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Revista médica de Chile

Print version ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile vol.145 no.12 Santiago Dec. 2017

http://dx.doi.org/10.4067/s0034-98872017001201551 

Artículo de Investigación

Caracterización de cepas de Campylobacter jejuni obtenidas desde carne de pollo y heces de aves de corral de la zona central de Chile

Characterization of Campylobacter jejuni samples coming form poultry meat and feces

Sindy Gutiérrez1  a

Daniel Orellana1  b

Claudio Martínez1  2  c

Verónica García Mena1  2  d

1Departamento de Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Facultad Tecnológica, Universidad de Santiago (USACH). Santiago, Chile

2Centro de Ciencia y Tecnología de los Alimentos Universidad de Santiago. Santiago, Chile

ABSTRACT

Background

Campylobacter jejuni is one of the main causal agents of food borne diseases. Infections with this pathogen are mainly caused by chicken meat consumption.

Aim

To characterize antibiotic resistance and virulence factors in C. jejuni strains obtained from chicken meat and poultry feces in Central Chile.

Material and Methods

The presence of C. jejuni in 30 meat and 40 feces samples from poultry was studied. From these samples, we obtained 40 strains which were characterized at the molecular level for the presence of 16 genes involved in virulence using PCR. In parallel, antibiotic resistance for ciprofloxacin, nalidixic acid, tetracycline, erythromycin, azithromycin, chloramphenicol y ampicillin was analyzed.

Results

Twenty and 63% of feces and chicken meat samples were positive for C. jejuni, respectively. Moreover, a high percentage of strains showed antibiotic resistance, where 27% of strains were resistant to all tested antibiotics, except for azithromycin. Finally, 10% of the strains coming from feces contained 14 out of 16 virulence genes evaluated. Only 23% of the strains did not contain any of these genes.

Conclusions

A high percentage of feces and chicken meat samples are contaminated with C. jejuni. Moreover, these strains show a high genetic and phenotypic diversity represented by their antibiotic resistance profiles and the presence of virulence factors.

Key words Anti-Bacterial Agents; Campylobacter jejuni; Poultry; Poultry Products

Campylobacter jejuni es una de las principales bacterias que causa gastroenteritis en países industrializados1. En Chile, Campylobacter es el tercer agente causal de diarreas en niños2,3. Es adquirida por consumo de leche no pasteurizada, aguas contaminadas, etc. Sin embargo, se encuentra en altas densidades en el intestino de las aves de corral, como consecuencia, el consumo de carne de ave mal cocida es responsable de 50-80% de los casos de campylobacteriosis4.

La campylobacteriosis es una gastroenteritis aguda, autolimitada5 y habitualmente no requiere tratamiento. Sin embargo, en pacientes inmunocomprometidos o con infecciones prolongada es necesario el tratamiento con antibióticos6, siendo las fluoroquinolonas y los macrólidos los antibióticos comúnmente seleccionados, a pesar del aumento de cepas resistentes a estos1,7.

En este trabajo caracterizamos la susceptibilidad de 40 cepas de C. jejuni, obtenidas de heces de aves de corral de crianza doméstica (14) y de carne de pollo de consumo humano (26), a antibióticos de distintas familias, entre ellos macrólidos (eritromicina y azitromicina), por el aumento de cepas resistentes, y quinolonas (ácido nalidíxico y ciprofloxacina) por ser utilizado en la industria avícola. Además, evaluamos la presencia de genes involucrados en virulencia, incluyendo genes que participan en adhesión, invasión, sobrevivencia, producción de toxina y en transporte de sideróforo. Estos genes entregan una panorámica general de la virulencia8,9, aunque los genes que participan en la infección de Campylobacter involucran otros procesos.

Materiales y Métodos

Cepas bacterianas y medios de cultivos

Las 40 cepas analizadas fueron obtenidas a partir de heces de aves de corral o carne de ave disponible a la venta según los protocolos descritos anteriormente10. Las muestras de carne de pollo fueron obtenidas de supermercados (15 muestras) y carnicerías (15 muestras) de las comunas de Estación Central, Quinta Norma y Santiago Centro, mientras que 40 muestras de heces fueron obtenidas de aves de crianza doméstica de las comunas de Talagante, Casablanca, Melipilla y Cauquenes. Diluciones de las muestras fueron sembradas en agar selectivo mCCDA (Oxoid) y posteriormente incubadas a 42°C por 48 h en condiciones de microaerofilia. Posteriormente, se tomaron a lo menos 8 colonias de cada muestra positiva y fueron cultivadas en agar tripticasa de soya 5% v/v sangre de cordero. Posteriormente, se analizó la morfología de las bacterias por microscopía10 y aquellas seleccionadas se cultivaron en agar tripticasa de soya 5% v/v sangre de cordero para posteriores análisis. Las colonias obtenidas en esta etapa son denominadas aislados y se almacenaron a −80°C en caldo Brucella 30% v/v de glicerol.

Identificación de cepas de C. jejuni

Las cepas de C. jejuni fueron identificadas a través de la prueba de hidrólisis del hipurato y confirmadas por reacción en cadena de la polimerasa (PCR)11. Con el fin de establecer que las colonias correspondían a cepas diferentes se realizó un RAPD (del inglés Random Amplification of Polymorphic DNA) usando el primer AP412. Los perfiles electroforéticos fueron analizados utilizando el programa GelJ v 2,0.13 La identificación de cepas se realizó por el coeficiente de correlación de Dice y el algoritmo de clustering UPGMA (del inglés Unweighted Pair-Group Method with Averages) con una tolerancia de optimización de 5%. Aquellos aislados que tenían un perfil de RAPD particular y distinto a otros fueron denominados cepa.

Ensayo de susceptibilidad antimicrobiana

Se analizó la susceptibilidad a los antibióticos mediante dilución en agar para los antibióticos cloranfenicol y eritromicina, epislometría (E-test) para azitromicina, ampicilina y eritromicina y sensidiscos para ciprofloxacina, tetraciclina, eritromicina y ácido nalidíxico. Los puntos de corte para definir una cepa susceptible, resistente o intermedia se definieron según lo descrito anteriormente14,15. Se utilizó el método sensidiscos y E-test por su fácil implementación, además, E-test es cuantitativo. En el caso de eritromicina se utilizó, también, dilución en agar para confirmar los resultados obtenidos con otros métodos.

Análisis de PCR de genes de virulencia

Un total de 16 parejas de partidores fueron utilizados para evaluar la presencia de genes de virulencia: adhesión y colonización (flaA, flaC, cadF, dnaJ, cbrR), invasión y virulencia (virB11, ciaB, pldA), sobrevivencia (racR, sodB, htrA, clpA), producción de toxina (cdtA, cdtC) y transportadores de sideróforos (ceuE) y wlaN por mimetizar a los gangliosidos16. En este estudio no fue incluido el gen cdtB, debido a que no fue posible estandarizar su amplificación. Como control positivo se utilizó ADN (ácido desoxirribonucleico) de las cepas de referencias de C. jejuni ATCC33560, NCTC13367 y ATCC43430. Como control negativo se utilizó ADN de Escherichia coli ATCC25922.

Resultados

Identificación de cepas de C. jejuni

Los resultados indican que 63,3% de las muestras de carne resultaron positivas para Campylobacter, las cuales provienen de carnicería (8) y supermercados (11). Además, 20% de las muestras de heces fueron positivas (Tabla 1).

Tabla 1 Muestras contaminadas con C. jejuni 

n de muestras Positivas % Positivas
Heces 40 8 20
Carne de pollo 30 19 63,3
Total 70 27 38,6

A partir de cada muestras positivas para Campylobacter se seleccionaron entre 8 y 20 colonias y se analizaron por PCR con el fin de determinar la especie11. En esta etapa cada una de las colonias fue tratada en forma independiente y corresponden a un aislado. Posteriormente, y con el fin de determinar perfiles genéticos distintos e identificar cepas se realizó RAPD (Figura 1). Así, colonias obtenidas de una misma muestra con perfiles de RAPD diferentes corresponde a cepas distintas. De esta forma se obtuvo 151 aislados, de los cuales 75 provienen de heces y 76 de carne de pollo. Luego del análisis de RAPD, se determinó que 145 eran cepas distintas, pues poseían un perfil genético distinto. En la muestra 7 (heces provenientes de Talagante) se obtuvo un total de 17 aislados, de las cuales, 13 de ellas se encontraban muy cercanas en el árbol filogenético (dato no mostrado). Por otro lado, de los 5 aislados obtenidos en la muestra 47 (carne proveniente de supermercado) se observaron 3 cepas distintas molecularmente, aunque muy cercanas. Esta observación indica que una muestra de carne o de heces puede estar contaminada por más de una cepa de C. jejuni.

Figura 1 Distribución de las cepas de C. jejuni respecto a su susceptibilidad a los antibióticos. Clasificación de las 40 cepas analizadas para los antibióticos. En negro: cepas susceptibles, en blanco: cepas con susceptibilidad intermedia, en gris: cepas resistentes. 

A partir de estos resultados se seleccionaron 40 cepas: 14 cepas obtenidas desde heces y 26 desde carne de pollo.

Resistencia antibióticos de cepas de C. jejuni.

A las cepas antes seleccionadas, se evaluó la resistencia a los antibióticos eritromicina, ciprofloxacina, tetraciclina, ácido nalidíxico, azitromicina, ampicilina y cloranfenicol.

Los resultados indican que 27% de las cepas, todas obtenidas de carne, eran resistentes a todos los antibióticos analizados, excluyendo azitromicina (Figura 1 y Tabla 2). Por otro lado, ninguna de las cepas obtenidas desde heces fue resistente a cloranfenicol (MIC ≥ 32), y mostraban MIC (concentración inhibitoria mínima) que variaban entre 4 y 8 μg/mL, por lo cual se clasificaron en el rango intermedio (entre 0,12 y 32 μg/mL). Por otro lado, 77% de las cepas obtenidas desde carne fueron resistentes a este antibiótico.

Tabla 2 Resultados de susceptibilidad a los antibióticos de cepas de C. jejuni analizados por dilución en agar, E-test o sensidiscos 

Distribución de los resultados se sensidiscos (%)
Antibiótico % R (MIC) % R (E-test) S I R
Eritromicina 87,5 90,0 2,5 10 87,5
Tetraciclina 77,1 ND 17,5 12,5 70
Cloramfenicol 55,3 ND ND ND ND
Ciprofloxacina ND ND 27,5 12,5 60
Ácido nalidíxico ND ND 30,0 0 70
Ampicilina ND 90,0 ND ND ND
Azitromicina ND 2,5 ND ND ND

ND: No determinado, S: susceptible, I: intermedio, R: Resistente.

Los resultados de MIC mediante el método de dilución en agar para eritromicina mostraron un alto porcentaje de cepas resistentes (87,5%). Para confirmar esta observación se realizó el análisis de susceptibilidad de las cepas mediante sensidiscos y E-test, observando que entre 87,5 y 90% de las cepas eran resistentes a eritromicina. Las cepas Cj123 y Cj48 resultaron con MIC de ≤ 0,125 y 0,5 μg/mL respectivamente, mediante el método de dilución en agar. Sin embargo, en el ensayo de E-test su MIC fue de ≥ 256 y 64 μg/mL, respectivamente, y por sensidiscos no presentaban halo de inhibición, por lo cual fueron clasificadas como resistentes.

Por otro lado, 60% de las cepas fueron resistentes a ciprofloxacina, todas provenientes de carne de pollo. Las cepas obtenidas desde heces presentaban halos de inhibición que variaban entre 21 y 40 mm, por lo tanto se clasificaron como susceptible o intermedio. Respecto a ácido nalidíxico, solo una cepa proveniente de carne de pollo resultó susceptible. Sin embargo, en cepas provenientes de heces se observó más variedad, observando 3 cepas resistentes: la cepa Cj32 no presentaba halo de inhibición y las cepas Cj61 y Cj36 presentaban un halo de 14 mm. Por otro lado, las cepas provenientes de heces resistentes a ácido nalidíxico fueron de susceptibilidad intermedia a ciprofloxacina.

En cuanto a azitromicina, del total de muestras 2 cepas fueron resistentes, con un MIC de 64 y 32 μg/mL. Finalmente, para ampicilina, todas las cepas de carne fueron resistentes y en cepa de heces, 4 cepas resultaron susceptibles.

Factores de virulencia

Se evaluó la presencia de genes relacionados con virulencia en las cepas obtenidas observando que el gen más frecuente fue ceuE (en 62,5% de las cepas). Por otro lado, ninguna cepa presentó el gen wlnA. Las cepas Cj22, Cj28, Cj29 y Cj32, provenientes de heces, fueron las que presentaron mayor número de genes (14 de 16). Además, estas cepas fueron las más susceptibles a los antibióticos, excepto la cepa Cj22 que fue resistente a azitromicina. Por otro lado, la cepa Cj119 fue la cepa proveniente de carne que mostró mayor presencia de genes de virulencia (10 de 16). Además, 9 cepas no presentaron ninguno de los genes evaluados, 5 cepas de heces y 4 de carne (Figura 2).

Figura 2 Presencia de genes relacionados con virulencias de C. jejuni. En las 40 cepa seleccionadas y mediante PCR se analizó la presencia de 16 genes importantes para la virulencia de C. jejuni

Discusión

C. jejuni es una bacteria que se encuentra en alta concentración en el tracto digestivo de las aves de corral y, en consecuencia, una alta cantidad de carcasas de pollos se contaminan17,18.

En este estudio se observó que nuestro país no es la excepción. Así, 63,3% de las muestras de carne de pollo resultaron positivas para esta bacteria. Estudios anteriores indican que durante la evisceración se produce la mayor contaminación, alcanzando 54% de carcasas contaminadas, aunque el proceso de congelamiento disminuye la cantidad de bacterias, el número de carcasas contaminadas se mantiene19. Este porcentaje de carne contaminada es similar a lo reportado en otros países: en Canadá, 62% de las muestras de carne de pollo resultaron positivas para Campylobacter20, 49,5% en España21 y en 83,3% en el Reino Unido22. En América del Sur, la situación es similar: en Argentina23 87,8% de las carnes de pollo presenta C. jejuni, 68,8% en Brasil 24 y en Chile, entre 54 y 90%19. Asimismo, 92,9% de hígados de pollo reportan la presencia de Campylobacter25.

Por otro lado, 20% de las muestras de heces fueron positivas para C. jejuni, estos resultados son similares a los reportados en el sur de Chile, en donde 34% de las heces de aves presentan C. jejuni26 y 25,7% de heces de gallinas presentan Campylobacter sp27 y entre 45% y 100% en otras aves28. Respecto al tipo de crianza de las aves, se ha observado una mayor prevalencia de Campylobacter sp. en crianza doméstica, respecto a aves de poblaciones confinadas29.

Por otro lado, se ha descrito que las carcasas de pollo pueden estar contaminadas con más de una cepa de C. jejuni30, lo cual fue confirmado con nuestros resultados, pues muestras de heces y de carne tienen más de una cepa, según el patrón molecular observado por RAPD. Así, 50% de las muestras positivas de heces tiene 2 cepas distintas y 89,5% de las muestras positivas de carne tienen 2 o 3 cepas distintas. Esto último puede ser reflejo de una contaminación cruzada en las vitrinas de venta de pollo a granel. Esta coexistencia de cepas ha sido observada en biopelículas31 y en pacientes con Guillian Barré32.

Por otro lado, los resultados muestran un porcentaje alto de cepas resistentes a ciprofloxacina en cepas obtenidas desde carne de pollo, similar a lo observado anteriormente35,36. Esto se relaciona con un aumento de las cepas resistentes a este antibiótico en pacientes. En Chile se ha descrito un aumento en las cepas resistentes a este antibiótico obtenidas coprocultivos de pacientes en Santiago (32,4% durante el año 2008)37, lo que difiere de lo observado años atrás en el sur de Chile, en donde el 100% de los aislados clínicos eran susceptibles a este antibiótico38. De manera similar en Beijing, China, se describió la resistencia a antibióticos de aislados clínicos desde el año 1994 al 2010, observando un aumento en la resistencia a ciprofloxacina en el tiempo, esto mismo se observó con tetraciclinas y, en forma menos importante, con macrólidos39. Nuestros resultados muestran una alta cantidad de cepas resistentes a eritromicina, preferentemente en cepas obtenidas de carne de pollo (92,6%), lo que difiere a lo reportado anteriormente en nuestro país26,37, aunque, en los últimos años se ha reportado un aumento en las cepas resistentes a eritromicina39. Una posible explicación de esto es el pequeño número de muestras analizadas y la posibilidad de que las muestras de carne provengan de un mismo faenador. A pesar de ser adquiridos en distintos locales, todas las muestras provienen de comunas cercanas. Además, se ha descrito que la resistencia a macrólidos está determinada por varios polimorfismos ubicados en distintos genes (rARN 23S, L4, L22, bomba CmeABC), en este sentido, son varios los blancos que pueden producir una cepa resistente a este antibiótico. Incluso se ha descrito nuevos genes, como el gen erm que codifica para rARN metilasa40 que podría participar en la resistencia a macrólidos39. Finalmente, es importante destacar que en países como Perú41 e India42 se ha descrito un aumento en las cepas de C. jejuni resistentes a eritromicina en los últimos años. Por otro lado, solo 2 cepas resultaron resistentes a azitromicina (5% de las cepas). De igual forma, se han reportado diferentes perfiles de resistencia de cepas obtenidas en aislados clínicos y carne de pollo en distintas partes del mundo12,15,43,44,41. Estas diferencias podrían ser producto por las diferentes estrategias de control biológico usadas en la producción primaria y en salud pública.

Mediante técnicas de secuenciación masiva, se ha observado que existe una alta variabilidad entre las cepas en cuanto a la presencia de genes relacionados con virulencia12,16. Así, se ha observado que algunas cepas carecen de genes involucrados en la biosíntesis de flagelo y lipopolisacáricos, captura de hierro, modificación del ADN, etc. Esto muestra una alta plasticidad genética33,34, lo que facilita la adaptación de esta bacteria a nichos distintos, convirtiéndolo en un patógeno difícil de controlar.

Dentro de los factores de virulencia, el más frecuentemente fue ceuE, que codifica para una lipoproteína involucrada en el transporte de enteroquelina8,45, esencial para la infección. Algunos estudios coinciden con la alta frecuencia de este gen en distintas cepas46, sin embargo, en otros estudios este gen es menos abundante16. Por otro lado, virB 11 se encuentra en 15% de las muestras, todas obtenidas desde carne de pollo, esto es ligeramente superior a lo reportado anteriormente en nuestro país (7,3% de las cepas)9. Otro gen que ha sido analizado en muestras chilenas, en otros trabajos, es cdtB, el cual estaba presente en 100% de las muestras9. Sin embargo, en este artículo no fue incluido. Finalmente, el gen wlaN no fue detectado en ninguna cepa, en forma similar a lo reportado anteriormente en nuestro país47.

En resumen, la alta frecuencia de contaminación de carne de pollo con C. jejuni con cepas resistentes a uno o más antibióticos, sumado a la diversidad genética de las cepas en cuanto a la presencia de factores de virulencias confirman la importancia de vigilar, investigar y controlar C. jejuni en alimentos debido a su alto impacto en salud pública.

Agradecimientos

Proyecto financiado por Fondecyt 11130148 y Proyecto de inserción 791220024.

Fuente de financiamiento: Proyecto financiado por Fondecyt 11130148 y Proyecto de inserción a la academia 791220024.

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Recibido: 06 de Enero de 2017; Aprobado: 28 de Diciembre de 2017

Correspondencia a: Verónica García Mena Departamento de Ciencias y Tecnología de los Alimentos. Facultad Tecnológica. Universidad de Santiago de Chile. Obispo Manuel Umaña 050. Edificio de Alimentos. Estación Central, Santiago, Chile. verónica.garcia@usach.cl

a

Médico veterinario.

b

Ingeniero de Alimentos.

c

Doctor en Ciencias, mención Biología.

d

Bioquímica. PhD.

Autores declaran no tener conflictos de interés.

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