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Revista médica de Chile

Print version ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile vol.135 no.11 Santiago Nov. 2007

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872007001100004 

 

Rev Méd Chile 2007; 135: 1388-1396

ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN

 

Epidemiología clínica y molecular de las infecciones por Shigella spp en niños de la Región Metropolitana durante el verano 2004-2005

Shigella spp Infections In children living In the Metropolitan Region, Chile, during summer of 2004-2005

 

Christopher Hamilton-West M1a, Valeria Prado J1, Juan Carlos Hormazábal O2, Rosanna Lagos Z3, Dona Benadof F4, Carmen Mendoza N5, Andrea Elgueta N6, Cecilia Tapia P7, Marcela C¡fuentes D8, Isabel Alvarez A9, Mariluz Hernández E1.

1Programa de Microbiología, Instituto de Ciencias Biomédicas (ICBM), Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Santiago, Chile. 2Instituto de Salud Pública, (ISP). 3Centro para Vacunas en Desarrollo Chile, (CVD-Chile). Hospitales 4Roberto del Río, 5Exequiel González Cortés, 6Félix Bulnes, 7San Juan de Dios, 8San Borja Arriarán, 9Luis Calvo Mackenna.
a
Médico Veterinario, Tesista del Programa de Magíster en Ciencias Agropecuarias, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Chile.

Dirección para correspondencia


Background: Shigella spp is a frequent cause of diarrhea in children. Antimicrobials decrease the duration of diarrhea and pathogen excretion. However, the increasing resistance limits their therapeutic value. Aim: To study Shigella serotype distribution in the Metropolitan Region in Chile, and its relationship with severity of disease, antimicrobial resistance pattern and clonality. Material and methods: During summer 2004-2005, stool samples from children with diarrhea were collected in Cary Blair transpon medium and cultured. Shigella isolates were serotyped using monoclonal and polyclonal commercial antibodies. In vitro activity of ampicillin, amoxicillin/clavulanic acid, chloramphenicol, cotrimoxazol, nalidixic acid, ciprofloxacin, ceftriaxone and azythromycin was determined by minimal inhibitory concentration (MIC). Clonality was studied by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) using Xbal as restriction enzyme. Results: One hundred thirty nine Shigella strains were isolated (77 S sonnei and 62 S flexneri). S sonnei and S flexneri 2a serotypes were responsible for 95% of episodes. Children aged 2-4 years, showed a greater incidence of Shigella infections and 77% of episodes were treated on an ambulatory basis. High resistance levels were observed for ampicillin, cotrimoxazole, amoxicillin-clavulanic acid and chloramphenicol (67%, 60%, 56% and 45%, respectively). We found 11 resistance patterns and 61,2% of strains were multiresistant. There were multiple clones without a strict relationship with resistance patterns. Conclusions: Shigella infections in Metropolitan Region in Chile are associated to a restricted number of serotypes, representing a clonal expansion associated to different antimicrobial resistant patterns.

(Key words: Anti-bacterial agents; Diarrhea, infantile; Shigella)


La shigellosis es reconocida por la Organización Mundial de la Salud como un problema importante de salud pública1,2. Anualmente ocurren 164,7 millones de episodios de diarrea y 600 mil muertes asociados a Shigella. Más de 90% de ellos ocurre en países en desarrollo, afectando principalmente a niños menores de 5 años3-5. En Chile, Shigella se asocia a 4%-12% de los casos de diarrea aguda y a 22%-30% de episodios de diarrea disentérica en menores de 5 años6,7.

Se han definido 41 tipos antigénicos de Shigella distribuidos en 4 especies (11 en S dysenteriae, 6 en S flexneri, 18 en Sboydii y 1 en Ssonnei). La inmunidad es serotipo específica8,9.

La shigellosis es endémica en países en desarrollo, con brotes estacionales en primavera-verano10,11. La transmisión es facilitada por la baja dosis infectante (100 a 200 bacterias), por condiciones ambientales y deficiente higiene personal12,13.

Las infecciones por Shigella en adultos son menos frecuentes, asociándose a estrecho contacto con niños infectados. Los homosexuales, portadores de VIH y las personas que viajan desde países industrializados a zonas menos desarrolladas tienen alto riesgo de desarrollar shigellosis 14,15.

La infección puede ser severa en niños, manifestándose como diarrea secretora o disentérica, con fiebre, tenesmo y compromiso neurológico. Sin tratamiento antibiótico efectivo, algunos pacientes desarrollan septicemia, neumonía o síndrome hemolítico urémico8,16-18. El tratamiento antimicrobiano adecuado, reduce el tiempo de excreción del patógeno, la duración de los síntomas y la incidencia de complicaciones1,19.

En los últimos años, el tratamiento de la shigellosis se ha visto dificultado por la emergencia de resistencia antimicrobiana17,19-22. Estudios previos han mostrado que cepas de Shigella exhibían niveles de resistencia de 87%, 76%, 73% y 52% para ampicilina, cotrimoxazol, tetraciclina y cloranfenicol, respectivamente. Estas cifras coinciden con estudios internacionales, señalando que el problema es mundial17,19-22.

Investigaciones anteriores en niños chilenos, mostraron que un número reducido de serotipos (S sonnei, S flexneri 2a, S flexneri 2b, y S flexneri 6) son responsables de 90% de los episodios de shigellosis, y que se mantienen relativamente estables en el tiempo10,23.

Además de la serotipificación antigénica, la subtipificación molecular de cepas de Shigella es un elemento valioso para caracterizar brotes epidémicos, determinar fuentes de infección y reconocer cepas particularmente virulentas24. El estudio del ácido desoxirribonucleico (ADN) cro-mosómico, mediante electroforesis en campo pulsátil (PFGE), es la técnica de tipificación molecular de referencia y permite analizar relaciones genéticas entre distintas cepas bacterianas2,25,26. Con el propósito de ampliar la información disponible sobre frecuencia y distribución de serotipos de Shigella circulantes en nuestro medio y actualizar la información sobre los patrones de resistencia antibiótica, durante el verano 2004-2005, desarrollamos un trabajo colaborativo con una red de laboratorios de hospitales del sector público. Otro objetivo fue analizar la similitud genética de las cepas de Shigella para determinar si la resistencia antimicrobiana es un fenómeno clonal o general.

MATERIAL Y MÉTODOS

Origen de las cepas. Se analizaron cepas de Shigella aisladas de pacientes menores de 10 años, con diarrea aguda, atendidos en los hospitales Roberto del Río, Exequiel González Cortés, Félix Bulnes, Luis Calvo Mackenna, San Borja Arriarán y San Juan de Dios, entre el 1 de noviembre de 2004 y el 30 de abril de 2005. Además se incluyeron cepas de pacientes ambulatorios atendidos en el Consultorio de Colina durante el mismo período. Se definió diarrea aguda como la evacuación intestinal de 3 o más deposiciones de consistencia alterada (líquidas, con mucus, sangre o pus) en un lapso de 24 h.

Obtención y procesamiento de las muestras de deposición. Muestras de deposición fresca fueron obtenidas directamente del pañal o por hisopado rectal, depositadas en medio de transporte Cary Blair, y trasladadas dentro de 2-4 h al laboratorio del hospital respectivo, o dentro de 8 h al Laboratorio de Enteropatógenos de la Facultad de Medicina, Universidad de Chile, en el caso de muestras del Consultorio Colina. Siguiendo los procedimientos microbiológicos estándar27, las muestras fueron sembradas en agar MacConkey, SS o XLD, e incubadas a 37eC en aerobiosis por 18-24 h. De cada placa se seleccionaron 3 colonias lactosa negativas con morfología sospechosa de Shigella. La identificación de especie se realizó mediante pruebas bioquímicas y serológicas (reacción de aglutinación en lámina), utilizando antisueros comerciales específicos (Probac, Sao Paulo, Brasil). En los pacientes en que se aisló Shigella spp se completó un formulario de datos clínico-demográficos.

Serotipificación, estudio de susceptibilidad a antimicrobianos y caracterización molecular de las cepas de Shigella. La serotipificación de las cepas detectadas en los hospitales se realizó en el Centro de Referencia de Enteropatógenos del Instituto de Salud Pública (ISP). Las cepas provenientes del Consultorio de Colina fueron tipificadas en el Laboratorio de Enteropatógenos de la Facultad de Medicina. Los serotipos de S flexneri fueron definidos utilizando un panel de anticuerpos policlonales, Denka Seiken y anticuerpos monoclonales específicos (Reagensia AB, Estocolmo, Suecia) respectivamente.

El estudio de susceptibilidad a antimicrobianos (CIM) se realizó mediante técnica de dilución en agar, frente a ampicilina, amoxi/clavulánico, clo-ranfenicol, cotrimoxazol, ácido nalidíxico, cipro-floxacina, ceftriaxona y azitromicina, siguiendo las recomendaciones del CLSI (ex NCCLS)28. Para azitromicina, arbitrariamente se fijó como valor de corte 8 ug/ml. Como controles se utilizaron las cepas Escherichia coli ATCC25922 y para azitromicina, Staphylococcus aureus ATCC25923. Con los resultados obtenidos se establecieron los patrones de resistencia de las cepas. Se definió como multirresistente, una cepa de Shigella con resistencia a 3 o más antimicrobianos. Cepas con sensibilidad intermedia fueron consideradas resistentes.

Para el estudio molecular se seleccionaron 15 cepas de Shigella sonneiy 11 de Shigella flexneri. Se utilizó la técnica de electroforesis en campo pulsátil (PFGE), y se realizó digestión del ADN con la enzima Xbal a 37eC30,31. Se utilizó un equipo CHEF DRIII System (BIORAD). El gel fue teñido con bromuro de etidio, la imagen fue capturada con el equipo GEL DOC 200 (BIORAD). Como marcador de peso molecular y para estabilizar la imagen se usó la cepa estándar Salmonella braenderup 1248. La presencia de clones se estableció aplicando el criterio UPGMA y el software Molecular Analyst (Fingerprinting Plus, version 1.12). Las cepas con similitud genética de 90% o más, fueron consideradas un mismo clon. Como cepas control se incluyeron las cepas ATCC12022B (S flexneri 2b) y CDC1120-66 (S sonnei.)

Se obtuvo aprobación ejecutiva del Comité de Ética de la investigación en seres humanos de la Facultad de Medicina para el estudio de cepas codificadas y anónimas.

Estadística. Se analizó la distribución de serotipos de Shigella según edad de los pacientes y nivel de atención requerido, mediante la prueba de Chi cuadrado para hipótesis de independencia29. El análisis de similitud genética de las 26 cepas seleccionadas se realizó considerando proporcio-nalmente las especies de Shigella.

RESULTADOS

Distribución de especies y serotipos. El estudio abarcó 139 cepas, incluyendo 77 Shigella sonneiy 62 Shigella flexneri. La distribución de los serotipos de S flexneri fue la siguiente: 55 cepas serotipo 2a, 3 cepas Ib, 2 cepas 3a, una cepa la y una cepa 4a. Los serotipos Ssonneiy Sflexneri 2a representaron el 95% de los aislamientos. Se observó diferencias en la distribución etárea según la especie. De los aislamientos de S sonnei, 15,6% provenía de pacientes menores de 2 años, en tanto que del total de las S flexneri, 33,9% fueron recuperadas en ese tramo etario (p < 0,05) Figura 1.


Figura 1. Distribución de cepas de S sonnei y S flexnerí aisladas en la Región Metropolitana durante el verano 2004-2005, según edad de los pacientes.

La frecuencia de diarrea con sangre también fue diferente según la especie. Este antecedente estuvo presente en 28,6% de los casos con aislamiento de S sonnei y en 43,5% de aquellos con Sflexneri (p < 0.05).

La proporción de pacientes que necesitó hospitalización fue significativamente mayor para S flexneri (25/62, 40,3%) que para S sonnei (18/72, 23,4%); (p < 0.05). No se observó asociación estadística entre característica de la diarrea (acuosa o disentérica) y el nivel de atención requerido (p > 0.05).

Susceptibilidad in vitro. Las 139 cepas estudiadas presentaron elevados niveles de resistencia frente a ampicilina (66,9%), cotrimoxazol (59,7%), amoxicilina-ácido clavulánico (56,1%) y cloranfenicol (45,3%). No se observaron cepas resistentes a ácido nalidíxico, ciprofloxacino ni ceftriáxona. Para azitromicina no existen valores de referencia oficiales, siendo éste el primer estudio nacional que incorpora este antimicrobiano. Considerando como valor de corte 8 ug/ml, se observó 67,6% de resistencia.

La actividad in vitro comparativa de los antimicrobianos estudiados, representada como CIM capaz de impedir el desarrollo de 50% y 90% de las cepas (CEVL0 y CIM™) se presentan en la Tabla 1 y Tabla 2, para Shigella sonnei y Shigella flexnerí, respectivamente.



El grupo de cepas de Shigella sonnei presentó altos porcentajes de resistencia frente ampicilina, cotrimoxazol y amoxicilina-ácido clavulánico (46,8%, 45,5% y 40,3%, respectivamente). El nivel de resistencia a cloranfenicol fue moderado (10,4%). Todas las cepas fueron sensibles a ácido nalidíxico, ciprofloxacino y ceftriaxona. Frente a azitromicina, 98,7% de las cepas fue resistente. Entre las cepas de Shigella ñexneríi se observó altos porcentajes de resistencia frente a ampicilina, cloranfenicol, cotrimoxazol y amoxicilina-ácido clavulánico (91,9%, 88,7%, 77,4% y 75,8%, respectivamente). No se encontraron cepas resistentes a ácido nalidíxico, ciprofloxacino ni ceftriaxona. Para azitromicina, la resistencia fue de 29,0%. En la Figura 2 se presentan comparativamente las tasas porcentuales de resistencia de ambas especies de Shigella; se observa que Shigella flexnerí presenta mayores porcentajes de resistencia para todos los antibióticos estudiados, excepto para azitromicina.


Figura 2. Niveles comparativos de resistencia frente a ocho antimicrobianos, de Shigella ñexneri y Shigella sonne, aisladas en la Región Metropolitana durante el verano 2004-2005.

Patrones de resistencia, según especie de Shigella. Al establecer los patrones de resistencia se excluyó a azitromicina, ya que se consideró un punto de corte arbitrario. De las 139 cepas de Shigella, 73,4% presentó resistencia a uno o más antimicrobianos, encontrándose 11 patrones distintos, 61,15% de las cepas presentó multirresistencia. En el grupo de Shigella sonnei, 55,8% presentó resistencia a uno o más antimicrobianos y 40,25% resultó ser multirresistente. En Shigella ñexneri 95,2% presentó resistencia única y 87,1% multirresistencia. Los diferentes patrones de resistencia se muestran en la Tabla 3.


Clonalidad de cepas de Shigella. Se estudiaron 11 cepas de S flexneri y 15 de S sonnei, con distintos perfiles de resistencia. El análisis genético mostró que las cepas de S flexneri no corresponden a una población clonal y se observan múltiples clones. Dentro de estos clones hay 2 estrechamente relacionados (con 3 cepas en cada uno), que muestran patrones de resistencia variados, incluyendo cepas sensibles y otras con diferentes determinantes de resistencia (Figuras 3 y 4).


Figura 3. Dendrograma de cepas de Sflexneri, asociado a patrón de resistencia (ampicilina (AMP), amoxicilina-ácido clavulánico (A_C), cloranfenicol (CAF), cotrimoxazol (SXT), multirresistentes (MR) y sensibles (S), verano 2004-2005.


  Figura 4. Fotografía del gel que contiene a las cepas de S flexnerí analizadas mediante PFGE. En la parte superior de la imagen está el número con que se identificó a cada cepa, la abreviación S.b, corresponde a una cepa de S braenderoup, que se usó para estabilizar la imagen y C corresponde a la cepa control S flexnerí ATCC 12022 B2b.

En la Figura 5 se muestra el análisis genético de las cepas de S sonnei. Existen múltiples clones y se visualizan 3 agrupaciones; en el grupo A se observan 2 poblaciones clónales estrechamente relacionadas entre sí (96% de similitud), pero con patrones de resistencia que no son idénticos. En el grupo B se agrupan cepas sensibles y en el grupo C, que incluye varios clones, se observan diversos patrones de resistencia.


Figura 5. Dendrograma de cepas de S sonnei, asociado a patrón de resistencia mostrado (ampicilina (AMP), amoxicilina-ácido clavulánico (A_C), cloranfenicol (CAF), cotrimoxazol (SXT), multirresistentes (MR) y sensibles (S), verano 2004-2005.

DISCUSIÓN

En América Latina, la epidemiología de la shigellosis se caracteriza por un amplio predominio de S flexneri, sin embargo, Chile se aparta de ese patrón y en diferentes estudios se ha observado una paridad en la incidencia de S flexneri y S sonnei3,6,17,23. Existe escasa información respecto de los serotipos circulantes de Shigella en Suda-mérica. Esta información es importante para el diseño y desarrollo de vacunas. En estudios previos realizados en la Región Metropolitana, hemos observado que sólo unos pocos serotipos son responsables de los episodios de shigello-sis10,23. El presente estudio, con una cobertura más amplia de población, que incluye pacientes de distintos servicios de salud de la Región Metropolitana, confirma los hallazgos anteriores y muestra un espectro incluso más reducido de serotipos circulantes, siendo S sonnei y S flexneri 2a responsables de 95% de los casos detectados en el periodo de estudio.

Tradicionalmente, los grupos etáreos más afectados por las infecciones por Shigella spp, son los niños preescolares, entre los 2 y 4 años6,7. En este estudio los aislamientos se agrupan en el segmento entre 4 y 6 años, pero con diferencias interesantes en la distribución por especie, observándose que S flexnerí se concentra en niños menores de 2 años y S sonnei en los niños de 4 a 6 años. Analizando las diferencias en patrones de resistencia, esta información es importante de considerar frente a la aproximación clínica empírica de un caso de dianea aguda; no tenemos una explicación para estas diferencias y el diseño de este estudio no permite esclarecerlo. También es interesante considerar esta distribución etárea en el momento de evaluar una vacuna contra shigellosis.

De los casos de dianea asociada a Shigella confirmados durante el periodo de estudio, la mayoría necesitó solamente atención ambulatoria y esto se aplica especialmente a los episodios asociados a S sonnei, que afectó principalmente a los niños mayores. Este antecedente sumado a los patrones de resistencia de las cepas de Shigella con un alto porcentaje de multirresistencia, indica la necesidad de ser muy racionales con el uso de antimicrobianos, considerando que en nuestro medio, la mayoría de los cuadros son de severidad moderada y autolimitados, que el éxito de los antimicrobianos será dudoso y puede contribuir a la selección de las cepas multinesistentes, por lo que el uso de antimicrobianos debe reservarse para las infecciones severas, en situación de un brote, o en pacientes inmunocomprometidos e idealmente conociendo la susceptibilidad antimicrobiana. Los cuadros graves, que requirieron hospitalización, se asociaron con mayor frecuencia a S flexnerí, especie que comparativamente muestra mayor resistencia, por lo cual se deben ajustar las pautas de tratamiento a los patrones de resistencia, lo que limita las opciones terapéuticas a ciprofloxacino, ceftriaxona o ácido nalidíxico, según nuestros resultados.

Otra opción terapéutica que se ha planteado es el uso de azitiomicina, la cual ha demostrado en estudios clínicos ser eficaz para el tratamiento de shigellosis32. Este antimicrobiano es interesante por tratarse de una familia diferente, sin resistencia cruzada con otras familias de antibióticos y por su farmacocinética, con altas concentraciones intracelulares y una vida media prolongada. Sin embargo, es difícil hacer recomendaciones mediante estudios in vitro, ya que no se cuenta con valores de corte para establecer la CIM que separe las poblaciones sensibles de las resistentes y permitir dar una orientación para el uso clínico. Se requiere de una correlación entre CIM y eficacia clínica para establecer un valor de corte.

Sin duda que los altos niveles de resistencia a antimicrobianos que exhiben las cepas de Shigella dificulta el manejo terapéutico en los casos más severos. Estudios de vigilancia de resistencia que hemos mantenido en algunas comunidades de nuestro país, como el área de Colina1, muestran niveles elevados y ascendentes de resistencia a los antibióticos recomendados y estos niveles se mantienen a pesar de discontinuar el uso de algunos de estos antibióticos. La estabilidad de estos genes de resistencia está dada por su ubicación en los llamados "cassettes de resistencia", que corresponden a agrupaciones de genes que se traspasan en conjunto y se integran al genoma bacteriano. Lo importante desde el punto de vista práctico es que la administración de cualquiera de los antibióticos incluidos en el cassette, para cualquier indicación, seleccionará esta secuencia y contribuirá a la selección y persistencia de estas cepas resistentes.

El estudio molecular reveló que durante el verano 2004-2005, de cada especie de Shigella circularon diferentes clones y que no hay asociación estricta entre clon y perfiles de resistencia. Por una parte, dentro de un clon se observan cepas con diferentes patrones de resistencia (Figura 3, grupo A) y por otro lado, cepas que comparten un mismo patrón de resistencia, no pertenecen al mismo clon (Figura 3). Esto podría explicarse porque algunos determinantes de resistencia se encuentran en plas-midios y ello no se visualiza mediante la técnica de PFGE que analiza el cromosoma bacteriano33,34.

Este estudio mostró que la shigellosis en la Región Metropolitana se asocia a la presencia de un reducido número de seroüpos, que se mantienen estables en los últimos años. Estos seroüpos, representan expansiones de diferentes clones, que incluyen cepas con variados patrones de resistencia. Esta información indica que es factible pensar en la prevención y control de la shigellosis, mediante el uso de vacunas dirigidas contra los seroüpos prevalentes.

Agradecimientos

A la Tecnólogo Médico, Sra. Alicia Ojeda, del Programa de Microbiología de la Facultad de Medicina, por la asesoría técnica en la serotipifica-ción de Shigella y al Dr. Jorge Fernández, de la Unidad de Desarrollo del ISP, por su asesoría en la realización de la técnica de PFGE.

 

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Recibido el 8 de enero, 2007. Aceptado el 15 de mayo, 2007.

Correspondencia a: Dra. Valeria Prado J. Av. Independencia 1027, Santiago. Fax: 56-2-735 5855- E mail: vprado@med.uchile.cl

 

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