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Revista médica de Chile

versão impressa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.134 n.4 Santiago abr. 2006

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872006000400002 

Rev Méd Chile 2006; 134: 415-420

Artículo de Investigación

 

Transferecia de de ß-lactamasas de espectro extendido desde cepas hospitalarias de Klebsiella pneumoniae a otras especies de enterobacterias

Transference of extended-spectrum ß-lactamases from nosocomial strains of Klebsiella pneumoniae to other species of Enterobacteriaceae

 

Magaly Sánchez U1a, Helia Bello T1b, Mariana Domínguez Y1b, Sergio Mella M2, Raúl Zemelman Z3d, Gerardo González R1c.

1Grupo de Investigación en Resistencia a Antibióticos, Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas, 2Departamento de Medicina Interna, Facultad de Medicina, Universidad de Concepción y 3Facultad de Ciencias y Tecnología, Universidad San Sebastián. Concepción. Chile.
aLicenciado en Bioquímica
bBioquímica, Magíster en Microbiología
cLicenciado en Biología, Magíster en Microbiología, Doctor en Ciencias Biológicas
dQuímico-Farmacéutico, Diplomado en Bacteriología, MSc Public Health

Dirección para correspondencia


Background: Klebsiella pneumoniae is an important pathogenic bacterium, frequently isolated from nosocomial samples, that exhibits wide antimicrobial resistance profiles, including third generation cephalosporins (3GC), aminoglycosides and quinolones. The resistance to 3GC is mainly due to the synthesis of extended spectrum beta lactamases (ESBL), encoded by conjugative plasmids. Aim: To investigate the potential transference of resistance to 3GC from nosocomial strains of K. pneumoniae to other clinical strains of various species of Enterobacteriaceae. Material and methods: The mating experiments were carried out in liquid media and three nosocomial strains of K. pneumoniae were used as donors. These strains were ESBL-producers and resistant to, at least, one of the 3GC assayed. One strain of Citrobacter freundii, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens and Escherichia coli, isolated from clinical specimens, were used as recipients. The presence of bla genes was investigated by PCR. Results: The three nosocomial strains of K. pneumoniae were able to transfer the resistance to 3GC and the genes encoding the ESBL to the susceptible recipient strains of enterobacteria. The frequency of transference was as high as 3.2 x 10-2 transconjugants/recipient cell when the strain of Citrobacter freundii was used as recipient. All transconjugants exhibited high level of resistance to the 3GC assayed. Conclusions: Strains of K. pneumoniae isolated from Chilean hospitals are able to disseminate the ESBL genes to clinical strains of others species of Enterobacteriaaceae.

(Key Words: Beta-lactamases; Drug resistance, bacterial; Klebsiella pneumoniae)


Los antibióticos ß-lactámicos son ampliamente utilizados, tanto a nivel hospitalario como en la comunidad, favoreciendo la selección de bacterias productoras de enzimas ß-lactamasas, que son responsables de esta resistencia por hidrólisis del anillo ß-lactámico del antibiótico1. Trascendental importancia revisten las cepas productoras de ß-lactamasas de espectro-extendido (BLEE), enzimas que tienen la capacidad de inactivar cefalosporinas de tercera generación (C3G), monobactámicos y, en menor grado, algunas cefalosporinas de cuarta generación1-3. La mayoría de estas enzimas derivan de las ß-lactamasas TEM-1 y SHV-1 que, por mutaciones en los genes que las codifican, han originado enzimas con un perfil de substrato más amplio2,4. Estas cepas productoras de BLEE son seleccionadas, principalmente, en el ambiente hospitalario por el frecuente uso de cefalosporinas, especialmente de tercera generación1,5. La mayor parte de las BLEE son inhibidas con ácido clavulánico, propiedad que se utiliza en el laboratorio para detectar la presencia de estas enzimas a través de distintas pruebas de sinergia6-9. En la actualidad, uno de los principales problemas hospitalarios es la resistencia bacteriana a antibióticos codificada en genes de ubicación extracromosómica, como aquellos que están localizados en plásmidos o elementos transponibles, debido a su potencial transferencia a otras cepas bacterianas susceptibles que circulan en el ambiente hospitalario10.

K. pneumoniae es uno de los bacilos Gram negativos resistentes a antibióticos más frecuentemente aislados de episodios infecciosos a nivel hospitalario. Las cepas de esta especie presentan amplios y elevados niveles de resistencia, en especial a antibióticos de amplio espectro como son las C3G y antibióticos aminoglicósidos, siendo su principal mecanismo de resistencia la síntesis de BLEE y enzimas modificantes de aminoglicósidos11-13.

En este trabajo, se evaluó la transferencia de resistencia a C3G y de genes que codifican BLEE desde cepas hospitalarias de K. pneumoniae a otras enterobacterias aisladas de diversos productos patológicos.

MATERIAL Y MÉTODO

Cepas bacterianas. Como cepas dadoras se utilizó tres cepas de K. pneumoniae productoras de BLEE, de acuerdo al método de detección de estas enzimas recomendado por el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)14 y que eran susceptibles a ácido nalidíxico (Concentración Mínima Inhibitoria [CMI] ­4 µg/ml) y resistentes a, al menos, una C3G o aztreonam (Tabla 1). Todas estas cepas producían BLEE y poseían los genes blaTEM, blaSHV y dos de ellas, además, el gen blaCTX-M. Las cepas fueron aisladas de secreción bronquial o herida, durante el año 2000, en tres hospitales chilenos. Como cepas receptoras se utilizaron cuatro cepas de enterobacterias aisladas de diferentes productos patológicos: Citrobacter freundii CF-1 (orina), Salmonella typhimurium Sal-53 (coprocultivo), Serratia marcescens S-25 (secreción bronquial) y Escherichia coli EC-151 (hemocultivo). A partir de estas cepas se obtuvo mutantes resistentes a ácido nalidíxico (CMI >1.024 µg/ml), por el método de Szybalsky15. Además, estas cepas no eran productoras de ß-lactamasas (Tabla 1). En los ensayos de susceptibilidad se utilizó como control la cepa E. coli ATCC 25922 y, como control positivo de la producción de BLEE, la cepa K. pneumoniae ATCC 700603. En el estudio de los genes bla del tipo TEM, SHV y CTX-M, se empleó como control la cepa K. pneumoniae UC-168 (donada por el Dr. Marcelo Galas del Instituto «Dr. Carlos Malbrán», Argentina), que posee los genes blaTEM, blaSHV y blaCTX-M. Todas las cepas fueron mantenidas a -70°C en un mezcla 2:1 de caldo tripticasa y glicerol 50% (v/v).


Detección de BLEE. La detección de las enzimas BLEE se realizó de acuerdo al método de detección recomendado por el NCCLS14. Este método consiste en realizar un antibiograma con discos de cefotaxima (30 µg), ceftazidima (30 µg) y cefpodoxima (30 µg) solos y en combinación con 10 µg de ácido clavulánico, los que comercialmente fueron obtenidos de la empresa Oxoid Ltd. La presencia de BLEE se visualiza cuando se produce un aumento en los halos de inhibición de ž5 mm en los discos de antibióticos que contienen ácido nalidíxico.

Actividad antibacteriana. El nivel de resistencia de las cepas fue determinado por el método de dilución seriada en agar (CMI), de acuerdo a las recomendaciones del NCCLS14, utilizando cefotaxima (Laboratorio Chile), ceftazidima (Glaxo-Wellcome), cefoperazona (Laboratorio Chile), ceftriaxona (Roche), aztreonam (Bristol-Myers) y ácido nalidíxico (Merck).

Transferencia de genes de BLEE. Se realizó mediante conjugación en medio de cultivo líquido, de acuerdo a la metodología descrita por Arlet y col16. Para la selección de las cepas transconjugantes se utilizaron placas de agar cromogénico (Oxoid Ltd.), suplementadas con cefotaxima (9 µg/ml) y ácido nalidíxico (600 µg/ml). Las placas se incubaron a 37°C durante 24 h.

Detección de genes de ß-lactamasas. La detección de los genes bla de las diferentes familias de ß-lactamasas, se realizó utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (RPC), de acuerdo a los protocolos señalados para cada pareja de partidores (Tabla 2). Los productos de amplificación fueron separados por electroforesis en geles de agarosa 1%, teñidos con bromuro de etidio (0,5 µg/ml) y visualizados en un transiluminador de luz UV.


RESULTADOS

Las tres cepas de K. pneumoniae fueron resistentes a cefotaxima, ceftriaxona, cefoperazona y aztreonam y sólo una de ellas presentó resistencia a ceftazidima (Tabla 1). Los niveles de resistencia a cefoperazona (128-512 µg/ml) y ceftriaxona (256-512 µg/ml) fueron mayores que los obtenidos para cefotaxima (64-128 µg/ml). Todas las cepas de enterobacterias utilizadas como bacterias receptoras, presentaron susceptibilidad a las C3G y en ninguna de ellas se detectó la presencia de BLEE (Tabla 1).

La frecuencia de transferencia de los genes bla varió entre 7,8 x 10-7 y 3,2 x 10-2 transconjugantes/célula receptora, para el par conjugante formado por las cepas K329 y Sal-53 y K283 y Cf-1, respectivamente. La mayor frecuencia de transferencia de resistencia a C3G y aztreonam se observó hacia la cepa de C. freundii Cf-1, con las tres cepas de K. pneumoniae utilizadas como cepas dadoras, con valores que fluctuaron entre 4,2 x 10-4 y 3,2 x 10-2 transconjugantes/célula receptora, utilizando como dadoras las cepas de K. pneumoniae K329 y K283, respectivamente. La menor frecuencia de transferencia se obtuvo cuando se usó como receptora la cepa de S. typhimurium Sal-53, con valores que fluctuaron entre 10-4 y 10-7 transconjugantes/célula receptora (Tabla 3).


Hacia todas las cepas receptoras, se transfirieron los genes blaTEM y blaCTX-M desde las cepas K. pneumoniae K283 y K295 y blaTEM, blaSHV y blaCTX-M desde la cepa K. pneumoniae K329. Los valores de CMI para las C3G en todas las cepas transconjugantes aumentaron considerablemente respecto de las respectivas cepas receptoras y, en la mayoría de los casos, correspondieron a valores de CMI que indican resistencia (Tabla 4). En las cepas transconjugantes la CMI de las C3G y aztreonam aumentó de 2 a 512 veces el valor de CMI observado con las cepas receptoras y existió correspondencia con el valor de CMI observado para las cepas dadoras.


En todas las cepas transconjugantes se obtuvo sinergia con ácido clavulánico, lo que indicó la presencia de una BLEE, de acuerdo al método recomendado por el NCCLS (2000)8. Estos resultados son concordantes con los estudios genéticos, puesto que en las cepas transconjugantes se detectó, mediante RPC, los genes blaCTX-M o blaSHV.

DISCUSIÓN

Las BLEE son enzimas que inactivan C3G y aztreonam, cuya codificación genética está mediada por plásmidos conjugativos1,10, hecho que ha permitido que las BLEE sean diseminadas hacia bacilos Gram negativos susceptibles, especialmente en el ambiente hospitalario. En este sentido, las cepas de K. pneumoniae han tenido un importante rol, ya que ellas han sido catalogadas como el principal reservorio de genes de BLEE y otros genes de resistencia que pueden transferir a cepas susceptibles20. Los resultados obtenidos en este estudio permiten confirmar estas aseveraciones, ya que fue posible transferir por conjugación la resistencia a C3G y aztreonam desde todas las cepas hospitalarias de K. pneumoniae usadas como dadoras hacia las cepas de diferentes especies de enterobacterias usadas como receptoras. Este estudio constituye una evidencia de la transferencia de genes de BLEE entre cepas de especies de bacilos Gram negativos aisladas en centros hospitalarios chilenos. Los resultados fueron corroborados con los estudios genéticos de RPC, ya que se detectó los genes bla en todas las cepas receptoras. Además, se confirmó que los genes blaSHV amplificados correspondieron a una BLEE de esta familia, ya que al realizar un RFLP del producto de RPC con la enzima NheI, éste fue positivo. Esto sólo ocurre si el gen blaSHV-1 ha sufrido una mutación puntual en el codón 238 de la secuencia nucleotídica de esta enzima, dando origen a una BLEE18. Por otra parte, se comprobó que las cepas transconjugantes recibieron una BLEE, ya que todas ellas dieron positiva la prueba de sinergia con ácido clavulánico, recomendada por el NCCLS para la detección de este tipo de enzimas8,14.

En los casos en que el gen blaSHV no fue transferido (K. pneumoniae K283 y K295), éste correspondió al gen blaSHV-1, que tiene una ubicación cromosomal en la mayoría de las cepas de Klebsiella spp21.

Es importante destacar que la transferencia de los genes de ß-lactamasas se realizó a frecuencias de transferencia tan elevadas como 10-2 transconjugantes/célula receptora, especialmente hacia la

cepas de C freundii, lo que indicaría que el fenómeno de flujo de genes de resistencia entre las enterobacterias, es un evento que parece no ser ocasional entre las cepas hospitalarias. Además, se pudo observar que las cepas transconjugantes también recibieron genes que codifican enzimas modificantes de aminoglicósidos (datos no mostrados), hecho trascendental, ya que explicaría el origen de las cepas multirresistentes a los antibióticos a nivel hospitalario y la co-transferencia de resistencia a antibióticos ß-lactámicos y aminoglicósidos.

Los resultados obtenidos en este estudio nos permiten aportar una fuerte evidencia que apoya la transferencia horizontal de genes de resistencia desde cepas de K. pneumoniae aisladas de hospitales chilenos a otras cepas clínicas de enterobacterias, lo que contribuye a la diseminación de los genes que codifican las BLEE y, además, otros genes de resistencia a grupos de antibióticos diferentes de los ß-lactámicos.

 

REFERENCIAS

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Agradecimientos

Agradecemos a la señora Magda Hernández por su asistencia técnica, como también a los Laboratorios de Microbiología de los Hospitales Base de Lota, Base de Puerto Montt y Clínico Regional de Concepción, que gentilmente nos enviaron las cepas de K. pneumoniae utilizadas como dadoras en este trabajo y al Laboratorio de Diagnóstico Microbiológico del Departamento de Microbiología de la Universidad de Concepción por proporcionarnos las cepas de enterobacterias usadas como receptoras.

 

Correspondencia a: Helia Bello Toledo. Teléfono: 41 203237. Fax: 41 245975. Casilla 160-C. E mail: hbello@udec.cl

Recibido el 21 de abril, 2005. Aceptado el 20 de septiembre, 2005.

Trabajo financiado por proyectos FONDECYT #1980109 y #1020454.

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