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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.137 n.1 Santiago ene. 2009

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872009000100010 

Rev Méd Chile 2009; 137: 71-75

ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN

 

Subtipificación molecular de Salmonella entérica serotipo Enteritidis en el período post epidémico

Molecular subtyping of Salmonella enterica serotype Enteritidis in a post epidemic period

 

Mayerling Ríos R1a, Pamela Araya R1b, Alda Fernández R2c, Javier Tognarelli1b, Juan Carlos Hormazábal2, Jorge Fernández 01e.

Genética Molecular1, Bacteriología Clínica2, Instituto de Salud Pública de Chile.
aQuímico Laboratorista
bBioquímico
cTecnólogo Médico
ePhD y Licenciado en Biología

Dirección para correspondencia


Background: In the last two decades, Salmonella enterica serotype Enteritidis has become one of the main agents causing food borne diseases worldwide. This agent is transmitted mainly by contaminated meat and poultry. Aim: To determine the genetic subtypes of Salmonella enterica serotype Enteritidis, circulating in Chile between 2001 and 2003, a post epidemc period. Material and methods: One hundred ninety three isolates coming from human samples, prepared foods and animal products for human consumption, were analyzed bypulsed field electrophoresis, using PulseNet standardized protocol. Results: Thirteen subtypes of Salmonella enterica serotype Enteritidis were identified, that had between 0 and 13 bands. A predominant subtype was identified in 172 strains (88%) that carne from human isolates, prepared foods and animal products for human consumption. Oiher four subtypes, found in prepared foods and animal products for human consumption, were also found in human isolales. Most subtypes were lighlly inlerrelaled Subtypes II, VIII and XI were also found in the 1994 epidemic. Conclusions: Subtyping of baclerial strains by pulsed field electrophoresis is useful for the surveillance of food borne diseases.

(Key words: Electrophoresis, gel, pulsed field; Enterocolitis; Salmonella enterica)


Las enfermedades originadas por el consumo de alimentos contaminados, han surgido como una causa importante de morbimortalidad a nivel mundial1. En América Latina las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) representan alrededor de 70% de los casos de enfermedad diarreica aguda según datos de OMS1-3. En Chile, los brotes de enfermedades transmitidas por alimentos contaminados son de notificación obligatoria, a través de una red de vigilancia de laboratorio.

Salmonella entérica serotipo Enteritidis es uno de los principales agentes bacterianos que producen enfermedades transmitidas por alimentos. La infección por Salmonella entérica serotipo Enteritidis se asocia principalmente a la ingesta de menudencias crudas de aves y alimentos preparados a partir de huevos4,5. Hasta el año 1993, los casos de salmonelosis producidas por Salmonella entérica serotipo Enteritidis en Chile eran esporádicos, en 1994 se inició la epidemia en el norte del país con cifras que implicaron un aumento sobre los casos registrados históricamente6.

Para la subtipificación de Salmonella entérica serotipo Enteritidis se han empleado diferentes métodos moleculares, los cuales incluyen análisis de patrones plasmidiales, huella genética utilizando el elemento de inserción IS200, análisis de genes plasmidiales de virulencia (spvA, spvB, spvC, ribotipificación, análisis de secuencias nucleotídicas, polimorfismo de fragmentos de restricción, amplificación al azar del ADN polimórfico (RAPD-PCR) y electroforesis de campo pulsado (PFGE)7-11.

El Centro para el Control de las Enfermedades de Estados Unidos de Norteamérica (CDC) ha desarrollado una red de subtipificación molecular para la vigilancia de las enfermedades transmitidas por alimentos denominada PulseNet, la cual utiliza electroforesis de campo pulsado como base de subtipificación12,13. Este trabajo tiene como objetivo subtipificar molecularmente los aislados de Salmonella entérica serotipo Enteritidis recolectados entre los años 2001 y 2003, para desarrollar una base de datos nacional, la cual podría constituir una herramienta útil para fortalecer la vigilancia de las ETA en Chile a través de reconocimiento de clones circulantes.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas bacterianas. En este estudio se analizaron 195 cepas chilenas de Salmonella entérica serotipo Enteritidis, las cuales fueron recolectadas de diferentes zonas del país por el Laboratorio Nacional de Referencia de Enterobacterias del Instituto de Salud Pública de Chile entre los años 2001 y 2003. El número de cepas por zonas se obtuvo por muestreo secuencial del total de cepas recolectadas entre los años 2001 y 2003, utilizando el procedimiento de weighted cluster sampling14. El 37,4% de las cepas (73 cepas) correspondieron a la zona norte del país, de las cuales 66 cepas fueron de origen humano y 7 de origen en alimentos preparados. El 47,7% de las cepas (93) correspondieron a la zona central del país, 66 fueron de origen humano, 5 de origen en alimentos preparados y 19 de origen en tejido animal para el consumo. En la zona sur del país se recolectaron 14,9% de las cepas (29 cepas), 27 fueron de origen humano y 2 de origen en tejido animal para el consumo.

Las cepas fueron identificadas mediante pruebas bioquímicas descritas por Edwards and Ewing15 y serotipificadas por el esquema de Kauffmann-White16.

Electroforesis de campo pulsado. La extracción del ADN cromosomal se realizó según protocolo estandarizado de PulseNet, utilizando la cepa estándar Salmonella Braenderup H981217. Los aislados fueron cultivados en placas de agar Mueller Hinton por 16 horas a 35°C, las células bacterianas fueron resuspen-didas en tampón TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) con 20 µl de proteinasa K (20 mg/ml) y mezcladas con agarosa para campo pulsado 1% y SDS 1%. Una vez formados los moldes de agarosa se incubaron con tampón de lisis (0,5 mM EDTA, 1% lauril sarcosina pH 8,0) y 25 µl de proteinasa K (20 mg/ml) durante 2 h a 55°C con agitación. Los moldes fueron lavados tres veces con agua destilada estéril y tampón TE por 15 mln a 55°C. Un trozo de 2 mm de los moldes de agarosa fue digerido con 10 U de la enzima de restricción Xba I durante 4 h. El gel fue sometido a electroforesis a 6 V/cm con pulso inicial de 2,2 s hasta 63,8 s final por 23 h con un ángulo de 120° en tampón TBE 0,5% (45 mM Tris-borato, 1 mM EDTA) a 14°C. Los patrones de digestión de campo pulsado fueron detectados en sistema documentación de geles Gel DOC 2000 de BioRad.

Análisis filogenético. Los subtipos fueron comparados mediante el coeficiente de Dice. El agrupamiento fue realizado utilizando el algoritmo UPGMA («unweighed pair group matching analysis»), contenido en el programa Bionumeric versión 4.0 (Applied Maths, Kortrijk, Bélgica).

RESULTADOS

Se analizaron 195 cepas de Salmonella entérica serotipo Enteritidis recolectadas entre los años 2001 y 2003, correspondientes al periodo post-epidémico en Chile. Estas cepas fueron aisladas desde fuentes humanas, de alimentos preparados y de tejido animal para el consumo (Tabla 1).


Se identificaron 13 subtipos de entre 10 y 13 bandas correspondiente a Salmonella entérica serotipo Enteritidis. El subtipo predominante denominado arbitrariamente II, se identificó en 172 (88,2%) de las cepas y fue predominante en las tres zonas del país. El subtipo I se identificó en 5 (2,6%) cepas y el subtipo VIII en 3 (1,5%) cepas, mientras que en 15 (7,7%) de las cepas restantes se identificaron 10 subtipos denominados III, LV, V, VI, VII, IX, X, XI, XII y XIII.

En la zona norte del país se identificaron 7 subtipos diferentes (I, II, III, IV, VI, VII y IX), de los cuales los subtipos III, VII y IX no fueron observados en otras zonas del país. En la zona centro del país, se identificaron 9 subtipos (I, II, V, VI, VIII, X, XI, XII y XIII) de los cuales los subtipos V, X, XI, XII y XIII no fueron observados en otras zonas del país. En la zona sur, se identificaron 4 subtipos I, II, IV y VIII, todos presentes en otras zonas del país.

El subtipo II, que fue predominante en este estudio, se identificó en cepas de Salmonella entérica serotipo Enteritidis aisladas desde muestras clínicas humanas, de alimentos preparados y de tejido animal para consumo. Los subtipos I y III se identificaron en cepas aisladas desde humanos y de alimentos preparados. En cambio, los subtipos IV y VIII se identificaron en cepas aisladas desde humanos y de tejido animal para el consumo. A su vez, los subtipos V y XIII, sólo fueron identificados en cepas aisladas desde tejido animal para el consumo. Los otros subtipos sólo fueron identificados en cepas aisladas desde humanos.

Mediante el análisis bioinformático realizado a los subtipos encontrados durante el período post epidémico, se identificaron 4 agrupamientos (Figura 1). El subtipo II predominante se relacionó en 94% similitud con los subtipos II, I, III, VI, IX (agrupamiento B). Los subtipos VIII XII y XI se agruparon con 95,5% de similitud (agrupamiento C). Los subtipos incluidos en los agrupamientos B y C están estrechamente relacionados y en conjunto dan cuenta de 94,3% de las cepas estudiadas.


El subtipo XIII, identificado sólo en una cepa aislada desde tejido animal para el consumo, está más distante filogenéticamente de los otros subtipos identificados.

Al comparar los subtipos identificados en el periodo post epidémico con aquellos observados en la preepidemia y epidemia, se observó que los subtipos II, VIII y XI formaron parte de los subtipos que produjeron la epidemia en el año 1994 en Chile (Figura 1). Los otros 10 subtipos son exclusivos de la postepidemia, sin embargo sólo representan 7,2% de las cepas estudiadas.

DISCUSIÓN

En la Región Metropolitana se detectan anualmente alrededor de 300 brotes de infecciones transmitidos por alimentos, siendo afectadas aproximadamente 1.500 personas. El manejo y la vigilancia de los brotes por alimentos se llevan a cabo según el Decreto N°158 de Notificación de Enfermedades Transmisibles de Declaración Obligatoria, del año 2004.

Diversos estudios han demostrado que Salmonella entérica serotipo Enteritidis se encuentra presente en 7% de las carnes de aves y en 1/1.000 huevos. Esta última cifra no es menor si consideramos que la población consume una cantidad de huevos superior a los 6.000.000 de unidades diariamente4-6.

Este es el primer estudio de subtipificación molecular de cepas de Salmonella entérica serotipo Enteritidis circulantes durante la postepidemia. El análisis de los resultados demostró que el subtipo II predominó en la zona norte, centro y sur del país, abarcando 88,2% de las cepas estudiadas. Este subtipo fue predominante en las muestras de origen humano, de alimentos preparados y de tejidos animales para el consumo.

El subtipo predominante se identificó en nuestro país por primera vez en un número reducido de cepas en el período preepidémico entre 1990 y 19927. Sin embargo, durante la epidemia este subtipo se expandió y fue predominante en este período, situación similar a lo observado en el periodo post-epidémico. Los subtipos VIII y XI descritos en este estudio, también fueron observados en el período epidémico. En cambio, los otros 10 subtipos identificados en este estudio no fueron detectados en el período preepidémico y tampoco en el período epidémico, siendo exclusivos del período postepidémico entre los años 2001 y 2003. Sin embargo, estos subtipos representan sólo 9,2% de las cepas estudiadas y 7 de ellos representan aislamientos únicos.

La mayoría de los subtipos identificados en el período postepidémico entre los años 2001 y 2003, están estrechamente relacionados al subtipo II, encontrándose algunos subtipos característicos en cada zona del país, aunque en la mayoría de los casos estos subtipos son únicos.

El análisis de los subtipos también permitió establecer una probable fuente de origen para las infecciones en humanos por Salmonella entérica serotipo Enteritidis, ya que algunos subtipos fueron identificados en humanos, en alimentos preparados y en tejidos animales para el consumo.

El amplio uso de PFGE en la subtipificación de Salmonella entérica serotipo Enteritidis, ha demostrado que este agente infeccioso tiene un alto grado de estabilidad genética, lo que concuerda con los resultados obtenidos en nuestro país, donde la mayoría de los subtipos está estrechamente relacionado y son similares a los que se han reportado en otros lugares del mundo, lo cual indicaría un origen común18-20.

Los resultados obtenidos nos demuestran que es importante fortalecer la vigilancia de laboratorios para Salmonella entérica serotipo Enteritidis, tanto en su componente clínico-humano, epidemiológico y ambiental, para obtener muestras de mayor representatividad en términos temporales y geográficos. Este fortalecimiento permitirá definir con mayor certeza el rol de los diversos subtipos genéticos, determinar los nexos entre casos y fuentes y hacer un adecuado seguimiento de los clones circulantes a nivel nacional, en especial aquellos asociados a infección en humanos.

El uso de PFGE y el programa Bionumeric, estandarizado a través de la red PulseNet, permitirá desarrollar y mantener una base de datos con los subtipos que circulan en nuestro país. A su vez, al pertenecer a la red PulseNet internacional se podrá realizar intercambio de información con otros laboratorios regionales y de otras partes del mundo, entregando alertas de brotes de ETA y nuevos subtipos hipervirulentos a nivel mundial.

Agradecimiento

A la técnico María Ibáñez , del laboratorio Genética Molecular, por el apoyo en la técnica de electroforesis de campo pulsado.

 

REFERENCIAS

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Recibido el 6 de marzo, 2008. Aceptado el 28 de octubre, 2008.

Financiamiento: Instituto de Salud Pública de Chile

Correspondencia a: Dr. Jorge Fernández Ordenes. Genética Molecular, Departamento Laboratorios de Salud, Instituto de Salud Pública de Chile. Maratón 1000, Nuñoa, Santiago de Chile. Fax: 3507573. E mail: jfernand@ispch.cl

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