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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile vol.143 no.3 Santiago mar. 2015

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872015000300005 

ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN

 

Análisis molecular del cáncer de colon esporádico

Molecular analysis of sporadic colon cancer

 

Claudia Hurtado1,a, Ana María Wielandt1,b, Alejandro J. Zárate1, Udo Kronberg1, Magdalena Castro2,c, Ken Yamagiwa3,d, Takashi Ito3, Yoshinobu Eishi4, Luis Contreras5, Francisco L ópez-Köstner1

1 Laboratorio de Oncología y Genética Molecular. Unidad de Coloproctología. Clínica Las Condes, Santiago, Chile.
2 Dirección Académica. Clínica Las Condes, Santiago, Chile.
3 Sub-dirección de Investigación. Latin American Collaborative Research Center, Tokyo Medical and Dental University, Santiago, Chile.
4 Department of Human Pathology, Tokyo Medical and Dental University Graduate School, Tokyo, Japan.
5 Servicio de Patología, Clínica Las Condes, Santiago, Chile.
a Doctor en Ciencias Biológicas (PhD).
b Bioquímico.
c Enfermera Universitaria, MScc Epidemiología.
d Estudiante pregrado medicina. Tokyo Medical and Dental University, Tokyo, Japón.

Correspondencia a:


Background: In Chile, colorectal cancer (CRC) is often diagnosed in late stages. Thus, surgical treatment must be complemented with chemotherapy. KRAS mutations and microsatellite instability have been detected in these tumors. However, the response to treatment in patients without KRAS mutations varies and requires a better understanding. Aim: To determine the frequency and distribution of somatic point mutations in KRAS, BRAF and PIK3CA genes and microsatellite instability status (MSI) in patients with colon cancer (CC). Material and Methods: A prospective observational study of patients undergoing surgery for colon cancer. Tumor-derived DNA was analyzed by polymerase chain reaction (PCR) for the most frequent mutations of KRAS, BRAF and PIK3CA. PCR was also used to analyze MSI. Results: Fifty-eight patients with sporadic CC were analyzed, 16 showed KRAS mutations (G12R, G12D, G12V, G13D) and out of the 42 patients that did not show any mutation, 10 had mutations in BRAF (V600E) and PIK3CA (E542K, E545D, E545K, Q546E, H1047R). BRAF mutations alone or in combination with PIK3CA mutations were observed in 27% of high MSI tumors and in 2% of tumors without instability (p < 0.049). A higher percentage of high MSI tumors were located in the right colon (p < 0.001), and showed BRAF mutation (p < 0.020). Conclusions: The highest percentage of high MSI and BRAF mutations was observed in the right colon. Therefore, this study suggests the presence of different molecular features between right and left colon tumors that should be considered when defining the therapeutic management.

Key words: BRAF protein, human; Colonic neoplasms; KRAS protein, human; PIK3CA protein, human.


 

El cáncer colorrectal (CCR) es una de las causas de mortalidad por cáncer más frecuentes en los países desarrollados1. En Chile, el CCR ha presentado un aumento significativo en los últimos años, tanto en hombres como en mujeres2,3.

La mayoría de los pacientes con cáncer de colon (CC) avanzado son tratados con cirugía resectiva, seguida de esquemas de quimioterapia según corresponda. Las quimioterapias más usadas están basadas en fluorouracilo, leucovorina y oxaliplatino (FOLFOX) o irinotecan (FOLFIRI). Los pacientes con enfermedad metastásica también pueden ser tratados con terapias basadas en anticuerpos monoclonales, como panitumumab o cetuximab, que han demostrado mejorar la supervivencia libre de progresión y la supervivencia global, mediante el bloqueo de la señalización del receptor del factor de crecimiento epidermal (EGFR). Esta vía tiene un rol importante en la patogénesis del CCR4,5, en la cual participan las vías de las MAPK (proteína quinasa activada por mitógeno) y PI3K (proteína fosfoinositol 3-quinasa)/Akt. Esta activación promueve procesos claves como la transcripción, migración, angiogénesis, crecimiento celular y apoptosis6.

En cuanto a la eficacia de los anticuerpos, ésta es variable, observándose que algunos pacientes no presentan una respuesta favorable al administrar tratamientos anti-EGFR. Esto se explica en gran medida por la presencia de mutaciones activantes en ciertos genes pertenecientes a esta vía, que confieren resistencia a la terapia. Entre estos, han sido blancos de estudio los genes KRAS, BRAF y PIK3CA. Se ha reportado que en pacientes sin mutación del gen KRAS, la tasa de respuesta a la terapia monoclonal puede ser de 9 a 28%7; lo cual se explica por la presencia de mutaciones activantes en otros genes como BRAF (codón 600) o PIK3CA (subunidad p110α)8-10.

La frecuencia de mutaciones en KRAS, BRAF y PIK3CA ha sido reportada en otras poblaciones con CCR (Bélgica, Alemania, Corea, Noruega, España, Italia, entre otros)11-17. No obstante, hay escasos reportes de la frecuencia de estas mutaciones en Latinoamérica.

Ciardello et al18 reportan que la frecuencia de mutaciones de KRAS en América Latina es de 36%, lo cual es similar a Europa (40%) y mayor que en Asia (22%). Otro estudio realizado en población peruana determinó que la frecuencia de mutaciones de KRAS y BRAF es de 16,7% y 9,9% respectivamente19.

Otra característica importante es la inestabilidad de microsatélites (MSI), que constituye otro factor pronóstico y predictivo en los pacientes con CCR20. Se ha observado que pacientes con CCR en estadío II y MSI alta, el uso de 5-fluorouracilo no beneficiaría al paciente, sugiriendo al estado de MSI como un valor predictivo de respuesta a terapia; por otra parte, se le ha otorgado un valor de mal pronóstico a la ausencia de MSI junto a la presencia de mutaciones en BRAF en pacientes con CCR21-24. En Chile no hay estudios que analicen en conjunto los genes KRAS, BRAF y PIK3CA y la MSI en pacientes con CC. Lo anterior tiene relevancia al momento de conocer las opciones para determinadas terapias en estos pacientes. Dado que las variables moleculares más frecuentemente utilizadas son la determinación del estado mutacional de KRAS y la MSI, el objetivo del trabajo es analizar la frecuencia y distribución de mutaciones somáticas puntuales en los genes KRAS, BRAF y PIK3CA y el estado de la MSI en pacientes con CC esporádico.

Materiales y Métodos

Diseño del estudio

Estudio observacional prospectivo realizado durante 2 años, en el cual se reclutaron pacientes mayores de 18 años con diagnóstico de adenocarcinoma de colon. Se excluyeron los pacientes con cáncer de recto y con historia familiar de CC. Cada paciente firmó un consentimiento informado que fue previamente aprobado por el Comité de Bioética de Clínica Las Condes. Los datos clínicos, demográficos e histopatológico de todos los pacientes fueron incluidos en una base de datos.

Extracción de ADN tumoral

Las secciones teñidas con hematoxilina-eosina de las muestras fijadas en formalina e incluídas en parafina (FFPE) fueron revisadas por el médico patólogo institucional quien seleccionó áreas con al menos 80% de células tumorales. Luego, se sacó un trozo del área seleccionada y se le realizó una nueva inclusión. De él se hicieron cortes seriados de 8 micrones de espesor no teñidos y se extrajo el ADN usando el kit QIAGEN QIAmp DNA FFPE Tissue® de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La integridad del ADN se analizó mediante la amplificación por PCR multiplex de 2 amplicones de GAPDH, 1 amplicón de β-globina y 1 amplicón de β-actina25. Se utilizaron sólo las muestras que amplificaban a lo menos 300 pb. Para determinar el estado de MSI de los pacientes, el ADN control se extrajo a partir de muestras de sangre del paciente, utilizando el método descrito por Lahiri y Nurnberger26.

Análisis de mutaciones somáticas en KRAS, BRAF y PIK3CA

El ADN del tumor se analizó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para las mutaciones más frecuentes de cada gen. Los partidores fueron diseñados para analizar los codones 12 y 13 del exón 2 de KRAS, el codón 600 de BRAF, y los exones 9 y 20 de PIK3CA. Para evitar la amplificación del pseudogen de PIK3CA, se diseñó un partidor específico para el exón 9. El listado de partidores y condiciones de las reacciones de PCR se detallan en la Tabla 1. La amplificación de los exones se realizó utilizando la enzima Platinum® TAQ DNA polymerase (Life Technologies) y un programa de 35 ciclos, utilizando una temperatura de alineamiento de 55ºC para los genes KRAS y PIK3CA y de 58ºC para el gen BRAF en un termociclador Applied Biosystems 2720 (Life Technologies). Los productos de PCR se visualizaron en geles de agarosa al 2%, teñidos con bromuro de etidio. Los genes KRAS y PIK3CA se analizaron por SSCP (Single Strand Conformomer Polymorphisms) y por secuenciación dirigida mediante el secuenciador automático ABI PRISM 3100. Se confirmaron todas las mutaciones encontradas secuenciando ambas hebras del ADN. El gen BRAF se estudió directamente por secuenciación.

 

Tabla 1. Partidores y condiciones utilizados para la amplificación de los genes
KRAS, BRAF y PIK3CA

Análisis del estado de MSI

Se determinó mediante la amplificación por PCR de los cinco marcadores microsatelitales recomendados por el National Cancer Institute (NCI) de los Estados Unidos de Norteamérica para el CCR: los mononucléotidos Bat-25, Bat-26 y los dinucleótidos D2S123, D3S1029, D5S34627,28. Cada marcador microsatelital fue amplificado a partir de ADN tumoral y ADN control utilizando partidores marcados con fluoróforos según lo descrito por Raptis y cols, 200729. La reacción de PCR fue realizada con 40 ciclos a 55ºC en un volumen final de 25 µl. Los microsatélites amplificados fueron separados por electroforesis capilar mediante el secuenciador ABI 310. Los resultados de la separación en el secuenciador se obtuvieron mediante el software Gene Mapper 4.0 de Applied Biosystems. Los tumores con 2 o más microsatélites inestables (>30%) y/o alteración en el patrón de migración son considerados como MSI-alta, tumores con sólo un microsatélite inestable son considerados como MSI-baja y los tumores sin microsatélites inestables se consideran como estables (MSS)21. Clínicamente se ha establecido que la MSI-baja se comporta como MSS, por lo que en este trabajo se considerarán como un solo grupo29,30.

Análisis estadístico

Se obtuvieron las variables demográficas y las características histopatológicas del tumor como el tipo histológico, la diferenciación del tumor y estadio de acuerdo a la clasificación de 2011 de la American Joint Cancer Committee/Union Internationale Contre le Cancer (AJCC/UICC). Se analizaron las mutaciones en KRAS, BRAF y PIK3CA y el estado de MSI. Los datos categóricos se resumieron en frecuencias y porcentajes. Las asociaciones entre los datos categóricos se analizaron mediante pruebas de chi-cuadrado. Valores de p inferiores a 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos.

Resultados

Se enroló un total de 58 pacientes (28 hombres y 30 mujeres) con CC esporádico. De estos, 30 (52%) mujeres con una edad promedio de diagnóstico de 62 años (rango: 36-90). Los hombres presentaron una edad de diagnóstico promedio de 65 años (rango: 35-87). El tumor se localizó en el colon derecho en 33% de los pacientes y 41% presentaba metástasis ganglionares al momento de la cirugía. La mayoría de los tumores fueron clasificados como moderadamente diferenciados (Tabla 2).

 

Tabla 2. Características clínico-patológicas y el estado mutacional de los pacientes

Se identificaron 30 mutaciones en 26 pacientes (45%) siendo la más frecuente la del gen KRAS, que se observó en 16 pacientes (27%). Las mutaciones encontradas en el gen KRAS fueron: G12R, G12D, G12V y G13D. En la Figura 1 se muestran algunos ejemplos de las mutaciones identificadas. En los pacientes sin mutación de KRAS (wild-type), 10 de ellos tenían mutaciones en otros genes (4 en BRAF (V600E), 5 en PIK3CA (E542K, E545D, E545K, Q546E y H1047R) y 1 presentaba una doble mutación en BRAF (V600E) y PIK3CA (E545D).

 

Figura 1. Electroferogramas y patrón de migración de geles de SSCP de algunas de
las mutaciones identificadas.

Hubo 4 pacientes con mutaciones simultáneas, es decir con dos genes mutados, 3 presentaban simultáneamente mutaciones en KRAS y PIK3CA (2 pacientes con G12D y E542K y 1 paciente con G12V y E545K), sin MSI, estadio II. El cuarto paciente presentaba simultáneamente mutaciones en BRAF (V600E) y PIK3CA (E545D) con MSI alta y estadio III. Todos ellos tuvieron tumores ubicados en el colon izquierdo.

No hubo pacientes con mutaciones simultáneas en KRAS y BRAF. La frecuencia específica de mutaciones encontradas se muestra en la Tabla 3.

 

Tabla 3. Frecuencia de mutaciones identificadas

Respecto de la MSI, 26% (15/58) de los tumores presentaba MSI alta y el porcentaje de pacientes con MSI alta no varió según género (Tabla 2). Hubo 30% de MSI alta en mayores de 50 años, en comparación a 8% en menores de 50 años (p = 0,119). En cuanto a la localización de los tumores, 58% de los tumores de colon derecho demostró MSI alta (11/19), comparado con 10% de los tumores del lado izquierdo (4/39; p < 0,001) (Figura 2). Además, en la Figura 2 se observa un porcentaje de mutaciones diferentes según su localización entre los genes KRAS, BRAF y PIK3CA, con una tendencia de BRAF asociado a colon derecho y KRAS a colon izquierdo que es independiente del estado linfonodal.

 

Figura 2. Distribución de mutaciones y MSI según la localización del tumor.

La mutación de KRAS sola o en combinación con PIK3CA estuvo presente en 20% de las muestras de MSI alta y 30% de las MSI baja/MSS. La mutación de BRAF sola o en combinación con PIK3CA en tumores MSI alta fue 27% y 2% de los MSI baja/MSS (p < 0,049) (Tabla 4).

 

Tabla 4. Distribución de mutaciones en pacientes según la etapa y estado de
inestabilidad microsatelital (MSI)

 

La distribución de mutaciones según la etapa tumoral (I-II versus III-IV) mostró una mayor tasa en etapas tempranas (I-II), comparadas con la etapa tardía, sin alcanzar significación estadística (50% versus 37%; p = 0,34) (Tabla 4).

Discusión

En este estudio, 45% (26/58) de los pacientes con CC presentó al menos una mutación de los genes KRAS, BRAF o PIK3CA. Esto evidencia que la frecuencia de mutaciones de los genes mencionados se enmarca dentro de los rangos descritos en América del Norte y Europa8,11-17, a diferencia de estudios como el realizado en Perú19, que da cuenta de una menor frecuencia de mutaciones en el gen KRAS, que según los autores es atribuido a una multietnicidad de su población.

En Chile, Roa et al., recientemente han descrito sobre 40% de mutaciones en KRAS y 15% de mutaciones en BRAF31,32, diferente a lo observado en este estudio (27% y 9%, respectivamente). Estas diferencias pueden deberse a nuestro limitado tamaño muestral, sin embargo, coincidimos al observar la misma frecuencia de distribución del tipo de mutación identificada.

En el presente trabajo, los tumores con mutaciones en BRAF se asociaron significativamente a MSI alta y localización en el colon derecho, lo cual es consistente con reportes previos33,34. Aun más, ha sido reportado que la mutación activante en BRAF fue encontrada entre 10-18% de pacientes con CC y que este porcentaje se incrementa a 27-45% en quienes presentan tumores MSI alta35,36, en concordancia nosotros observamos 9% de mutación en BRAF en nuestra población de estudio y que alcanza a 27% en aquellos con MSI alta. Respecto de las mutaciones, la mutación en BRAF está asociada a carcinomas avanzados y raramente se presenta en tumores MSS37.

Se ha propuesto que la existencia de tumores con BRAF mutado y MSI alta se asociaría a una vía carcinogénica diferente de la clásica adenoma a carcinoma38. Si bien las mutaciones en BRAF han sido reportadas como indicadores de mal pronóstico en pacientes con tumores de colon derecho y/o MSS32,9, la presencia de mutación en BRAF podría tener un valor predictivo ya que terapias específicas como vemurafenib (PLX 4032) y GSK 2118436, usados actualmente para pacientes con melanoma que tienen mutación en el gen BRAF, podrían ser usados también en pacientes con CC39.

En este estudio se observó que las mutaciones en BRAF fueron excluyentes con las de KRAS, lo cual ya está establecido en la literatura33, por esta razón para una mejor caracterización molecular ambos marcadores deberían ser considerados en los análisis.

La mutación activante de KRAS fue encontrada en proporciones similares a las descritas por Oliveira y cols.40 en pacientes con tumores MSI alta y MSI baja-MSS, quienes demostraron que éstas estaban presente en 22% de las MSI alta y 34% de las MSS37,40. En el caso particular de la mutación activante G13D, esta se observó en 5 de los 58 (8,6%) pacientes estudiados. En los últimos años ha existido controversia con respecto a que la mutación G13D sería de mejor pronóstico y con mejor respuesta a terapia que mutaciones en el codón 12, sin embargo, estudios recientes han demostrado lo contrario33,41-44.

Con respecto a las alteraciones funcionales que provocarían las mutaciones descritas en este trabajo, estas serían de carácter oncogénicas, ya que por ejemplo las mutaciones en los codones 12 y 13 del gen KRAS provocan cambios en el loop-P GTP (guanosina trifosfato) previniendo la hidrólisis de GTP y, por ende, activando así permanentemente moléculas de RAS45. Por su parte, la mutación en el codón 600 del gen BRAF resulta en la activación constitutiva de la proteína debida a que el cambio de valina (V) por glutámico (E) imita la fosforilación de otros aminoácidos como T599 o S602 en el segmento de activación. Este cambio provoca que la proteína BRAF se mantenga constitutivamente activa de manera independiente de KRAS46. En cuanto a las mutaciones de PIK3CA, estas han sido identificadas en diferentes tipos de tumores45. Las mutaciones en este gen llevan a una activación constitutiva de la actividad enzimática de p110α, lo que estimula la vía de señalización de AKT y permite crecimiento de manera independiente de factores de crecimiento47.

En este estudio se identificaron 4 tipos de mutaciones en el exón 9 y una en el exón 20, dando cuenta de 16% de todas las mutaciones. En pacientes con CC, las mutaciones de PIK3CA, solas o en combinación con mutaciones de KRAS o BRAF, están presentes en 14 a 25% de los casos48,49, independiente del estado de la MSI49. Además, Velho et al.49,50 reportaron que en CC, las mutaciones de PIK3CA pueden ocurrir concomitantemente con mutaciones de KRAS y BRAF en pacientes con MSI alta y MSS, similar a lo descrito en este estudio.

Por otro lado, en un reciente estudio de Liao y cols., observaron que los pacientes que tenían tumores con mutación en PIK3CA y que tomaban aspirina presentaron una mayor sobrevida que aquellos sin mutación, pero no así los pacientes con tumores que tienen mutación en BRAF. Aunque estos datos son muy interesantes deben considerarse como preliminares y requieren validación a futuro, dado el pequeño número de pacientes incluidos en ese estudio51-53.

Con respecto al tratamiento de pacientes con CC y el estado de estabilidad/inestabilidad microsatelital, los pacientes con tumores MSI alta han mostrado una sensibilidad diferente a los agentes quimioterapéuticos, apareciendo como más resistentes al cisplatino, carboplatino y el 5 fluorouracilo (5-FU)54,55, pero sensibles al irinotecán56. Por tanto, se ha propuesto considerar el estatus de inestabilidad microsatelital para definir la terapia en estos pacientes.

Actualmente la mayoría de los centros realizan solamente el análisis de KRAS para determinar qué pacientes serán susceptibles para responder a la terapia anti-EGFR. Sin embargo, alrededor de 9 a 28% de los pacientes sin mutación en el gen KRAS fallan en la respuesta a la terapia mencionada7, posiblemente debido a la heterogeneidad de las células tumorales del CC, dada por la presencia de mutaciones en otros genes de la vía.

En conclusión, en este estudio 24% (10/42) de los pacientes sin mutación en el gen KRAS presenta mutaciones en BRAF o PIK3CA, por lo que incluir el análisis de esos genes permitiría una mejor selección de terapias más específicas. La presencia de mutaciones de KRAS, BRAF y PIK3CA es similar a lo observado en otros estudios incluso de diferentes zonas geográficas. Asimismo, BRAF y KRAS son mutuamente excluyentes y hay mayor porcentaje de MSI y mutación en BRAF en el colon derecho. Por todo ello, este estudio sugiere que existen características moleculares diferentes entre los tumores de colon derecho e izquierdo que deben considerarse al definir la conducta terapéutica.

 

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Recibido el 20 marzo de 2014, aceptado el 9 de enero de 2015.

Financiado por: Dirección Académica, Clínica Las Condes y Tokyo Medical and Dental University (TMDU).

Correspondencia a: Claudia Hurtado R., PhD.
Laboratorio de Oncología y Genética Molecular. Clínica Las Condes. Lo Fontecilla 174. (CP: 7591018) Las Condes. Santiago, Chile. Teléfono: +56-2-22104771; Fax: +56-2-22104776.

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