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La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es una patología inflamatoria crónica de origen multifactorial que afecta principalmente al tracto gastrointestinal.1 Sus principales variantes son la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU)2. Aunque a nivel nacional no existen datos sobre incidencia y prevalencia de las EII, estudios locales demuestran un aumento de pacientes diagnosticados en la última década3-5.
La EC puede comprometer cualquier área del tracto gastrointestinal, afectando más frecuentemente íleon terminal y colon. Está caracterizada por la presencia de lesiones transmurales discontinuas6, y puede presentar distintos fenotipos: inflamatorio, fistulizante o estenosante7. La CU se describe por una lesión en la mucosa que afecta en su inicio principalmente el recto, pudiendo extenderse en forma continua y difusa hacia el resto del colon2.
Diversos factores han sido asociados con mayor riesgo de EII, destacando la genética, respuesta inmune y medioambiente1,8,9.
Factores ambientales como la dieta e influencia hormonal, han sido asociados con alteraciones en la microbiota intestinal y la integridad de la mucosa10. Es así como, fibras vegetales solubles favorecen el mantenimiento de la integridad epitelial y reducen la translocación de E. coli invasivas a través de las células M, lo que podría asociarse con un menor riesgo de EII11.
La E. coli es un bacilo gram-negativo presente en la microbiota normal del colon humano12. Sin embargo, algunas cepas han adquirido factores de virulencia permitiéndoles adaptarse a nuevos nichos y generar enfermedad. Seis patotipos diarreogénicos han sido descritos: E. coli enteropatogénica (EPEC), enterohemorrágica (EHEC), enterotoxigénica (ETEC), enteroagregativa (EAEC), enteroinvasiva (EIEC), y difusa-adherente (DAEC)12.
Hace más de dos décadas la presencia de E. coli fue identificada en la mucosa de 57% de los pacientes con EC, dando los primeros indicios de que esta bacteria podría jugar un papel en la patología13.
Posteriormente, cepas de E. coli con características adherente-invasiva (AIEC) fueron aisladas de mucosa intestinal de pacientes con EII. Esta bacteria posee la capacidad de invadir células epiteliales, replicar en macrófagos e inducir la liberación de TNF-α8,14.
Actualmente, una de las terapias más utilizadas para lograr remisión en las EII es el uso de corticosteroides, los que poseen un efecto anti-inflamatorio e inmunosupresor15, por lo que en estos pacientes la respuesta a bacterias en la mucosa intestinal podría verse alterada.
Dado que estos antecedentes demuestran una relación entre las EII con cepas de E. coli con características patogénicas, en este estudio evaluaremos la presencia de E. coli intracelular en mucosa intestinal de pacientes con EII y su asociación con las características clínicas/demográficas y el uso de corticosteroides como tratamiento anti-inflamatorio.
Materiales y Métodos
Pacientes
Pacientes con diagnóstico de EC y CU, de acuerdo a hallazgos endoscópicos, histológicos y radiológicos, y controles sometidos a colonoscopia fueron enrolados desde el Servicio de Gastroenterología de Clínica Las Condes (CLC).
Para el protocolo de obtención de bacterias intracelulares, presuntamente invasivas, 61 pacientes con EC, 83 con CU y 29 controles fueron incorporados al estudio prospectivo. La Tabla 1 muestra los pacientes agrupados de acuerdo a edad, género y actividad de la enfermedad. La localización/extensión y fenotipo de la patología, según corresponda, fue indicada en aquellos pacientes con actividad inflamatoria en la colonoscopia.
Tabla 1 Características clínicas y demográficas de los pacientes y controles
| EC | CU | Controles | ||
|---|---|---|---|---|
| n total de pacientes | 61 | 83 | 29 | |
| Promedio de edad (rango) |
38,2 (18-83) |
40,4 (19-67) |
51,7 (24-71) |
|
| Género M/F | 28/33 | 32/51 | 9/20 | |
| Activos/Remisión | 52/9 | 58/25 | - | |
| Localización | ||||
| Íleon | 17 | - | - | |
| Ileocolon | 16 | - | - | |
| Colon | 19 | - | - | |
| Extensión | ||||
| Proctitis | - | 14 | - | |
| Izquierda | - | 7 | - | |
| Extensa | - | 37 | - | |
| Fenotipo | ||||
| Inflamatorio | 42 | - | - | |
| Estenosante | 8 | - | - | |
| Fistulizante | 2 | - | - | |
Pacientes con EC y CU de ambos géneros y mayores de 18 años edad fueron incluidos en el estudio, mientras que aquellos con tratamiento antibiótico de hasta dos semanas previas al procedimiento, pacientes con EII no clasificable, colitis indeterminada, ileocolitis infecciosa, historia de enfermedad autoinmune, alergia alimentaria y enfermedad celíaca fueron excluidos.
Como grupo control, se incluyeron pacientes mayores de 18 años en pesquisa de programa de cáncer de colon con mucosa sana, excluyendo a todos aquellos con EII, diverticulitis, cáncer colorrectal y tratamiento antibiótico de hasta dos semanas previas a la colonoscopia.
Los pacientes con EII fueron categorizados según características clínicas, como actividad endoscópica, localización de lesiones intestinales, fenotipo y tratamiento.
La actividad endoscópica de pacientes con EC fue determinada de acuerdo a la graduación SES-CD donde una graduación ≤ 2 fue definida como remisión, 3-6 actividad leve, 7-15 moderada y ≥ 16 actividad severa16,17.
La localización de lesiones y fenotipo de la EC fueron definidas utilizando la Clasificación de Montreal, distinguiéndose los pacientes con lesiones en íleon, colon e ileocolon; y fenotipos inflamatorio, estenosante, fistulizante18.
En pacientes con CU, los hallazgos endoscópicos fueron graduados según el subíndice endoscópico de Mayo, donde el índice 0 indica una mucosa sin lesiones, 1 actividad leve, 2 moderada y 3 severa19. Adicionalmente, una enfermedad con un score ≥ 3 en EC y un subíndice ≥ 2 en CU se consideró como endoscópicamente activa.
La extensión de la CU también fue definida mediante la Clasificación de Montreal en proctitis, colitis izquierda y colitis extensa.18
El grupo control fue conformado por individuos sanos en programa de pesquisa de cáncer de colon.
La relación entre la presencia de cepas de E. coli intracelular en mucosa intestinal y tratamiento con corticosteroides (prednisona, hidrocortisona, budesonida), fue evaluada en un grupo de 55 pacientes con CU y 31 con EC (Tabla 2), que corresponden a un subgrupo de pacientes de la base de datos, en los que se cuenta con información completa de su terapia, excluyendo a pacientes derivados de segunda opinión.
Tabla 2 Tratamiento médico seguido por pacientes con EII
| EC | CU | ||
|---|---|---|---|
| Número total de pacientes | 31 | 55 | |
| Activos/Remisión | 27/4 | 46/9 | |
| Tratamiento | |||
| Sin medicación | 5 | 8 | |
| 5-ASA | 3 | 23 | |
| AZA | 6 | 5 | |
| Anti-TNF | 3 | 0 | |
| 5-ASA + AZA | 2 | 3 | |
| AZA + Anti-TNF | 5 | 1 | |
| Anti-TNF + Metotrexato | 1 | 0 | |
| 5-asa + AZA + Anti-TNF | 0 | 2 | |
| Corticoesteroides | 4 | 1 | |
| Corticoesteroides + 5-ASA | 0 | 5 | |
| Corticoesteroides + AZA | 0 | 2 | |
| Corticoesteroides + 5-ASA + AZA | 1 | 4 | |
| Corticoesteroides + AZA + Anti-TNF | 1 | 0 | |
| Corticoesteroides + 5-ASA + AZA + Anti-TNF | 0 | 1 | |
Esta investigación fue aprobada por el Comité de Ética de CLC. Los pacientes fueron consultados sobre su participación y firmaron un consentimiento informado previo a la colonoscopia.
Obtención de bacterias invasivas
Cepas de Escherichia coli intracelulares, tanto en pacientes con EII como en grupo control, fueron aisladas desde biopsias de íleon mediante el ensayo de protección a gentamicina. Para esto, las biopsias fueron incubadas en medio HBSS (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) suplementado con 100 μg/ml de gentamicina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) por 1 h a 37°C. Posteriormente, las muestras fueron lavadas 5 veces con PBS 1X (Calbiochem, Merck Biosciences Ltd, Nottingham, Darmstadt, Germany) y luego lisadas en 1% Triton-X-100/PBS. Diluciones seriadas del homogenizado del tejido fueron cultivadas en placas agar MacConkey (OxoidLtd, Wade Road, Basingstoke, Hampshire, UK) a 37°C durante la noche, para finalmente realizar el recuento de colonias.
Ensayos estadísticos
Las diferencias entre el número de bacterias identificadas entre grupos de pacientes fue evaluada con el test de Mann-Whitney. Mientras que la asociación entre la presencia de bacterias en mucosa intestinal, con características clínicas de los pacientes fue evaluada utilizando test de Fisher de dos colas o χ2. Diferencias estadísticamente significativas fueron consideradas aquellas con valor de p < 0,05. Los análisis de los resultados fueron realizados empleando el programa Graphpad_Prism v5.
Resultados
En este trabajo, cepas de E. coli intracelular fueron identificadas en 24/61 pacientes con EC (39,3%), 30/83 pacientes con CU (36,1%) y 3/29 controles (10,3%). Una gran dispersión fue observada en el número de cepas aisladas de mucosa de pacientes con EII en comparación a los pacientes control, donde en su mayoría no se identificó bacterias o el contenido fue muy bajo (Figura 1). Diferencias estadísticamente significativas fueron identificadas en el contenido bacteriano de biopsias de pacientes con CU (p = 0,0059) y EC (p = 0,0045) comparado al grupo control, pero no al comparar EC y CU (p = 0,7571).
Figura 1 Contenido bacteriano en biopsias de pacientes. Cada punto representa las unidades formadoras de colonia identificada en las biopsias obtenidas de individuos control, y pacientes con CU y EC. Además se indica el promedio de bacterias y el error estándar de la media para cada grupo. Prueba estadística utilizada: Mann Whitney test de dos colas, nivel de significancia: * p < 0,05, ** p < 0,005.
Análisis de asociación de bacterias con género de los pacientes
De los pacientes con EII, 33/61 individuos con EC (54%), y 51/83 pacientes con CU (61,44%), son de género femenino. El ensayo estadístico no reflejó asociación entre presencia de E. coli intracelulares con género de pacientes con EC (p = 0,0646) o CU (p = 0,6393) (Tabla 3), sugiriendo que el género no se asocia a la colonización de estas bacterias en mucosa intestinal de pacientes con EII.
Tabla 3 Análisis de asociación de bacterias con características clínicas de los pacientes con EII
| Características | Enfermedad de Crohn | Colitis ulcerosa | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| + bacteria | - bacteria | p value | + bacteria | - bacteria | p value | ||
| Género | |||||||
| Femenino | 9 | 24 | 17 | 34 | |||
| Masculino | 15 | 13 | 0,0646 | 13 | 19 | 0,6393 | |
| Actividad | |||||||
| Activo | 18 | 34 | 23 | 35 | |||
| Remisión | 6 | 3 | 0,1358 | 7 | 18 | 0,4555 | |
| Localización(+) | |||||||
| Ileon | 6 | 11 | |||||
| Ileocolon | 5 | 11 | |||||
| Colon | 7 | 12 | 0,9393 | ||||
| Extensión(+) | |||||||
| Proctitis | 4 | 10 | |||||
| Izquierda | 6 | 1 | |||||
| Extensa | 13 | 24 | 0,0268* | ||||
Se indica el número de pacientes con EC o CU que presentaron o no bacterias de acuerdo a características clínicas como género, actividad y localización/extensión. Se utilizó la prueba estadística test de Fisher o Chi cuadrado, de dos colas, con nivel de significancia: p< 0,05.
(+)χ2.
Análisis de asociación de bacterias con actividad en la EII
Del total de 83 pacientes con CU, 58 se encontraban en estado activo. En este grupo, 23/58 pacientes (39,7%) presentan cepas de E. coli, mientras que 35 (60,3%) no presentan. Por otra parte, de los 25 pacientes inactivos, 7 (28,0%) presentan bacterias (Tabla 3). El ensayo estadístico no arrojó una diferencia significativa entre ambos grupos (p = 0,4555).
En los pacientes con EC, 52 de los 61 pacientes enrolados se encontraban en estado activo. En este grupo 18/52 pacientes (34,6%) presentan cepas de E. coli intracelular. De los 9 pacientes inactivos, 6 de ellos (67%) presentan la bacteria. El test estadístico no arrojó significancia, (p = 0,1358), por lo que estas dos variables no estarían asociadas. (Tabla 3).
Análisis de asociación de bacterias según localización/extensión de las lesiones en la EII
La asociación entre localización de lesiones en pacientes con CU y la presencia de bacterias fue evaluada en los 58 pacientes activos. En CU, 13/37 (35,1%), 6/7 (85,7%) y 4/14 (28,5%) pacientes con pancolitis, CU izquierda y proctitis presentaron bacterias respectivamente. El test estadístico para evaluar asociación entre las variables arrojó significancia (p = 0,0268) (Tabla 3).
De forma similar, la asociación entre bacterias y localización de las lesiones fue evaluada en un total de 52 pacientes activos con EC. Presentaron bacterias 6/17 (35,2%), 5/16 (31,25%) y 7/19 (36,8%) pacientes con compromiso de íleon, ileocolon y colon, respectivamente. El test estadístico no arrojó significancia (p = 0,9393), por lo que en EC las variables localización de lesiones y E. coli no están asociadas (Tabla 3).
Análisis de asociación de bacterias y fenotipo en EC
El fenotipo en EC fue evaluado para los 52 pacientes activos. Las bacterias fueron identificadas en 15/42 (35,7%), 3/8 (37,5%) y 0/2 pacientes con fenotipo inflamatorio, estenosante y fistulizante, respectivamente. Dada la baja representatividad del fenotipo estenosante y fistulizante, no se realizó análisis comparativo entre estos grupos.
Análisis de asociación de bacterias con tratamiento de corticoesteroides
La relación entre presencia de E. coli intracelular y el uso de corticosteroides fue evaluada en 31 pacientes con EC y 55 pacientes con CU. En pacientes con EC la presencia de bacterias fue detectada en 1/6 (16,6%) y 9/25 (36%) pacientes, recibiendo o no tratamiento de corticosteroides, respectivamente; sin encontrarse asociación entre las variables (p = 0,6342). Por otro lado, presencia de bacterias en paciente con CU fue identificada en 10/13 (76,9%) y 10/42 (23,8%), con y sin tratamiento respectivamente, encontrando diferencias significativas entre ambos grupos (p = 0,0009) (Tabla 4).
Tabla 4 Análisis de asociación de bacterias en pacientes con o sin uso de corticosteroides
| Características | Enfermedad de Crohn | Colitis ulcerosa | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Tratamiento | + bacteria | - bacteria | p value | + bacteria | - bacteria | p value |
| Con corticosteroides | 1 | 5 | 10 | 3 | ||
| Sin corticosteroides | 9 | 16 | 0,6342 | 10 | 32 | 0,0009* |
Se utilizó la prueba estadística test de Fisher de dos colas, nivel de significancia: p< 0,05.
Discusión
Este estudio demostró que la presencia de E. coli intracelular en pacientes con EII está asociada a ciertas características clínicas de los pacientes, tales como extensión de las lesiones y tratamiento con corticosteroides.
La presencia de E. coli con propiedades adherente-invasivas (AIEC) fue demostrada previamente en pacientes con EII20,21. Estudios realizados en Europa identificaron la presencia de AIEC principalmente en pacientes con EC versus CU. Incluso, cepas AIEC fueron asociadas con compromiso de Íleon en pacientes con EC20. Recientemente, en una muestra acotada de pacientes con EII, nuestro grupo demostró que una alta proporción de casos con CU y EC presentan cepas de E. coli con características patogénicas, sin embargo, no se identificaron relaciones significativas con características clínicas y demográficas21, por lo que el presente trabajo constituye el primer estudio en Chile que relaciona estas variables.
En este estudio identificamos una alta proporción de pacientes con CU y EC que presentaron E. coli intracelular en comparación a controles. Estos resultados sugieren que la presencia de bacteria en la mucosa intestinal estaría asociada a EII, probablemente por una alteración en la microbiota intestinal o en la integridad de la barrera epitelial de los pacientes con posibles consecuencias en la regulación de la respuesta inmune local22. No obstante, sería interesante proyectar el análisis de la variación del número de bacterias en un protocolo de seguimiento de los pacientes y de su enfermedad, en relación a los período de actividad/remisión.
En pacientes con EII no observamos asociación entre presencia de bacteria en mucosa intestinal con el género de los pacientes. Sin embargo, se debe reconocer que el género puede afectar la composición de la microbiota, ya que diferencias entre hombres y mujeres han sido descritas23,24. Asimismo, algunos trabajos sugieren que el género puede tener una influencia en la microbiota intestinal en distintos patologías, tales como síndrome de intestino irritable y EII25,26.
En pacientes con EII, no se encontró asociación entre bacterias y actividad de la enfermedad. Sin embargo, en el grupo con CU un mayor porcentaje de pacientes en estado activo (40%) presenta bacterias en comparación a aquellos en estado inactivo (28%). Cuando consideramos pacientes activos a aquellos con un índice de Mayo ≥ 1, es decir, incluimos a aquellos que tengan un compromiso leve de la enfermedad, si encontramos asociación (p = 0,0411) (datos no mostrados). Esto sugiere que las bacterias podrían participar en la alteración de la mucosa, incluso cuando cursa con lesiones leves. No observamos esta tendencia en pacientes con EC, probablemente por el bajo número en estado inactivo.
Antecedentes de la literatura muestran un mayor contenido bacteriano en íleon terminal de pacientes con EC, esto asociado a una mayor expresión de CEACAM6 en células epiteliales que serviría de ligando para la adhesión de la bacteria27. En este trabajo no se identificó asociación de bacterias y localización de las lesiones en pacientes con EC. Sin embargo, hubo asociación entre la presencia de bacterias con la extensión de CU, esto posiblemente debido a que 85,7% de los pacientes con colitis izquierda presentan bacterias, mientras que se encontraron bacterias en 28% y 35,1% de los pacientes con proctitis y compromiso extenso, respectivamente. Estas observaciones podrían ser consecuencia de una diferencia en los mecanismos de adhesión de las cepas de nuestra población comparado con otras poblaciones reportadas28.
En cuanto al tratamiento, se encontró asociación entre la presencia de bacterias y el uso de corticosteroides en CU. Los corticosteroides poseen un efecto inmunosupresor que podría afectar células del sistema inmune encargadas del reconocimiento y eliminación de patógenos, alterando la eliminación eficiente de la bacteria29,30. Además, en un modelo murino de colitis, se demostró que los corticosteroides pueden afectar la microbiota intestinal y la expresión del gen muc2, disminuyendo la secreción de mucina y alterando la barrera intestinal31.
En el análisis para pacientes con EC, no se identificó asociación de bacterias con el uso de corticosteroides. Esta observación puede ser un reflejo de diferencias en las cepas involucradas en EC versus CU. Estudios de comparación genético/molecular de las cepas aisladas en los distintos pacientes EII podrían aclarar esta hipótesis.
Las EII son enfermedades multifactoriales, en las que alteraciones en la microbiota, y la colonización de bacterias como E. coli, podrían cumplir un papel importante en estas enfermedades. Es posible que otras bacterias, virus u hongos con características patogénicas afecten la microbiota intestinal de estos pacientes, sin embargo, es necesario la utilización de técnicas complementarias para identificarlos. Estudios similares permitirán ahondar en otros factores que puedan estar ligados a estas enfermedades crónicas, sin cura hasta la fecha, con énfasis en la manera de mejorar el manejo de los pacientes y su calidad de vida.
