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Revista médica de Chile

versão impressa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.136 n.3 Santiago mar. 2008

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872008000300009 

 

Rev Méd Chile 2008; 136: 338-346

ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN

 

Diseño y evaluación de una reacción de polimerasa en cadena (RPC) múltiple, para la identificación de bacterias causantes de meningitis aguda en líquido cefalorraquídeo de niños chilenos

Multiplex PCR assay in spinal fluid to identify simultaneously bacterial pathogens associated to acute bacterial meningitis in Chilean children

 

Marcelo Reyes S1, Juan Pablo Torres T2, Valeria Prado J1, Roberto Vidal A1a.

1Programa de Microbiología, Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Santiago de Chile.
2Servicio de Pediatría, Hospital Luis Calvo Mackenna.
a
Biólogo, Magíster en Ciencias, Doctor en Ciencias

Dirección para correspondencia


Background: Acute bacterial meningitis (ABM) is a serious disease that needs rapid diagnosis for an accurate treatment. The most important etiological agents are: Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis and Haemophilus influenzae type b. Overall pathogen detection rate in patients with ABM in Chile is 83%. Aim: To evaluate a Polymerase Chain Reaction (PCR) protocol for simultaneous detection of several pathogens in patients with ABM. Material and methods: We designed and evaluated a multiplex PCR protocol for simultaneous specific genes identifications of S pneumoniae (¡ytA and ply genes), N meningitidis (ctrA, crgA) and H influenzae (bexA) in cerebrospinal fluid (CSF) samples from pediatric patients with suspected diagnosis of ABM. Sensitivity, specificity and minimum detection levels of DNA were determined. Amplifications ofrDNA 16S gene was done to confirm extraction of bacterial DNA. Results: Ninety nine CSF samples were studied, 90 from children with fever and negative CSF culture, and 9 from ABM and positive culture patients. The PCR protocol had a sensitivity of 89%, specificity of 100%, positive predictive value 100% and negative predictive value 99%. Conclusions: We observed a high concordance (89%) between bacteriological cultures and the PCR protocol results. This diagnostic tool could increase identification of agents in specific settings such as patients previously treated with antibiotics.

(Key words: Hemophilus influenzae; Meningitis, bacterial; Meningitis, Streptococcus pneumoniae; Neisseria meningitidis; Polymerase chain reaction)


La meningitis bacteriana aguda (MBA) constituye una patología grave en población pediátrica y adulta1-6. El rápido inicio del cuadro y sus consecuencias potencialmente letales determinan la necesidad de un diagnóstico etiológico rápido y específico para un tratamiento adecuado, lo que incide en el pronóstico del paciente.

El principal grupo afectado son los menores de 5 años, con una tasa de letalidad variable entre 2% y 20%, observándose secuelas neurológicas en rangos entre 12% y 15%. Los principales agentes etiológicos bacterianos en la población pediátrica son: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae tipo b1-6. Sin embargo, con la introducción de la vacuna conjugada contra H influenzae tipo b, se ha observado una dramática reducción en la incidencia de las infecciones invasivas por este patógeno, incluyendo MBA6-8. En contraste, la pre valencia de MBA debida a Nmeningitidis se ha mantenido elevada, principalmente en países subdesarrollados ubicados en el "Cinturón de Meningitis" del África Sub-Sahariana, donde se presenta de forma endémica, asociada a epidemias estacionales (tasas de 500-1.000/100.000 habitantes)9,10.

En relación al diagnóstico etiológico de MBA, se han descrito problemas con las técnicas utilizadas, como la disminución de la sensibilidad de la tinción de Gram y de la aglutinación con látex11,12, en pacientes que han recibido antimicrobianos previo a la toma de muestra de líquido cefalorraquídeo (LCR), lo que se asocia a resultados falsamente negativos en los cultivos microbio-lógicos tradicionales14, sumado al crecimiento fastidioso de estos patógenos en los medios de cultivo disponibles11-15.

Lo anterior ha estimulado la evaluación de técnicas de diagnóstico alternativas, como las técnicas moleculares, para mejorar la detección de agentes responsables de esta patología9-11,16-21. A nivel internacional, se ha utilizado la reacción de polimerasa en cadena (RPC), tanto simple como múltiple, para detectar genes conservados en las cepas causantes de meningitis, como el gen ply17,19,20 y JytA9,18,25 de S pneumoniae, el gen crgA9,23,24 y ctrA18,22 de N meningitidis, y el gen bexA9,17-19,26,27 de H influenzae capsulado, entre otros.

En Chile, la incidencia de MBA es de 6,0/100.000 menores de 5 años, siendo Nmeningitidis, Spneumoniae y H influenzae tipo b, los principales agentes etiológicos identificados28-31. La tasa de confirmación global de MBA en población pediátrica en Santiago de Chile alcanza a 83%28.

El objetivo de este trabajo fue diseñar, estandarizar y evaluar un protocolo de RPC múltiple para la identificación simultánea de S pneumoniae, N meningitidis y H influenzae capsulado, en muestras de LCR de pacientes pediátricos con sospecha clínica de meningitis bacteriana.

Material y métodos

Muestras clínicas. Se incluyeron en el estudio niños con sospecha clínica de MBA y con indicación de obtención de muestra de LCR.

Se invitaron a participar pacientes que consultaron en los hospitales Luis Calvo Mackenna, Exequiel González Cortés y Roberto del Río, entre junio y diciembre de 2005. El diagnóstico clínico de meningitis bacteriana se basó en los siguientes criterios: presencia de fiebre (t°3 axilar ≥ 38eC) asociado a dos o más síntomas y signos de irritación meníngea, como rigidez de cuello, cefalea, vómitos, irritabilidad, rechazo alimentario, alteración del sueño y convulsiones o síndrome febril en estudio. Se consideró síndrome febril la presencia de fiebre (t°3 axilar ≥ 38eC) sin foco clínico demostrable. Se obtuvo el consentimiento informado de los padres o tutores legales de los pacientes, para al análisis de la muestra de LCR mediante el protocolo de RPC múltiple.

Se recolectaron 99 muestras clínicas de LCR obtenidas de 90 pacientes menores de 5 años, en los hospitales participantes. Estas muestras fueron mantenidas congeladas a -20eC, por plazos variables entre junio de 2005 y febrero de 2006, hasta su procesamiento.

El protocolo y el documento de consentimiento informado fueron aprobados por el Comité de Ética de la Investigación en Seres Humanos de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile, por el Comité Ético-Científico del Hospital Luis Calvo Mackenna y por el Comité Ético Científico del Servicio de Salud Metropolitano Sur.

Diseño de partidores. Se diseñaron partidores específicos para los genes lytA y ply de S pneumoniae, crgA y ctrA de N meningitidis y bexA de H influenzae capsulado, empleando las secuencias depositadas en el servidor GenBank® (Tabla 1).


Se utilizó el software GeneDoc® para su alineamiento y el software Primer3®, para el diseño de los partidores. Las características de los partidores se describen en la Tabla 2.


Cepas de referencia. Se utilizó como control positivo cepas ATCC de S pneumoniae (49619), N meningitidis (13090) y H influenzae tipo b (10211) aportadas por el Instituto de Salud Pública de Chile.

Para establecer la especificidad de los partidores diseñados, se analizaron cepas ATCC y de muestras clínicas (algunas causantes de MBA), de las siguientes especies: B abortus, E coli, Ssonnei, L monocytogenes, S aureus, E faecalis, Kpneumoniae, S typhimurium y S agalactiae.

Detección genes de virulencia. Se extrajo el ADN bacteriano de las muestras clínicas utilizando el kit ChargeSwitch® gDNA Mini Bacteria Kit, Invitro-gen® (Invitrogen, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante. En todas las muestras se amplificó el gen rADN l6S bacteriano con partidores universales32, para confirmar la extracción correcta del material genético.

Una vez extraído el ADN, se aplicó el protocolo de RPC múltiple para detectar simultáneamente los genes lytA, ply, crgA, ctrA y bexA. Cada reacción de RPC múltiple se realizó en un volumen final de 25 µl, el que contenía 0,5 mM de una mezcla de deoxynucleótidos trifosfato, 0,2 pM de cada partidor, 0,5 mM de MgCl2, tampón de reacción 10X (10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl), 0,625 U de Taq ADN polimerasa y 1,5 µl de ADN extraído como templado. Se utilizó la técnica de Hot Start para evitar amplificaciones inespecíficas (13,5 µl de la mezcla de reacción fue calentada hasta 95eC por 3 min y posteriormente se agregó la Taq ADN polimerasa 0,625 U en 10 µl de la mezcla de reacción). Se empleó en todas las reacciones, un control negativo con todos los elementos de la reacción de amplificación, sin ADN.

Para estandarizar el protocolo de RPC múltiple, los partidores se adicionaron en forma progresiva, evaluando distintas combinaciones de tiempos y temperaturas de alineamiento, así como también diferentes concentraciones de partidores.

Las muestras fueron amplificadas por 35 ciclos, utilizando un termociclador MyCycler Thermal-cycler (Biorad, USA). Cada ciclo consistió en las siguientes etapas: 1,5 min a 94oC; 1 min a 60oC; 1 min a 72oC y una extensión final de 10 min a 72oC. Los productos fueron separados en geles de agarosa al 1,5%, teñidos con bromuro de etidio (0,5 µg/ml) y visualizados en transiluminador de luz UV.

En las muestras de LCR en que se aisló TV meningitidis, se aplicó posteriormente el protocolo de RPC descrito por Taha y cols para subtipificación capsular23.

Para determinar la sensibilidad del protocolo de RPC múltiple, se realizaron diluciones seriadas de ADN de cada una de las cepas de referencia ATCC en agua estéril, desde 0,75 µg/ml hasta 0,75 pg/ml, para establecer el nivel mínimo de detección de ADN para cada bacteria. Estos niveles mínimos fueron de 7,5 pg/ml para H influenzae tipo b, 7,5 pg/ml para Nmeningitidis y 750 pg/ml para S pneumoniae.

Resultados

Del total de 99 muestras estudiadas, 9 correspondieron a niños con diagnóstico clínico de MBA y en todas ellas se aislaron bacterias patógenas en el cultivo de LCR; 90 muestras fueron obtenidas de niños con síndrome febril cuyo cultivo bacteriológico fue negativo. Las características cito lógicas y bioquímicas de las muestras de LCR en los casos de MBA con cultivo positivo fueron: Leucocitos 3637,28 ± 5734,6 células/mm3, PMN 79 ± 37,1% proteínas 96,9 ± 43,35 mg/dl, glucorraquia 18,3 ± 26,2 mg/dl y las características de las muestras de LCR con cultivo negativo fueron: Leucocitos 57,4 ± 288,1 células/mm3, PMN 9,6 ± 20,2 proteínas 45,1 ± 29,2 mg/dl y glucorraquia 58,9 ± 35,6 mg/dl). Las características de las cepas aisladas se describen en las Tabla 3.


Se observó 100% de especificidad para los partidores diseñados. Los tamaños de los productos amplificados para los genes lytA, ply crgA, ctrA y bexK fueron 168, 795, 393, 306 y 606 pb respectivamente (Tabla 2, Figura 1). Dichos productos fueron secuenciados y confirmados, en la etapa de estandarización del protocolo. (Servicio de secuenciación Cellygent Ltda.,USA).


De las 9 muestras clínicas con cultivo positivo analizadas, 8 mostraron amplificación del gen rADN l6S luego de la extracción del material genético bacteriano. En una muestra, en la cual se aisló simultáneamente H. influenzae tipo b y S. pneumoniae, no se amplificó el gen rADN l6S. (Tabla 3). En este caso, la extracción del material genético y la amplificación del gen rADN l6S se realizó en duplicado, con resultados negativos. Las 90 muestras con cultivo negativo no mostraron amplificación del gen rADN l6S. Al aplicar el protocolo de RPC múltiple a las 9 muestras con cultivo positivo, se identificó el agente en 8 de 9 muestras (89%), siendo este resultado consistente con el cultivo bacteriano. En una muestra no se obtuvo amplificado (la misma en la que no se amplificó el gen rADN l6S), en experimentos por duplicado (Figura 2). Tanto para la amplificación del gen rADN l6S, como para la aplicación del protocolo de RPC múltiple, los respectivos controles positivos y negativos funcionaron conectamente.


Se aislaron 5 cepas de TV. meningitidis, las que fueron sometidas al protocolo de RPC múltiple para la identificación del tipo capsular, descrito por Taha y cols23. Este protocolo identifica 5 tipos capsulares (A, B, C, Y, W135) en base a la detección del gen síaD que permite identificar los tipos capsulares B, C, Y y W135 y del gen myrB, para el tipo capsular A. Se confirmó el tipo capsular en las muestras analizadas, siendo consistente con el resultado obtenido mediante la aglutinación con látex para identificación capsular. Una de las muestras (Tabla 3), presentó una reacción débil por aglutinación con látex, para los grupos C y W135, la que finalmente fue identificada como grupo W135 por el protocolo de RPC múltiple descrito.

Fueron analizadas las variables de eficiencia de este protocolo, el que demostró poseer una sensibilidad del 89% (CI 95% 68-109%), especificidad 100% (CI 95%), valor predictivo positivo (VPP) 100% (CI 95%) y valor predictivo negativo (VPN) 99% (CI 95% 97-101%) (Tabla 4).


Discusión

El presente trabajo consistió en la evaluación de un protocolo de RPC múltiple para la identificación de agentes bacterianos causantes de MBA en población pediátrica en Chile. La incorporación de partidores para dos genes que identifican S pneu-moniae (JytA, ply) y Nmeningitidis (crgA y ctrA) y un gen para H influenzae (bexA), marca una diferencia con respecto a otros protocolos de RPC múltiple diseñados a nivel internacional9,10,17,18, en donde se amplifica un solo gen para la identificación bacteriana. Nuestro protocolo aumenta las probabilidades de detectar la presencia de estas bacterias y aumenta también la certeza en la identificación, disminuyendo posibles falsos positivos y falsos negativos. Estarían cubiertas cepas atípicas de S pneumoniae33,34 y se evitarían los problemas de especificidad observados al usar sólo un gen para TV meningitidis18. A lo anterior se agrega el hecho del diseño de los partidores para cada uno de los genes blancos, realizados en este estudio, a diferencia de lo descrito en la literatura9,10,17,18. En este trabajo todos los partidores utilizados fueron específicamente diseñados, e incluyeron las secuencias completas de todas las variantes génicas descritas para cada uno de los genes estudiados (considerando la alta variabilidad génica que caracterizan a las cepas de H influenzae y TV meningitidis). Se tuvo especial cuidado en el diseño de extremo 3' del partidor del gen bexA, generando uno con elevado número de bases nucleotídicas complementarias con la secuencia consenso, a diferencia de los descritos en la literatura26 que tienen una menor complementariedad de bases en esta zona, como fue confirmado por medio del software Genedoc® (dato no mostrado). Esta región del partidor es fundamental para asegurar la eficiencia de la polimerización, lo que optimizó la detección de ADN (7,5 pg/ml este estudio) en relación a lo descrito en literatura, (75 pg/ml), lo que es una fortaleza de nuestra técnica; además, en el caso del gen ctrA se diseñaron partidores que tuvieran complementariedad de bases con la secuencia ubicada más hacia el extremo 3' del gen, que está más conservado entre las cepas patógenas, a diferencia del extremo 5' más variable, lo que mejoró nuestro nivel de detección de ADN en relación a lo descrito17.

Los partidores diseñados demostraron poseer una alta especificidad (100%) y una adecuada sensibilidad al evaluar los niveles mínimos de detección. Si bien el valor de detección de ADN para Spneumoniae es más elevado que lo descrito en la literatura9,10,16-20, éste equivale a aproximadamente 3x104 UFC/ml, lo que determina niveles de detección de ADN en LCR clínicamente aceptables si consideramos que sobre 85% de las MBA cursan con elevados recuentos bacterianos en LCR, sobre 103 UFC/ml13,15. Los niveles mínimos de detección de ADN para Nmeningitidisy H influenzae capsulado, están dentro de los descritos en la literatura7-10.

A nuestro juicio, creemos que la ausencia de amplificación en una muestra de LCR con cultivo positivo, tanto para el gen rADN l6S como para el protocolo de RPC múltiple, no se relaciona con una inhibición de la reacción de RPC, debido al correcto funcionamiento de los controles en la reacción. Una posible explicación para esta situación sería una eventual degradación del material genético en esta muestra, debido al prolongado tiempo de almacenamiento a -20oC de la misma, (ocurrieron 8 meses entre la recolección de la muestra y su análisis con el protocolo de RPC múltiple). Sabemos que la temperatura óptima para conservar ADN por tiempos prolongados es -80oC. El periodo de almacenamiento de las muestras puede afectar la sensibilidad de la RPC, especialmente si la carga bacteriana presente es baja, como podría ser el caso de esta muestra, pero esta técnica diagnóstica está diseñada para su uso en la práctica clínica, por lo tanto las muestras deben ser procesadas de inmediato.

Una cepa de TV meningitidis mostró resultados poco claros con la aglutinación con látex (positiva para dos tipos capsulares), y se confirmó como grupo W135 por el protocolo de RPC múltiple. Esto muestra algunos problemas de la técnica de aglutinación en látex y deja de manifiesto la necesidad de contar con métodos de diagnóstico alternativos como son las técnicas de diagnóstico molecular, para identificar con mayor precisión los tipos capsulares de las cepas aisladas.

Finalmente, creemos que es fundamental aplicar este protocolo a un mayor número de muestras clínicas de LCR, especialmente muestras provenientes de pacientes con sospecha clínica de MBA pero con cultivo bacteriano negativo y con alteraciones citológicas o bioquímicas del LCR compatibles con MBA, situación en la que un protocolo de estas características podría demostrar superioridad con respecto del cultivo tradicional, contribuyendo a un mejor diagnóstico etiológico y a un mejor manejo de la MBA en niños.

Agradecimientos

Agradecemos la colaboración de los Jefes y profesionales de los laboratorios de Microbiología de los hospitales participantes.

 

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Recibido el 18 de julio, 2007. Aceptado el 12 de octubre, 2007.

Trabajo financiado por "Fundación para Estudios Clínicos", Laboratorio Saval. El Laboratorio Saval no tuvo ingerencia en la discusión de los resultados de este estudio y no existen conflictos de intereses; el tema de este artículo no se relaciona de manera alguna con los intereses comerciales de Saval y ninguno de los autores tiene un vínculo con dicha empresa.

Correspondencia a: Dra. Valeria Prado J. Programa Microbiología, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. Fono 56-2-978 6641. Fax: 56-2- 735 5855. E mail: vprado@med.uchile.cl

 

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