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Revista médica de Chile

versão impressa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.136 n.6 Santiago jun. 2008

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872008000600007 

 

Rev Méd Chile 2008; 136: 733-740

Artículos de Investigación

 

Banco de tumores en Chile, su aporte a la investigación: resultados de un proyecto piloto

A pilot experience with a tumor bank

 

Iván Roa E1,2, Carmen G Artigas A3.

1Servicio Anatomía Patológica Clínica Alemana de Santiago. Facultad de Medicina Universidad del Desarrollo. 2Departamento de Anatomía Patológica. Facultad de Medicina. Universidad de la Frontera. 3Servicio Anatomía Patológica Clínica Alemana de Temuco.

Dirección para correspondencia


Background: Despite having the technical facilities and the knowledge, Chile did not have a tumor bank until recently. Aim: To describe the results of the first three years of a tumor bank. Material and methods: All cases stored in a tumor bank from June 2004 tojune 2007 were included. Samples were frozen in isopentane, afterwards in liquid nitrogen and finally transferred to freezers at -80°C. Quality controls with DNA and RNA extraction and immunohistochemistry, were per formed. Results: In the study period, 1239 cases were collected and 79% were malignant tumors. In 78% of cases, samples from the tumor and of normal neighaboring tissue, were stored. Twenty six percent of samples were from breast cáncer and 22% for digestive tumors. Immunohistochemical expression ofvimentin was measured in 30 cases and the expression of Ki67 an p53 in 20 cases. Thirteen of 15 breast cáncer samples had expression of estrogen receptors. In 30 cases, DNA and RNA extraction was carried out, amplifying B-globin and B-actin. Moreover RNA was extracted from 63 gastríc cáncer, 30 colon cáncer and gallbladder cáncer samples, for specific projects. Conclusions: The creation of a tumor bank is feasible, preserving samples ofhigh biológical quality.

(Key words: Breast neoplasms; Cryopreservation; Human tumour banking; Tissue banks)


Desde hace años se desarrollan metodologías para la conservación de células, tejidos y fluidos, para su posterior utilización en diagnóstico e investigación1,2. Esta metodología se basa esencialmente en la conservación de tejidos a través de la utilización de sencillas técnicas de criopreservación3,4. También han sido descritas metodologías más complejas capaces, no sólo de mantener gametos, células y tejidos por largos períodos de tiempo en condiciones de congelación, sino que su posterior reanimación con todo su potencial genético y funcional5-7. En la actualidad, novedosas técnicas como la vitrificación de células y tejidos, así como la incorporación de criopreservantes han mejorando sustancialmente la viabilidad celular posterior a la congelación8,9. En nuestro país, específicamente en el área de los tumores malignos, no se han desarrollado bancos de tumores (BT), a pesar de existir las condiciones y el conocimiento para estos propósitos. En nuestro medio, algunos proyectos de investigación han contemplado la obtención y manutención de este tipo de muestras congeladas a bajas temperaturas con el objeto de aplicar técnicas de biología molecular10,11, sin embargo, el término del proyecto frecuentemente llevaba consigo el término de las actividades de criopre-servación.

En la mayor parte de los departamentos de Anatomía Patológica, los remanentes de tejidos normales y tumorales, posterior al estudio anato-mopatológico son eliminados y una gran cantidad de material de alta calidad biológica se desecha, imposibilitando la realización de estudios, además de limitar la obtención de casuísticas que permitan obtener conclusiones estadísticamente válidas y competitivas en el ámbito de la investigación. Tampoco ha existido una política encaminada a la creación y desarrollo de BT en nuestro país, lo que ha traído consigo una limitación para la generación de estudios, desarrollo de proyectos y cooperación entre grupos de investigadores.

Inicialmente, en el estudio de las enfermedades neoplásicas a nivel genético-molecular, la determinación de las alteraciones estructurales del ADN (genómica) fueron el objetivo principal12-13, posteriormente el concepto de funcionalidad del gen y su expresión cobró mayor importancia, lo cual requiere mejorar las condiciones de obtención, procesamiento y conservación de las muestras con el objeto de obtener ARN, especialmente ARNm. La incorporación de nuevas metodologías enfocadas al estudio y caracterización funcional del producto o proteómica, y recientemente la metabonómica, han aumentado aún más las restricciones respecto de las condiciones que requieren las muestras para este tipo de estudios14-17. En este proceso, no sólo es importante la obtención de los casos, sino además, el control de todas aquellas etapas y procesos que determinan la calidad estructural y funcional de las muestras18-19.

La calidad de las muestras de un BT guarda relación con una serie de factores entre los cuales podemos mencionar: la rapidez en la obtención de la muestra, el período de prefijación, el período de isquemia desde la oclusión de los pedículos vasculares hasta la extracción del órgano y factores ambientales tales como temperatura, pH, drogas utilizadas en el paciente y anestésicos, etc.20. La representatividad de los fragmentos almacenados también es un aspecto fundamental, así como la no contaminación de los tejidos que serán utilizados como controles, por lo que el rol del patólogo es fundamental en esta etapa12,13,21.

Aun cuando en nuestro Departamento se ha utilizado la conservación de tejidos normales y tumorales mediante congelación desde hace más de una década en los distintos proyectos de investigación, en junio de 2004 se creó oficialmente el BT en la ciudad de Temuco con la participación de la Unidad de Anatomía Patológica del Hospital Hernán Henrí-quez Aravena, Departamento de Anatomía Patológica Universidad de La Frontera y Clínica Alemana de Temuco, haciéndose extensiva posteriormente a Clínica Alemana de Santiago. Para esta nueva estructura se requirió definir bases técnicas, administrativas, protocolos, sistemas de control de calidad, etc. Los estándares de procesamiento y controles de calidad se basaron en los protocolos utilizados en los Bancos de Tumores del MD Anderson en Houston y en la Red de Bancos de Tumores de España dependiente del Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas22, con algunas modificaciones.

El objetivo de este trabajo es mostrar los resultados obtenidos en los tres primeros años de funcionamiento del BT, así como de los sistemas de control implementados para el aseguramiento de la calidad de las muestras.

MATERIAL Y MÉTODO

Casos. Se incluyeron todos los casos almacenados en el BT desde junio de 2004 hasta junio de 2007, de acuerdo al siguiente protocolo: de cada pieza quirúrgica oncológica obtenida en fresco se tomaron muestras del tumor y, en los casos en que fue posible del tejido adyacente sin tumor (control). Del tumor se obtuvo 5 muestras de 0,5 CC (2 en OCT™, 2 en RNA-later™ y 1 sin aditivos). Una cantidad similar de muestras se tomaron de los tejidos no tumorales del mismo caso, para ser utilizados como controles. Adicionalmente se tomaron muestras para estudio histológico e inmunohistoquímico que fueron fijadas en formalina zinc tamponada.

Protocolo de procesamiento. Las muestras fueron colocadas en criotubos, identificados y sometidos a congelación en isopentano a -50°C por 2 min y sumergidas en nitrógeno líquido (196°C), por un período de dos semanas. Los criotubos fueron traspasados a cajas de congelación identificadas individualmente con un sistema de coordenadas y almacenadas hasta su utilización en congeladores de -80°C (freezer de baja temperatura).

Control de calidad tiempo/conservación. Como tiempo máximo aceptable desde la extracción quirúrgica hasta la congelación, se consideró de 2 h para la obtención ADN y de 30 min para ARN y proteínas. Posterior a ese tiempo, las muestras fueron consideradas no aptas para el BT.

Control de calidad tejido/diagnóstico. En todos los casos se obtuvo además muestra para estudio histológico durante la biopsia intraoperatoria, a fin de asegurar la presencia de tumor en las muestras seleccionadas. También, se tomó una muestra del mismo sitio que fue procesada para estudio histológico convencional e inmunohistoquímica.

Control de calidad del almacenamiento. El control de la integridad de las muestras, se realizó en forma periódica y aleatoria mediante extracción de ADN y ARN, así como la amplificación de productos del gen de la ß-globina (ADN) y de la ß-actina (ARN)24,2 . La antigenicidad se controló mediante estudio inmunohistoquímico con los siguientes anticuerpos (vimentina, Ki67, p53 y receptores nucleares de estrógenos para el tejido mamario). De acuerdo a recomendaciones18, una de cada veinte de las primeras 500 muestras almacenadas en el BT fue procesada como control de calidad, a fin de objetivar las características y resultados obtenidos con el material almacenado.

Extracción ADN. La extracción se realizó mediante el faTGenomic Puregene, (Centra, USA) de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Se utilizó 7 cortes de 12 mieras de tejido congelado, se agregó buffer de digestión (TRIS 0.01M pH 7,8 EDTA 0.005M, SDS 0,5%) y proteinasa-K 10 mg/ mL, hasta digestión completa del tejido. El ADN fue precipitado con isopropanol, lavado con eta-nol 70% y resuspendido en solución tampón TE pH 7,4 (10 mM Tris.Cl, lmM EDTA pH 8,0).

Amplificación de ADN. Se realizó PCR simple con un par de iniciadores del gen de la ß-globina humana23. Los productos de la amplificación de la ß-globina fueron de 268, 536 y 986 pb, visualizados por electroforesis en geles de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio.

Extracción ARN. Se utilizó la misma cantidad de muestra que la utilizada para extraer ADN. El tejido obtenido fue suspendido en trizol (Life Technology, USA) y homogenizado mecánicamente. Después de la precipitación del ARN, fue resuspendido en agua tratada con dietilipirocarbo-nato (DEPC). Para la cuantificación del ARN se utilizó un espectofotómetro GeneQuant (Amers-ham, USA) y visualizado en geles de agarosa.

RT-PCR. Para la obtención de c-ADN, se realizó reacción con transcriptasa reversa M-MLV (Invitrogen, USA). Como control interno se utilizó un par de iniciadores del gen de la ß-actina. Los segmentos amplificados de 838 pb fueron visualizados en geles de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio.

Técnica de inmunohistoquímica. Se realizó la técnica estándar de streptavidina-biotina para tejidos fijados en formalina e incluidos en parafina y para tejidos congelados. Los anticuerpos utilizados fueron: vimentina clon V9 (Dako), antígeno Ki-67 (Dako), p53 (Novocastra) y para las muestras de tejido mamario determinación del receptor de estrógenos (Novocastra).

Control de calidad de la información. Se revisó la información contenida en las solicitudes de biop-sias, la que fue confirmada a través de la revisión de las fichas clínicas. A todas las muestras se les asignó un número identificador en una base de datos sin la identificación del paciente, para mantener el anonimato de las muestras almacenadas en el BT. A este registro se incorporó la siguiente información: diagnóstico clínico, diagnóstico anatomopatológico completo (diagnóstico histológico, grado de diferenciación histológica, nivel de infiltración, tamaño tumoral, presencia de metástasis, etc.).

Consentimiento informado. En todos los casos en que fue posible se solicitó el consentimiento informado a los pacientes o sus representantes legales, cuyos textos habían sido aprobados por los respectivos Comités de Ética de las instituciones participantes (Servicio Salud Araucanía Sur y Clínicas Alemanas), destacándose que sólo se puede recolectar para el BT los excedentes de tejidos, posterior al establecimiento del diagnóstico histológico definitivo o sus exámenes complementarios.

Seguimiento de pacientes. Se realizó seguimiento de todos los pacientes a través de la revisión de las fichas clínicas, controles clínicos de los pacientes y a través del registro civil e identificación.

RESULTADOS

Resultados generales. Las características de los casos almacenados en el BT entre 2004 y 2007 se resumen en la Tabla 1. De un total de 1.239 casos, 79% correspondieron a tumores malignos, de los cuales, alrededor de 15% ya habían fallecido en este corto período de seguimiento. En 78% de los casos fue posible obtener muestras tanto del tumor como del tejido macroscópicamente no tumoral como control. En los casos restantes, las muestras estaban constituidas exclusivamente por tumor.


En la Figura 1 se resume la distribución de los distintos tejidos tumorales almacenados en el BT. Se destaca la mayor facilidad para obtener muestras del sistema genital femenino, en donde aproximadamente 26% de las muestras corresponden a tejido glandular mamario y, si a esto se le suma ovario, endometrio y cuello uetrino, este porcentaje se eleva a 38% del total de las muestras del BT. En segunda frecuencia (22%), le siguen los tumores del tubo digestivo, los que a pesar de tener una mayor incidencia en nuestro medio, su obtención presenta un mayor grado de dificultad. Esta particular distribución de las muestras parece guardar relación con el empleo más difundido de la biopsia intraoperatoria en la resolución de la patología quirúrgica oncológica mamaria, ya que este tipo de muestras son enviadas de inmediato al Servicio de Anatomía Patológica, facilitando su obtención.


Control de calidad expresión inmunohistoquímica. Los tejidos procesados para control de calidad se resumen en la Tabla 2. Diecisiete casos eran de tejido mamario, todos con el diagnóstico de carcinoma ductal infiltrante y los restantes correspondieron a una amplia variedad de tejidos como ganglio linfático, testículo, tiroides, pulmón, etc.


En todos los casos se realizaron cortes para estudio histológico convencional, así como cortes de congelación en criostato, con el objeto de demostrar la presencia de tejido tumoral en las muestras almacenadas previo a su procesamiento. En todos ellos se realizó estudio inmunohistoquímico para vlmentlna, resultando positiva en la totalidad de los casos (Figura 2). En 20 casos se determinó la expresión del antígeno de proliferación celular Ki67 y del gen supresor tumores p53, cuyos resultados fueron variables, dependiendo del tipo tumoral, siendo la mayor parte de ellos positivos. En 15 de los diecisiete cánceres de la mama, se realizó la determinación de receptores de estrógenos, resultando intensamente positivas en 13 de ellos.


Control de calidad ADN/ARN. En todos los casos se realizó extracción de ADN tanto del control como del tejido tumoral (Tabla 2). Inicialmente se realizó la amplificación del gen de la ß-globina en 10 casos, observándose bandas de amplificación de productos tanto de 268 pb como 986 pb. En consideración a estos resultados se decidió continuar sólo con la extracción y amplificación de ARN, ya que las condiciones que se requieren para la obtención de ARN son de mayor exigencia. Para este propósito se realizó RT-PCR y posterior amplificación de un fragmento del gen de la ß-actina, observándose bandas intensas en la electroforesis en 29 de los 30 casos con amplicones de 540 pb y 838 pb (Figura 3). Sólo un caso resultó negativo, por lo cual se aumentó la cantidad de muestra en el proceso de extracción y cuya repetición fue positiva. Las diferencias observadas en las distintas concentraciones de ADN y ARN, guardó relación con los distintos tipos de tejidos. Así, los tejidos tumorales de carácter medular con abundantes células tumorales y escaso estroma aportan significativamente más que los tumores escirrosos en los que predomina el estroma. Como control de calidad también se utilizó la información obtenida de los casos que han sido utilizados en proyectos de investigación específicos (cáncer gástrico n =63; cáncer de colon n =30), en los cuales se realizaron técnicas de extracción de ARN y en los que se obtuvo el producto requerido. Entre los resultados del BT, también podemos mencionar la participación en proyectos de investigación, tesis de magíster y doctorados, la creación de una página web (www.bancodetumores.cl) y el apoyo a la creación de otros BT como el BT del Hospital de San Felipe.


DISCUSIÓN

Se muestran los resultados obtenidos en el ejercicio del BT en un período inicial de tres años. Se debe destacar que la mayor dificultad observada guarda relación con la estandarización de los procesos y, por sobre todo, la obtención del consentimiento informado. El tiempo que se requiere para contactar a los pacientes, informarlos y solicitar la donación de los tejidos remanentes de su biopsia, se puede transformar en una tarea a veces muy difícil de lograr.

Desde el punto de vista técnico, nuestros resultados muestran que es posible lograr el almacenamiento de una gran cantidad de tejidos tumorales y sus respectivos controles en períodos relativamente cortos de tiempo. Esto se basa casi exclusivamente en dos elementos que a nuestro juicio deben estar presentes desde el inicio del funcionamiento del BT y son: la participación y compromiso de los patólogos y la presencia de un tecnólogo médico dedicado a procesar las muestras en forma inmediata.

Uno de los puntos importantes guarda relación con la calidad de las muestras, por lo cual, el control de todas las etapas y procesos desde la obtención hasta su utilización final, permiten asegurarle al investigador que las muestras responderán a sus expectativas26,27. Nuestros resultados muestran un alto grado de conservación estructural y funcional del ADN, ARN, así como de su inmunorreactividad. No logramos demostrar algún efecto deletéreo significativo relacionado con el tiempo de almacenamiento al comparar los resultados entre muestras obtenidas dos años atrás con las recientes. Prueba de ello son algunas publicaciones que nuestro grupo ha podido realizar utilizando este tipo de muestras, algunas almacenadas por prolongados períodos de tiempo en el BT28-33.

Las medidas que se dispongan para asegurar la calidad de las muestras nunca serán suficientes, por lo cual, la diversificación de los lugares de almacenamiento, así como la existencia de equipos alternativos de respaldo, pueden minimizar las pérdidas en caso de alguna anomalía.

Entre los objetivos del BT está prestar apoyo, colaborar o desarrollar estudios e investigaciones que se realicen tanto en la institución como en los centros asociados. Los resultados de las investigaciones como proyectos, presentaciones, publicaciones, etc., serán los mejores indicadores de calidad de la gestión del BT. Estas estrategias deben contemplarse desde el inicio y deben ser enfocadas a la difusión entre la comunidad científica de la existencia del BT, de la cantidad y características del material almacenado, así como de las facilidades para su utilización. Como en nuestro país aún no existe una instancia coordinadora, Internet pudiese ser la mejor vía de comunicación y una muestra de ello es nuestra página web: www.bancodetumores.cl, creada recientemente. La segunda vía es algo más compleja y es la creación de una red de BT que pudiese asumir algunas funciones técnicas, administrativas y de coordinación27,34,35, tal y como son una realidad en múltiples países como la Red de Banco de Tumores en España22,36, el Tubafrost en Europa36 y del Instituto Nacional del Cáncer en Estados Unidos de Norteamérica34,37.

Aun cuando la metodología presentada no es innovadora ni pretende ser original, en nuestro país la experiencia en BT aún es muy escasa y no tenemos conocimiento de la existencia de otros BT con una estructura técnica y administrativa como la presentada. Nuestra experiencia demuestra la factibilidad técnica y económica de crear BT a nivel local en la mayoría de los Servicios de Anatomía Patológica, tanto en el sistema público como privado de salud, e insistimos en el rol del patólogo como el profesional mejor calificado para determinar la cantidad y calidad de muestra que puede ser entregada al BT4,38.

De esta manera, podemos concluir que los BT en Chile pueden llegar a constituirse en una poderosa herramienta capaz de apoyar e incentivar la investigación básica y clínica.

 

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Este trabajo es producto de los aportes parciales de los siguientes Proyectos: Fondecyt: 1060375; 1050603; Fondos de Desarrollo Clínica Alemana de Temuco y Clínica Alemana de Santiago y del PBCT6-CTI-SA.

Recibido el 23 de octubre, 2007. Aceptado el 28 de enero, 2008.

Correspondencia a: Iván Roa E. Vitacura 5951. Clínica Alemana. Santiago, Chile. E mail: iroa@alemana.cl.

 

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