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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.131 n.7 Santiago jul. 2003

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872003000700003 

Rev Méd Chile 2003; 131: 727-733

Integrones y cassettes genéticos de
resistencia a antimicrobianos en
cepas de Shigella flexneri

Jeannette Muñoz A1a, Helia Bello T1b,
Mariana Domínguez Y1b, Sergio Mella M2,
Raúl Zemelman Z3c y Gerardo González R1d

Integrons and antimicrobial
resistance gene cassettes in
Shigella flexneri strains

Background: The resistance of Shigella flexneri to antimicrobial agents can be associated to the presence of integrons that may contain and express antimicrobial resistance gene cassettes. Aim: To study antimicrobial resistance and the presence of integrons and antimicrobial gene cassettes in Shigella flexneri strains. Material and methods: In vitro susceptibility to 27 antimicrobials was studied in twenty four Shigella flexneri strains isolated from stools. The presence of integrons class 1, 2 and 3 and antimicrobial resistance gene cassettes was investigated by polymerase chain reaction (PCR) using specific primers for each gene. Results: Most strains were resistant to one of the following antimicrobials: ampicillin, sulphonamide, trimethoprim, tetracycline, streptomycin, sulfamethoxazole-trimethoprim or chloramphenicol. Twenty nine percent were simultaneously resistant to all these antimicrobials. Integrons class 1 and 2 were found in 19 strains (79%). Class 3 integrons were not found. Gene cassettes dfrA1 and ant(3")I were associated to integrons class 2 in most strains (15/20, 75%). Genes cat, tetB and blarTEM were detected in 18/24 (75%), 7/24 (29%) and 4/24 (17%) of the strains, respectively and were not associated to any of the studied integrons. Genes that codify enzymes AAC(6')Ib and APH(3')VI were not detected in any strain. Conclusions: The high frequency of integrons found in the studied strains, could partly explain the increasing antimicrobial resistance of Shigella flexneri strains, isolated in Chile (Rev Méd Chile 2003; 131: 727-33).
(Key Words: Drug resistance, microbial; Gene library; Integrons; Shigella flexneri).

Recibido el 25 de febrero, 2003. Aceptado en versión corregida el 16 de mayo, 2003.
Trabajo financiado por Proyecto FONDECYT # 1000352.
1Departamento de Microbiología. Facultad de Ciencias Biológicas,
2
Departamento de Medicina Interna, Facultad de Medicina, Universidad de Concepción y
3
Facultad de Ciencias y Tecnología, Universidad San Sebastián, Concepción. Chile
aBiólogo
bBioquímico. Magíster en Microbiología
cQuímico-Farmacéutico. Dipl. Bacteriol. MSc Public Health
dLicenciado en Biología, Magíster en Microbiología, Doctor en Ciencias Biológicas

La shigelosis es una enfermedad infecciosa intestinal, que pese a la condición de transición epidemiológica de nuestro país, se mantiene como una infección endémica en nuestro medio1. Se reconocen 4 especies de Shigella: S flexneri, S sonnei (frecuentes en infecciones endémicas), S dysenteriae (produce epidemias severas y mortales) y S boydii (aislada muy ocasionalmente)2. Ferreccio y col3 han informado que en Santiago (Chile) la incidencia de Shigella, como causa de diarrea, es más elevada en niños de 1 a 4 años de edad. Por otra parte, Prado y col4 y Carrasco y col5 han informado que en Chile las especies que más frecuentemente causan diarrea sanguinolenta son S flexneri, seguida de S sonnei, pero que cada dos a tres años se observa un predominio de esta última especie.

En cepas de Shigella se ha descrito un aumento progresivo de la resistencia a varios antibióticos, incluyendo a aquellos que son considerados de elección en el tratamiento de las infecciones que ellas producen. Destaca, por su importancia clínica y epidemiológica, la resistencia a ampicilina y sulfametoxazol-trimetoprim6 y, además, en cepas de S flexneri aisladas en Brasil también se ha descrito aumento de la resistencia a trimetoprim, sulfametoxazol-trimetoprim, cloranfenicol y ampicilina-sulbactam7.

Actualmente se sabe que la resistencia a diversos antibióticos puede estar relacionada con la presencia de integrones y cassettes genéticos de resistencia8,9. Los integrones codifican un sistema de recombinación específica de sitio, que consta de la integrasa (enzima que media la recombinación) y de un sitio de recombinación (attI) ubicados en el segmento 5´ conservado (5'CS). Estos elementos genéticos poseen dos promotores de orientación opuesta: PI, para el gen de la integrasa (intI), y PC (o Pant), que permite la expresión de los cassettes genéticos de resistencia que han sido integrados en el sitio attI. Los integrones, cuando forman parte de un transposón, pueden ser transferidos por transposición desde un plásmido al cromosoma o viceversa y también pueden ser transferidos por conjugación desde una bacteria a otra. Estos mecanismos genéticos permiten una rápida diseminación de los genes de resistencia a antibióticos entre las comunidades bacterianas que están sometidas a alta presión selectiva, como ocurre en el ambiente hospitalario10,11. Existen 3 clases de integrones relacionados con la resistencia a antibióticos, los cuales difieren en la secuencia aminoacídica de sus integrasas12-14.

Los integrones clase 1 son los más estudiados y mejor caracterizados, principalmente por su alta diseminación y porque han sido encontrados en bacterias hospitalarias8,9,12,14. Esta clase de integrones posee un segmento conservado en el extremo 3' (3´CS), donde se ubican los genes qacED1 y sul1 que codifican resistencia a compuestos de amonio cuaternario y sulfonamidas, respectivamente. Además, se ubica el gen orf5 que es un marco de lectura abierta al que no se le conoce su función8,9. Los integrones clase 2, cuyo gen intI posee sólo 42% de similitud con el de la integrasa clase 1 y no tiene una secuencia 3´CS, poseen una mutación puntual que genera un codón de término hacia el final de la secuencia del gen intI2, generando una proteína truncada con limitada eficiencia en su función. Esta clase de integrones se ha asociado únicamente con Tn7 o transposones relacionados a él13. Finalmente, la integrasa clase 3 posee 62% de similitud con la integrasa clase 1 y sólo ha sido descrita en algunas cepas aisladas en Japón15.

En este estudio se determinó la actividad de varios antibióticos sobre cepas de S flexneri aisladas de deposición en un laboratorio clínico extrahospitalario de la VIII región y en 5 hospitales de las I, VIII y X regiones de Chile. Además, se pesquisaron integrones clase 1, 2 y 3 y se relacionó su presencia con el perfil de resistencia que presentan las cepas, describiendo alguno de los cassettes genéticos encontrados.

MATERIAL Y MÉTODO

Cepas bacterianas. Se incluyó 24 cepas de S flexneri aisladas de muestras de deposición, obtenidas entre abril de 2000 y enero de 2002, de pacientes ingresados en los Servicios de Medicina o Pediatría de los hospitales Regional de Iquique (I región), San José de Coronel, Base de Lota y Base de Lirquén (VIII región), Base de Ancud (X región) y un laboratorio clínico extrahospitalario de Concepción (VIII región). Todas las cepas fueron mantenidas a -70°C en una mezcla de caldo tripticasa y glicerol 50% (2:1).

Estudio de susceptibilidad a agentes antibacterianos. Se determinó los patrones de resistencia de las cepas por el método de difusión en agar, según normas del NCCLS16. Los agentes antibacterianos utilizados fueron: ampicilina (AMP), amoxicilina-ácido clavulánico (AMC), aztreonam (ATM) cefradina (CED), ceftizoxima (CZX), cefuroxima (CXA), cefotaxima (CTX), ceftazidima (CAZ), cefoperazona (CFP), ceftriaxona (CRO), cefpodoxima (CPD), cefepima (FEP), cefixima (CFM), imipenem (IMP), cloranfenicol (CLO), tetraciclina (TET), sulfonamida (SUL), ciprofloxacina (CIP), gentamicina (GEN), amikacina (AMK), tobramicina (TOB), neomicina (NEO), netilmicina (NET), dibekacina (DBK), estreptomicina (STR), kanamicina (KAN), sulfametoxazol-trimetoprim (SXM) y trimetoprim (TMP). Mediante dilución seriada en agar17 se determinó el nivel de resistencia, estudiando la concentración mínima inhibitoria (CMI) de AMP, CLO, TET, STR, SXM y TMP.

Detección de integrones clase 1, 2 y 3 e identificación de "cassettes" genéticos. Se realizó mediante PCR utilizando partidores específicos para cada gen (Tabla 1). La mezcla de reacción contenía: 2,5 µl de dNTPs (1,25 mM de cada desoxinucleótido), 1,25 µl de MgCl2 (50 mM), 2,5 µl de tampón PCR 10x, 0,125 µl de Taq ADN polimerasa (Gibco, BRL), 2,5 µl de cada partidor (0,5 µM) (Gibco, BRL), 10 µl del templado de ADN y agua bidestilada estéril en cantidad suficiente para completar un volumen final de 25 µl. El templado se preparó a partir del sobrenadante obtenido de un cultivo de 109 UFC/ml sometido a ebullición por 15 min y centrifugado a 14.000 rpm por 5 min. La amplificación se realizó en un termociclador PTC-150 Minicycler MJ Research Inc Waltham, MA, con el siguiente programa: un ciclo de 96°C por 30 s, 55°C por 1 min, 70°C por 3 min, 25 ciclos de 96°C por 15 s, 55°C por 30 s, 70°C por 3 min y una extensión final a 70°C por 5 min. Los productos de amplificación se detectaron por electroforesis en geles de agarosa 1% y se visualizaron en un transiluminador de luz UV (Vilbert-Loumart), después de teñir en una solución de bromuro de etidio 0,5 µg/ml.


RESULTADOS

En la Figura 1 se puede observar que las cepas estudiadas presentaron resistencia a varios antibióticos. La frecuencia de cepas resistentes fue más alta para trimetoprim (24/24, 100%), ampicilina (23/24, 96%), estreptomicina (23/24, 96%), tetraciclina (19/24, 79%), sulfonamida (18/24, 75%), sulfametoxazol-trimetoprim (18/24, 75%) y cloranfenicol (9/24, 37,5%). En cambio, para el resto de los antibióticos aminoglicósidos y ß-lactámicos ensayados, todas las cepas fueron susceptibles. Las CMIs de los antibióticos para los cuales se encontraron cepas resistentes se presentan en la Tabla 2, y los valores fluctuaron entre £2 µg/ml y >1.024 µg/ml.


Figura 1. Distribución de las cepas de S flexneri resistentes a agentes antimicrobianos.


La detección de integrones en las cepas de S flexneri evidenció que tanto integrones de la clase 1 como de la clase 2 son prevalentes en estas cepas, puesto que 19 (79,2%) de ellas presentaron ambas estructuras genéticas, simultáneamente. Solamente una cepa presentó exclusivamente integrón clase 1 y otra sólo integrón clase 2; en contraste, tan sólo 3 cepas no poseían integrones. Los integrones clase 3 no fueron detectados. Los patrones de resistencia de las cepas que poseen alguna clase de integrón son más extensos que los de las cepas que no los poseen (Figura 2).


Figura 2. Amplitud del perfil de resistencia a antimicrobianos en 24 cepas de S flexneri con y sin integrones.

Los cassettes genéticos detectados fueron dfrA1 y ant(3")I, los que solamente se asociaron a integrones clase 2 en 75% de las cepas con esta estructura genética. En ninguna de las cepas se detectaron los genes que codifican las enzimas AAC (6') Ib y APH (3') VI.

El resto de los genes estudiados, tales como cat, tet B y bla-TEM fueron detectados en 18/24 (75%), 7/24 (29%) y 4/24 (17%) de las cepas, respectivamente. Estos, sin embargo, no se asociaron a integrones. Por otra parte, ninguno de los cassettes genéticos encontrados se asoció a integrones clase 1.


Figura 3. Perfil de rep-PCR en cepas de S flexneri aisladas de hospitales de las VIII y X regiones. 1: 1Kb DNA ladder; 2, 14, 15, 16: Hospital de Lota; 3, 4, 5, 6, 7: Hospital de Coronel; 8, 9, 10: Hospital de Ancud, 11, 12, 13: Hospital de Lirquén.

DISCUSIÓN

La resistencia observada en las cepas de S flexneri a antibióticos como ampicilina, trimetoprim, cloranfenicol, estreptomicina, tetraciclina y sulfametoxazol-trimetoprim concuerda con resultados de estudios nacionales y extranjeros1-7. Es interesante destacar que estas cepas no sólo presentan un amplio perfil de resistencia sino que también exhiben elevados niveles de resistencia a los antibióticos considerados, históricamente, como de primera elección. Así, la CMI50 y CMI90 de ampicilina fue 64 µg/ml y 1.024 µg/ml, respectivamente (Tabla 2). Con respecto a los antibióticos aminoglicósidos ensayados, sólo se observó resistencia a estreptomicina, a diferencia de lo informado en un estudio con cepas aisladas de pacientes ambulatorios de los consultorios de atención primaria de Antofagasta, en que se encontró resistencia moderada a amikacina y gentamicina24.

Los patrones de resistencia más frecuentes en las cepas de S flexneri estudiadas (7/24, 29,2%) incluyó 6 antibióticos, no obstante se encontró cepas con 8 y 10 resistencias (Figura 2). Lo anterior deja de manifiesto la múltiple resistencia de algunas de estas cepas, aun cuando la mayoría fue susceptible a varios de los antibióticos ß-lactámicos y aminoglicósidos ensayados.

La mayoría de las cepas de S flexneri estudiadas presentó integrones clase 1 y 2 simultáneamente, de tal forma que no podría establecerse que existe una prevalencia de alguna de las clases de estas estructuras genéticas, a diferencia de lo informado por Lèvesque y col12 que establecen que integrones clase 1 son los más frecuentes en cepas de enterobacterias. En 87,5% de las cepas resistentes se detectó integrones, siendo evidente que muchas de ellas tenían, además, un amplio perfil de resistencia que incluía a varios de los antibióticos ensayados, situación que también ha sido observada en cepas de Acinetobacter baumannii11. Los cassettes genéticos dfrA1 y ant(3'')I sólo se asociaron a integrones clase 2, en casi todas las cepas que los poseían. Estos cassettes son constituyentes del integrón In4, que se encuentra formando parte del transposón Tn719 junto con el gen sat, y han sido informados por otros autores en cepas de enterobacterias25. El gen sat no fue detectado, pero el tamaño del producto de amplificación generado por los partidores hep74/aadA1, permite suponer la existencia de este gen en las cepas incluidas en este trabajo.

La elevada resistencia a ampicilina presentada por las cepas de S flexneri podría explicarse en parte por la presencia del gen bla-TEM detectado en las cepas, aun cuando éste no sería el único responsable de dicha resistencia, puesto que podrían existir otras ß-lactamasas que no fueron pesquisadas en este estudio. Con respecto al gen cat, que está presente en 75% de las cepas, la situación es diferente, ya que la frecuencia de cepas resistentes a cloranfenicol es baja, indicando que este gen no se estaría expresando en todas las cepas que lo poseen.

La alta frecuencia de cepas de S flexneri resistentes a tetraciclina podría explicarse, en parte, a la presencia del gen tetB, o bien a otros genes tet que no se investigaron en este trabajo.

No obstante el reducido número de cepas incluidas en este estudio, este trabajo constituye el primer informe nacional de la presencia de integrones en este importante patógeno intestinal, indicando que estas estructuras podrían constituir un importante mecanismo molecular de diseminación de la resistencia, explicando, al menos en parte, el aumento de resistencia observado en esta bacteria en los últimos años.

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Agradecimientos

Expresamos nuestros agradecimientos a TM Juan Leiva y TM Fermín Méndez (Hospital Regional de Iquique) BQ Verónica Sepúlveda (Hospital Base de Lirquén), TM Jorge Rubilar (Hospital Base de Lota), QF Sara Toledo (Hospital San José de Coronel) y TM María E Oñate (Hospital Base de Ancud) por enviarnos desinteresadamente las cepas incluidas en este trabajo.


Correspondencia a: Gerardo González Rocha. Sección Antibióticos, Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción. Tel: +56 41 203237 Fax: +56 41 245975. E mail: ggonzal@udec.cl

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