamiento.

A pesar que este estudio fue realizado con un número limitado de cepas (n=20), la mayoría de ellas (14/20) fueron aisladas de cepillado y biopsia esofágicos. Estas últimas, son muestras de calidad óptima y reflejan una diseminación de la enfermedad en los pacientes estudiados.

Etest® es un método comercial patentado, motivo por el cual, no puede incluirse en los estándares internacionales, sin embargo, ha sido avalado por diversos autores, convirtiéndose en la actualidad en una alternativa promisoria para laboratorios que no cuenten con la técnica estándar. Es un método accesible para laboratorios de rutina tanto desde el punto de vista técnico como económico.

En base a estos resultados, es posible concluir que en pacientes infectados con VIH que desarrollan COF y CE es fundamental vigilar la susceptibilidad de las cepas a FZ, ya que, la aparición de cepas resistentes puede traducirse en una falla terapéutica. Etest® un método confiable, capaz de detectar cepas altamente resistentes y factible de realizar en laboratorios de microbiología que no cuentan con el método de referencia.

REFERENCIAS

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Correspondencia a: Dra. Cecilia Tapia P. Programa de Microbiología y Micología, ICBM. Facultad de Medicina Universidad de Chile. Av. Independencia 1027, Santiago de Chile. Fono: 56-2-6786145. Fax: 56-2-7355855 E mail: cvtapia@entelchile.net

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