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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile vol.141 no.9 Santiago set. 2013

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872013000900007 

Artículos de Investigación

 

Efecto in vitro de los terpenos lupeol y casearina G sobre células sanguíneas y tumorales

In vitro effect of lupeol and casearin G on peripheral blood mononuclear and tumor cells

 

Omar A. Dupuy L.1,a,b, José A. Bonilla V.2,b, Renato Murillo3,b, Peter Taylor4,b, María Jesús Abad4,c, Lorena González1,c, Johanna Juliao A.1,d

1Instituto de Investigaciones en Biotecnología y Ciencias Biomédicas (IIBCB), Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Latina de Panamá, Panamá.
2Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM), Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica.
3Escuela de Química y CIPRONA, Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica.
4Laboratorio de Patología Celular y Molecular, Centro de Medicina Experimental, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC), Apartado 21827, Caracas 1020-A, Venezuela.
aMD.
bPhD.
cLicenciada en Biología.
dLicenciada en Biotecnología.

Correspondencia a:


Background: The rainforest is an important source of natural compounds with therapeutic properties. Although there are many anti-inflammatory and antineoplastic drugs available to the clinician, there is an ongoing need for new therapeutic drugs with fewer serious adverse effects. Aim: To evaluate the in vitro cytotoxic effects of lupeol and casearin G on tumor cells, on phagocytic activity and nitric oxide (NO) production by blood mononuclear cells. Material and Methods: The cytotoxic effect of these compounds on cell lines MCF-7 (human breast adenocarcinoma) and PC-3 (human prostate cancer) was measured by a colorimetric assay (MTS/PMS) and the sulphorhodamine B assay. Peripheral blood mononuclear cells were obtained from eight healthy volunteers. The effect of these compounds on nitric oxide (NO) production was measured using the Griess reaction. Their effect on phagocytic activity of PBMC was also evaluated. Results: Lupeol (≥ 2 mM) resulted in a reduction of both the phagocytic index and the percentage of phagocytic monocytes and macrophages. Treatment of monocytes/macrophages with lupeol (72 µM) and casearin G (4 µM) reduced the production of NO. Neither lupeol (< 969 µM) nor casearin G (< 55 µM) had cytotoxic effects on PBMC. Casearin G showed both cytotoxic (IC50, LC50) and cytostatic (GI50) effects against tumor cells, PC-3 (IC50 = 12.5 µM; GI50 = 13.3 µM; LC50 = 51.9 µM) and MCF-7 (IC50 = 112.8 µM; GI50 = 11.8 µM; LC50 = 49.4 µM), as well as a hemolytic effect (≥ 182 µM). Conclusions: These observations indicate that lupeol and casearin G might be useful compounds in the preparation of anti-inflammatory drugs, whereas casearin G might be useful in the elaboration of antitumor drugs.

(Rev Med Chile 2013; 141: 1150-1157).

Key words: Antineoplastic agents, phytogenic; Diterpenes, clerodane; Pentacyclic triterpenes.


 

El lupeol, un triterpeno aislado de plantas como Zanthoxylum monophyllum (Rutaceae), mostró actividad supresora sobre células T, inhibición de la producción de interleucina 2 (IL-2), disminución de la secreción del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-) e interferón gamma (IFN-) y reducción de la fagocitosis1,2. Se ha descrito que el lupeol posee un débil efecto inmunoestimulador sobre la producción de peróxido de hidrógeno por los macrófagos3. Por otro lado, el lupeol ha mostrado actividad antitumoral contra varias líneas celulares cancerígenas1.

Por su parte, la casearina G es un diterpeno que ha sido aislado de Casearia sylvestris (Flacourtiaceae), una planta cuyo uso está asociado a propiedades antiinflamatorias, antiofídicas4 y antiulcerosas5. Estudios de citotoxicidad muestran que C. sylvestris presenta un interesante potencial antitumoral debido a la presencia de casearinas6,7. Ha sido descrito que el aceite de C. sylvestris presenta citotoxicidad contra las células tumorales HeLa, A-549 y HT-29 y efecto hemolítico sobre eritrocitos de diferentes especies8.

Existe una asociación entre inflamación y cáncer9, de allí que un mismo principio activo pueda tener propiedades antiinflamatorias y antitumorales, como el millerenólido y la thieleanina10-12.

El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto citotóxico in vitro del lupeol y la casearina G sobre células tumorales y el efecto in vitro de estos compuestos sobre la viabilidad, actividad fagocítica y producción de NO de células sanguíneas.

Materiales y Métodos

Obtención de compuestos

Los compuestos fueron aislados de las plantas Z. monophyllum (Código: JVR 13509) y C. sylvestris (Código: JVR 13508), colectadas en El Rodeo, San José, Costa Rica, e identificadas por Luis Poveda (botánico de la Universidad Nacional, Costa Rica, donde reposa la muestra testigo). El lupeol y la casearina G (Figura 1) fueron aislados y purificados utilizando técnicas de extracción descritas con anterioridad por otros investigadores13 y su estructura química fue determinada por técnicas de resonancia magnética nuclear de una y dos dimensiones. Un milígramo de compuesto fue disuelto en 0,1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) y diluido en 0,9 ml de medio de cultivo RPMI 1640 (Sigma, No. Cat. R7388), para obtener una solución patrón de 1 mg/ml.

Figura 1. Estructura química de A. Lupeol, un triterpeno aislado de Zanthoxylum monophyllum; B. 18-butanoil-6-a-hidroxi-Casearina G, un diterpeno aislado de Casearia sylvestris.

Cultivo de células

Las células MCF-7 (adenocarcinoma de mama humano) y PC-3 (cáncer de próstata humano) fueron cultivadas en medio Eagle modificado por Dulbecco’s (DMEM) suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 5% (Gibco, USA), 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina (Sigma Chemical Corp., USA).

Las células fueron incubadas a 37°C en cámara húmeda, en una atmósfera al 5% de CO2. El medio de cultivo fue reemplazado cada cuatro días y los pasajes fueron realizados cada siete días.

El número y viabilidad celular fueron determinados por exclusión con azul tripán.

Obtención de células mononucleares de sangre periférica (CMSP)

Esta investigación fue aprobada por el Comité Nacional de Bioética de la Investigación de Panamá. Previa información y consentimiento de ocho voluntarios aparentemente sanos, las muestras de sangre total fueron colectadas en tubos estériles al vacío, con heparina como anticoagulante. Las CMSP fueron separadas mediante un gradiente de Ficoll-Hypaque (Sigma) como lo indica el fabricante. Brevemente, la sangre fue diluida 1:2 en tampón de fosfatos (PBS) y fue colocada sobre un colchón de 2 ml Ficoll-Hypaque 1,044.  Luego fue centrifugada a 1800 rpm por 45 min a 20oC. Las células mononucleares fueron extraídas y lavadas con PBS estéril, pH 7,2. Finalmente, las células fueron resuspendidas en RPMI 1640, suplementado con SFB al 10%, 50 mg/ml de estreptomicina, 100 UI/ml de penicilina, 2 mM de glutamina, 5 mM de 2-mercaptoetanol, 10 mM de solución MEM de aminoácidos esenciales, 45 mM de bicarbonato de sodio, 0,8 mM de glucosa y 25 mM de N-(2-hidroxietil) piperazina-N'-(ácido 2-etanosulfónico) (HEPES) como tampón.  La viabilidad celular fue verificada por observación microscópica utilizando la tinción vital de azul tripán y la concentración fue ajustada a 1x106 células vivas/ml. El volumen final agregado en cada pocillo fue de 200 µl.

Obtención de monocitos/macrófagos humanos

Doscientos µl de la suspensión de CMSP (1x106 células/ml) se incubaron en placas de 96 pocillos con fondo plano (Costar) durante toda la noche, para permitir la adhesión de los monocitos/macrófagos al fondo de los pocillos. Luego el sobrenadante con células no adherentes fue extraído, se realizaron lavados con medio RPMI 1640 y se restituyó el volumen a 200 µl con medio de cultivo fresco. Las placas fueron inspeccionadas al microscopio para verificar que la morfología de las células adheridas correspondía a la de monocitos/macrófagos.

Ensayos de citotoxicidad

Las CMSP (1x105 células/pocillo) tratadas y no tratadas con el lupeol y la casearina G a diferentes concentraciones (0-969 µM) fueron incubadas por quintuplicado a 37oC, en una atmósfera al 5% de CO2 por 72 h. Posteriormente, fueron agregados 50 µl por pocillo de una solución de sal de tetrazolio 2,3-bis (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-(fenilamino-carbonil)-2H-tetrazol hidróxido (XTT) (1 mg/ml) y N-metilfenacinametasulfato (PMS) (0,01 M). Las células fueron incubadas durante 2 h a 37°C en oscuridad. Posteriormente, fueron transferidos 100 µl del sobrenadante de cada pocillo a otra placa de 96 pocillos y se cuantificó el cambio de color en un lector de microplacas, a una longitud de onda de 450 nm y con un filtro de referencia de 650 nm. Adicionalmente, la viabilidad de las células fue determinada con azul tripán.

Las células MCF-7 y PC-3 fueron sembradas a una concentración de 2,5 - 5 x 104 células/pocillo en 100 µl de medio de cultivo en platos de 96 pocillos y fondo plano (Linbro, Flow Laboratories, VA, USA) y se les permitió adherirse durante 24 h. Se añadieron diferentes concentraciones del lupeol y la casearina G (0-242 µM) en 100 µl de medio de cultivo. Se prepararon pocillos de control que contenían cantidades equivalentes de DMSO, las cuales no excedieron 1%. No se observó ningún efecto debido al DMSO. Después de 48 h de incubación a 37°C, el número de células viables fue medido usando el ensayo cromogénico 5-(3-carboximetoxifenil) -2-(4,5-dimetilthiazolil) -3-(4-sulfofenil) (MTS)/PMS y el ensayo de sulforodamina B (Promega Corp., USA) para ello se siguieron las instrucciones del fabricante. En el caso del ensayo con MTS se determinó la CI50: concentración inhibitoria de 50% de la viabilidad celular total sin distinguir entre citostasis y citotoxicidad. En el caso del ensayo de sulforodamina B, se midió la densidad celular a T = 0 y después de 48 h. Esto permitió calcular tres parámetros, IC50: la concentración de la droga que inhibió el crecimiento de las células en 50%, ITC: la concentración de la droga que inhibió el crecimiento de las células en 100% y CL50: la concentración de la droga que indujo 50 % de citotoxicidad.

Ensayo de fagocitosis

Se evaluó el efecto de los compuestos utilizando muestras de sangre completa de ocho voluntarios aparentemente sanos. Para ello, 125 µl de sangre venosa completa heparinizada fue tratada por triplicado con el lupeol y la casearina G a concentraciones finales de 2, 5 y 7 mM durante una hora a 37oC y 5% de CO2. Luego se agregaron 125 µl de suspensión de Bacillus subtilis (1x109 UFC/ml) inactivada previamente durante 1 h a 80oC. Las muestras fueron incubadas a 37oC y 5% de CO2 durante 30 min. Luego se prepararon extendidos en portaobjetos y se procedió a teñirlos con tinción de Wright. Las placas fueron observadas al microscopio para determinar la actividad fagocítica (porcentaje de monocitos/macrófagos fagocíticos) y el índice fagocítico (cantidad promedio de bacterias fagocitadas por los monocitos/macrófagos).

Medición de óxido nítrico (NO)

Monocitos/macrófagos tratados y no tratados con diferentes concentraciones del lupeol y la casearina G (0-72 µM) fueron estimulados con 50 µl de endotoxina bacteriana (1 µg/ml) y fueron incubados a 37°C durante 24 h. Posteriormente, se transfirieron 100 µl de sobrenadante de cada pocillo a otra placa similar y se agregó igual volumen de reactivo de Griess (1% de sulfanilamida, Sigma, y 0,1% de naftilenediamina, Sigma, disuelto en ácido fosfórico al 5%). Luego se determinó la absorbancia a 550 nm de cada uno de los pocillos de prueba y de los controles, utilizando un lector de microplacas. La concentración de NO se determinó por extrapolación en una curva ajustada, por el método de mínimos cuadrados que fue diseñada con un patrón de nitrito de sodio, en donde la absorbancia está directamente relacionada con la cantidad de NO producido10.

Fragilidad eritrocitaria

Diez microlitros de eritrocitos humanos lavados previamente con PBS a 2.000 rpm por 5 min, fueron mezclados por duplicado con 190 µl del lupeol y la casearina G a diferentes concentraciones (0-950 µM) en tubos tipo Eppendorf. Luego de 2 h, los tubos fueron centrifugados a 2.000 rpm por 5 min y 100 µl de cada sobrenadante fue transferido a una placa de 96 pocillos fondo plano y la absorbancia fue medida a 540 nm en un lector de microplacas. El experimento incluyó controles con 0,2% de DMSO, agua destilada y PBS. EI porcentaje de hemólisis fue calculado de la manera siguiente:

Absorbancia de eritrocitos con compuesto/Absorbancia de eritrocitos con H2O dest. x 100

La viabilidad eritrocitaria fue calculada restando de 100 el porcentaje de hemólisis.

Análisis estadístico

Los datos fueron evaluados por medio de un análisis de varianza (ANOVA). Los resultados se presentan como el promedio de cada tratamiento y de los controles ± la desviación estándar. P < 0,05 fue considerado como nivel de significancia estadística.

Resultados

La cantidad de CMSP vivas disminuyó (p < 0,05) cuando la concentración del lupeol se incrementó a 969 µM y la casearina G se incrementó a ≥ 55 µM (Figura 2). Por debajo de estas concentraciones no se observaron efectos citotóxicos sobre las CMSP. Las concentraciones del lupeol y la casearina G utilizadas en los ensayos inmunológicos estuvieron muy por debajo de las concentraciones citotóxicas determinadas en esta investigación.

Figura 2. Efecto de A. lupeol y B. casearina G sobre la viabilidad de CMSP humana. Las células fueron cultivadas en ausencia y en presencia de lupeol (0-969 µM) y casearina G (0-64 µM) durante 72 h. El porcentaje de células vivas fue determinado con azul tripán. A concentraciones de 969 µM de lupeol y ≥ 55 µM de casearina G, se observó una disminución de la cantidad de células viables (p < 0,05) con respecto a 0 µM de compuesto. Cada punto representa el promedio ± DE de cinco réplicas.

Se observó una disminución (p < 0,01) de la actividad fagocítica en las muestras tratadas con el lupeol (≥ 2 mM), sin embargo, no se observó diferencia significativa (p > 0,05) en las muestras tratadas con la casearina G (Figura 3A). Además, se observó una disminución significativa (p < 0,05) del índice fagocítico luego del tratamiento con el lupeol (≥ 2 mM, p < 0,01) pero no se observó diferencia significativa (p > 0,05) luego del tratamiento con la casearina G en comparación con el control (Figura 3B).

Figura 3. Efecto in vitro de lupeol y casearina G sobre A. el porcentaje de fagocitosis y B. el índice fagocítico. Sangre completa humana tratada y no tratada con lupeol y casearina G (0-7 mM) fue incubada con Bacillus subtilis, en A. se contabilizó el número de células con bacterias en su interior, en B. se contabilizó el número de bacterias fagocitadas por célula. El porcentaje de células fagocíticas y el índice fagocítico disminuyeron (p < 0,01) en las muestras tratadas con lupeol (≥ 2 mM) con respecto a 0 mM de compuesto. Cada columna representa el promedio ± DE de tres réplicas.

Se observó una disminución (p < 0,05) de la producción de NO en las muestras tratadas con el lupeol (72 µM) y la casearina G (4 µM) (Figura 4).

Figura 4. Efecto in vitro de A. Lupeol y B. Casearina G sobre la producción de óxido nítrico por monocitos/macrófagos activados. Las células fueron cultivadas con lupeol (0-72 µM) y casearina G (0-27 µM), durante 72 h. A concentraciones de lupeol de 72 µM y casearina G de 4 µM, los monocitos/macrófagos disminuyeron significativamente (p < 0,05) la producción de óxido nítrico con respecto al control activado (0 µM de compuesto). Cada barra representa el promedio ± DE de tres réplicas.

La viabilidad eritrocitaria disminuyó (p < 0,05) en las muestras tratadas con la casearina G (≥ 182 µM) (Figura 5).

Figura 5. Efecto in vitro de lupeol y casearina G sobre la viabilidad eritrocitaria. Los eritrocitos humanos tratados y no tratados con lupeol y casearina G (0-950 µM) fueron incubados durante 2 h y se midió la absorbancia de la hemoglobina liberada en el sobrenadante. La viabilidad eritrocitaria disminuyó (p < 0,05) en las muestras tratadas con casearina G (≥ 182 µM) con respecto a 0 µM de compuesto. Cada punto representa el promedio ± DE de dos réplicas.

Los ensayos de citotoxicidad con casearina G sobre células tumorales PC-3 arrojaron valores de CI50 = 12,5 µM, IC50 = 13,3 µM y CL50 = 51,9 µM mientras que el efecto citotóxico de la casearina G sobre las células tumorales MCF-7 se evidenció por una CI50 = 112,8 µM, IC50 = 11,8 µM y CL50 = 49,4 µM. No se observó efecto citotóxico del lupeol sobre las células PC-3 y MCF-7 (Tabla 1 y Tabla 2).

Tabla 1. Efecto citotóxico de lupeol y casearina G sobre células PC-3 y MCF-7, medido por el método de MTS/PMS, después de 48 h de incubación. N = 3

Tabla 2. Efecto citotóxico y citostático de lupeol y casearina G sobre células PC-3 y MCF-7, medido por el método de sulforodamina B, después de 48 h de incubación. N = 3

Discusión

Los monocitos/macrófagos juegan un papel importante en muchas condiciones patológicas, incluyendo cáncer, trastornos inflamatorios, infecciosos y autoinmunes14. La actividad fagocítica en sangre completa constituye un modelo que asemeja un potencial escenario terapéutico, por lo que decidimos utilizar este tipo de ensayo para evaluar el efecto del lupeol y la casearina G sobre la actividad fagocítica de monocitos/macrófagos. El hecho de que nuestros resultados muestren que el lupeol causó la disminución tanto del porcentaje de monocitos/macrófagos fagocíticos como del índice fagocítico sugiere que el lupeol pudiera estar inhibiendo la fagocitosis per se y/o el reclutamiento de monocitos/macrófagos. La utilización de otros métodos (e.g. marcadores de superficie celular, citometría de flujo) podría contribuir a descartar los posibles sesgos originados por la evaluación microscópica de la morfología de las células estudiadas. Varios investigadores han reportado que el lupeol es capaz de reducir la fagocitosis en otros modelos experimentales1,2. El lupeol puede interactuar con múltiples moléculas, afectando y modulando el proceso inflamatorio y la respuesta al estrés celular, además, ha mostrado baja citotoxicidad en células sanas y actúa sinérgicamente cuando se utiliza en terapias combinadas1.

La disminución de la producción de NO causada por el lupeol en nuestros experimentos es consistente con lo reportado por otros investigadores, el acetato de lupeol causó la disminución del número de células que poseen actividad de la sintasa de NO inducida (iNOS), lo que sugiere la participación del sistema del NO en la acción de este compuesto15.

También ha sido reportado que extractos de C. sylvestris inhiben muy poco la producción de NO16. En efecto, nosotros encontramos que sólo la concentración de 4 µM de casearina G causó disminución de la producción de NO mientras que concentraciones más altas de casearina G no tuvieron efecto sobre la producción de NO.

C. sylvestris es una planta utilizada por indígenas de América del Sur para el tratamiento de varias enfermedades, incluyendo cáncer8. Nuestros resultados podrían explicar, al menos en parte, las propiedades antitumorales que se le atribuyen a esta planta (pues la casearina G es, según datos aún no publicados, el diterpeno tipo clerodano más abundante en esta planta), toda vez que la casearina G mostró efecto citotóxico y citostático in vitro contra células tumorales PC-3 y MCF-7. Estudios previos de citotoxicidad muestran que la CD50 (que en nuestro artículo se define como IC50) del aceite de C. sylvestris para las células tumorales HeLa, A-549 y HT-29 es 63,3, 60,7 y 90,6 µg/ml, respectivamente8. También reportamos que la IC50 de la casearina G para las células tumorales PC-3 y MCF-7 es 13,3 y 11,8 µM, respectivamente. Las diferencias observadas pueden deberse a que nosotros utilizamos casearina G pura mientras que otros estudios utilizaron un extracto oleoso de C. sylvestris. Se ha reportado que la CD50 del aceite de C. sylvestris para las células Vero es 210,1 µg/ml y para los macrófagos murinos es 234,0 µg/ml8, nuestros resultados muestran que las concentraciones de casearina G requeridas para disminuir la viabilidad de CMSP y eritrocitos in vitro en 50% fue > 64 y > 911 µM, respectivamente.

La máxima concentración que no causó hemólisis de eritrocitos humanos in vitro en el caso del aceite de C. sylvestris fue 156,2 µg/ml8 mientras que para la casearina G fue 91 µM. El hecho de que altas concentraciones de la casearina G causaron hemólisis de eritrocitos humanos in vitro, sugiere que este compuesto podría ser responsable del efecto hemolítico del aceite de C. sylvestris descrito por otros autores8.

Otros estudios fitoquímicos con C. sylvestris han revelado la presencia de casearinas y casearvestrinas, que exhiben actividad citotóxica. Varios compuestos de este tipo poseen una configuración cis o trans entre los anillos A y B y más importante, un característico sistema diacetal en el anillo C en las posiciones C-18 y C-196,7, lo que posiblemente les otorga a estos sus propiedades citotóxicas.

En esta investigación, el lupeol mostró muy poco efecto sobre las células tumorales estudiadas en comparación con lo reportado por otros investigadores17,18 que utilizaron concentraciones mucho más altas18 o compuestos estructuralmente diferentes17 al lupeol utilizado en nuestro trabajo.

En conclusión, el lupeol causa disminución de la actividad fagocítica y la casearina G tiene efecto citotóxico sobre las células tumorales PC-3 y MCF-7. Estos compuestos podrían ser útiles en el desarrollo de fármacos antiinflamatorios mientras que la casearina G podría utilizarse para el desarrollo de fármacos antitumorales.

Agradecimientos: Agradecemos a la Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT) de Panamá por financiar esta investigación como parte del proyecto código FID09-002.

 

Referencias

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Recibido el 21 de marzo de 2012, aceptado el 3 de julio de 2013.

Investigación financiada por la Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT). Ninguna institución tuvo influencia en el diseño del estudio; ni en la recolección, análisis o interpretación de los datos; ni en la preparación, revisión o aprobación del manuscrito.

Correspondencia a:
Omar A. Dupuy L.
Instituto de Investigaciones en Biotecnología y Ciencias Biomédicas (IIBCB), Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Latina de Panamá, Panamá,
Panamá.
Teléfono: (507) 2076709
E-mail: omarielsag@yahoo.com

Conflictos de Intereses:

Omar Dupuy

José Bonilla

Renato Murillo

Peter Taylor

María Jesús Abad

Lorena González

Johanna Juliao

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