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Revista médica de Chile

Print version ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile vol.145 no.12 Santiago Dec. 2017

http://dx.doi.org/10.4067/s0034-98872017001201559 

Artículo de Investigación

Portación de Staphylococcus aureus enterotoxigénico tipo A, en frotis nasofaríngeos en manipuladores de alimentos

Carriage of Staphylococcus aureus among food service workers

María Paula Alarcón-Lavín1  a

Carolina Oyarzo2  a

Carlos Escudero2  b

Fabiola Cerda-Leal3  c

Francisco J. Valenzuela4  d

1Departamento de Nutrición y Salud Pública, Facultad de Ciencias de la Salud y los Alimentos. Universidad del Bío-Bío. Chillán, Chile

2Laboratorio de Fisiología Vascular, Departamento de Ciencias Básicas, Facultad de Ciencias. Universidad del Bío-Bío. Chillán, Chile

3Laboratorio de Microbiología y Epidemiología Molecular, Departamento de Ingeniería en Alimentos, Facultad de Ciencias de la Salud y los Alimentos. Universidad del Bío-Bío. Chillán, Chile

4Laboratorio de Biología Celular y Molecular, Departamento de Ciencias Básicas, Facultad de Ciencias, Campus Fernando May Universidad del Bío-Bío. Chillán, Chile

ABSTRACT

Background

Staphylococcus aureus produces 11 serotypes of endotoxins that may cause food poisoning.

Aim

To determine the prevalence of type A enterotoxigenic Staphylococcus aureus carriage among food service workers in Chillan, Chile.

Material and Methods

Pharyngeal swabs were obtained from 100 food service workers and were cultured in Agar plates. After identifying the presence of Staphylococcus aureus, DNA was extracted to identify type A toxin by conventional PCR.

Results

Thirty eight percent of samples were colonized with Staphylococcus aureus. Among these, 26% were toxin A producers.

Conclusions

Half of the sampled workers carried Staphylococcus aureus and a quarter of these produced type A enterotoxin.

Key words Staphylococcus aureus; Enterotoxins; Foodborne Diseases

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) son aquellas enfermedades que se originan por la ingestión de alimentos contaminados por patógenos, produciendo síntomas como vómitos, diarreas, dolores abdominales, dolor de cabeza, fiebre, alteraciones neurológicas y otros. Además, ciertas ETA pueden generar enfermedades crónicas y, en casos extremos, la muerte1. Se ha descrito un aumento significativo de ETA, a nivel mundial, estimándose que entre 15 y 70% de los casos de diarrea en menores de cinco años de edad se debe a alimentos contaminados2.

A nivel mundial, las intoxicaciones alimentarias causadas por Staphylococcus aureus enterotoxigénico (SAE) no son notificadas a los sistemas de vigilancia epidemiológica. Estimaciones indican que si los casos aislados diagnosticados fueran reportados, la cifra sería 10 veces mayor al número de brotes reportados3. El subreporte de intoxicación alimentaria estafilocócica (IAE) se debe, principalmente, a que la recuperación normalmente ocurre sin suministro de medicamentos y, frecuentemente, los organismos de salud no la incluyen dentro de las enfermedades de declaración obligatoria, tal como sucede en Estados Unidos de Norteamérica (EE.UU.)4. Se estima que solo de 1-5% de todos los casos de IAE que ocurren en EE.UU. son reportados al Departamento de Salud Pública; y se estima que la IAE corresponde alrededor de 14% del total de las ETA, representando la tercera causa más común de infección bacteriana4. En Francia, SAE es la segunda causa de ETA después de Salmonella spp.5 y en Corea ocupó el segundo lugar entre los agentes bacterianos causales de estas enfermedades6. Antecedentes que sugieren a la IAE como la principal causa de enfermedad alimentaria a nivel mundial3. En Chile, hasta septiembre de 2016, se registraron 885 brotes de ETA con 4.705 casos asociados, cifras que son 13,1% y 17,3% mayores a lo notificado en igual período de 2015, respectivamente. De estos, 30% han sido clasificados con un diagnóstico clínico específico, observándose 16 brotes asociados Staphylococcus aureus (S. aureus)7.

S. aureus es un coco Gram positivo, anaerobio facultativo, se agrupa en racimos pigmentados dorados o blancos, inmóvil, que posee actividad de catalasa y coagulasa, convirtiéndolo en un agente agresivo para el huésped3. Algunas especies de estafilococos son productoras de una familia de proteínas no glicosiladas de bajo peso molecular (masa molecular 22-31.000 kDa), conocidas como enterotoxinas estafilocócicas (SE) que poseen termoresistencia, incluso a 100°C8. S. aureus produce alrededor de 11 serotipos distintos de SE, enterotoxinas que son causantes de intoxicaciones alimentarias3. Se han descrito 8 cepas de S. aureus productoras de las enterotoxinas A-H, que son responsables de las intoxicaciones alimentarias más comunes. En el año 1998, se ha reportado la existencia de al menos dos nuevas variedades9. Sin embargo, tal como fue reportado por Figueroa et al., 2002, y por el Ministerio de Salud de Chile, la enterotoxina tipo A es la más frecuente y duplica la cantidad presente de enterotoxina B (frecuencias de 67,3 y 28,3%, respectivamente)7,8. El S. aureus coloniza preferentemente mucosa y piel de seres humanos9 y puede existir de manera permanente o transitoria como parte de la microflora normal sin causar síntomas en el huésped10, identificándose su presencia principalmente en la zona nasal anterior con 30-40%11.

La ingestión de toxinas de S. aureus es conocida como estafiloenterotoxicosis o estafiloenterotoxemia12, y destaca por su período de incubación menor a tres horas. Las manifestaciones clínicas son náuseas, vómitos intensos, espasmo abdominal y diarrea. Generalmente de evolución favorable entre 24 y 48 h, aun cuando pueden producirse formas graves con hipotensión, hipotermia y shock13.

En América Latina, entre los años 1993 y 2000 se detectaron 191 brotes por IAE con 6.433 afectados y 2 muertos14. En Chile, Prado et al., 200215, reportaron que el año 2000 aumentaron en la Región Metropolitana 37% los casos de brotes de ETA, respecto al año anterior. El 63,5% se originó en los hogares, y 33,1% se produjo por ingesta de alimentos en establecimientos expendedores, destacando S. aureus como uno de los agentes bacterianos más importantes del brote. Se asocia esta contaminación a una inadecuada manipulación y transferencia de la bacteria desde las superficies de trabajo o desde los mismos portadores16.

La portación nasofaríngea de S. aureus es un hallazgo común en la población, según la revisión de Kanafani et al., 200617 se ha documentado la existencia de 20% de portadores persistentes, 60% de portadores intermitentes, constituyendo un serio problema para los manipuladores de alimentos, pues actúan como puente entre los productos alimentarios y los microorganismos18, en cualquier etapa del proceso de elaboración. En otro estudio realizado por Figueroa et al., 20028, en manipuladores de alimentos de Santiago, evidenció que 34% de los individuos analizados estaban colonizados por S. aureus y más de la mitad de ellos eran productores de enterotoxina.

En función de lo anterior y dado la ausencia de reportes en los últimos 10 años que indiquen si esta portación ha cambiado, nosotros proyectamos estimar la prevalencia de portación de S. aureus enterotoxigénico tipo A en manipuladores de alimentos de Chillán. Se sospecha que al menos 10% del grupo de estudio es portador de SAE, antecedentes que podrían aportar a la actualización de la reglamentación sanitaria vigente para los servicios de alimentación en Chile.

Material y Método

Sujetos

Se reclutaron 102 individuos en la ciudad de Chillán, pertenecientes a 16 servicios de alimentación de tres empresas concesionarias. Los criterios de exclusión fueron aquellos individuos que no estaban interesados en participar o quienes al momento de practicar el examen nasofaríngeo estaban bajo tratamiento antibiótico o lo habían terminado dos semanas antes (n = 2). Según estos criterios, se realizó el análisis de prevalencia en 100 manipuladores cuya edades oscilan entre 27-55 años, y al menos 60% de los sujetos se desempeña en la misma labor por al menos 10 años. Los protocolos fueron aprobados por el Comité de Ética y Bioética de la Universidad del Bío Bío, los cuales fueron explicados a los participantes, quienes entregaron su consentimiento informado de acuerdo a las pautas éticas de investigación en humanos (Council for International Organizations of Medical Sciences, WHO).

Las muestras fueron obtenidas de la zona nasofaríngea mediante tórula con medio estéril en un tubo de 1,5 mL (Eppendorf) y trasladadas en refrigeración a 4°C, para ser inoculadas en placas Agar Baird Parker enriquecido con infusión cerebro corazón (BHI) e incubadas 37 °C por 48 h. Se seleccionaron las colonias positivas para S. aureus realizando para su confirmación las pruebas bioquímicas de catalasa y coagulasa. La actividad enzimática de esta última se determinó en plasma de conejo según protocolo.

Ensayo coagulasa y catalasa

Para realizar las pruebas bioquímicas se seleccionaron al menos dos colonias de S. aureus (redondas, bordes lisos, convexas, negras, brillantes, borde blanco fino, halo claro), y se llevaron a cultivo en medio BHI (Brain Heart Infusion Agar, Becton Dickinson, Alemania) según instrucciones de uso del fabricante. Se utilizaron 0,05 ml para realizar la prueba de coagulasa (BBL™ Coagulase Plasmas, Becton Dickinson, USA) según las especificaciones del proveedor. Se confirma la presencia de S. aureus cuando se aprecia cualquier grado de coagulación.

La prueba bioquímica de catalasa se realiza previa selección de colonias de S. aureus que se situaron en una placa de vidrio y a la cual se le agregó 500 μL de agua oxigenada, se confirma la presencia de la bacteria por la generación de burbujas de oxígeno en la solución.

Extracción de ADN y PCR

Para extraer el ADN de las muestras, fueron tratadas previamente con 2,5 mg de lisozyma (US Biological life Science, USA) y resuspendida en 2 mL de fosfato de potasio al 0,1 M, incubada a 37°C por 60 min y luego centrifugadas. El pellet se incuba con 600 uL de Nucleilysis solution a 80°C por 5 min. Luego se continúa con los pasos de purificación y lavado según el instructivo del proveedor del kit Wizard Genomic DNA Purification (Promega, USA). Se resuspende el ADN en agua libre de nucleasas y se cuantifica la concentración por absorbancia 260 nm almacenando a −20°C.

Los partidores utilizados para amplificar S. aureus tipo A fueron publicados por Brizzio et al, 2013, y corresponden a la siguientes secuencias; SA-U: 5′-TGTATGTATGGAGGTGTAAC-3′y SA-A: 5′-ATTAACCGAACGTTCTGT-′3 sintetizados en Integrated DNA Technologies (IDT DNA, USA) y cuyo amplicón corresponde a un fragmento de 270 pb. En la reacción de amplificación, se utilizó el 0,5 uL de dNTPs 10 mM, 5 uL de 5 x Green buffer (Promega, USA), 0,125 uL GoTaq 5U/mL (Promega, USA), 10,0 uL de agua libre de nucleasas (Winkler, Chile), 2 uL MgCl 2 (25 mM, Promega, USA) y 2,5 uL de Primer Forward o Reverse (100uM). Los ciclos de temperatura fueron una denaturación inicial de 94°C por 5 min y 40 ciclos de 94°C por 30 segundos, 54-56-60°C por 1 min, 72°C por 1 min. Finalmente, se realiza una extensión de 72 °C por 10 min para dejar un enfriamiento final a 4°C, utilizando rangos de sustrato que van de 10, 100 y 1.000 ng. Posteriormente, se corren geles de agarosa a 1,2% en buffer TAE a 100 volt por 40 min, se determinó que la temperatura óptima del PCR fue 54°C a una concentración de 5 y 2 ng.

Análisis estadístico

Los datos de frecuencia fueron analizados por Chi cuadrado (χ2) y test de Fischer, por entregar un P exacto. Los valores significativos son considerados cuando p < 0,05. El tamaño muestral se calculó usando el programa Graph Pad Stat Mateversion 2.00 for Windows (Graph Pad Software, San Diego California, USA), www.graphpad.com”. Stat Mate.

Resultados

Nuestro objetivo fue observar los cambios de prevalencia de S. aureus enterotoxigénico tipo A en los sujetos manipuladores de alimentos. En este contexto, del total de muestras nasofaríngeas analizadas, 38 estaban colonizadas por S. aureus, a partir de los ensayos bioquímicos de coagulasa y catalasa (Tabla 1), correspondiendo a 38% de la población estudiada. En estos sujetos positivos para la bacteria, se realizó PCR convencional para amplificar la enterotoxina tipo A (Figura 1A), con un fragmento de 270 pb. En este ensayo de PCR, se identificó que 26,3% (10 manipuladores) de los individuos S. aureus positivos eran productores de enterotoxina tipo A, lo que corresponde a 10% del grupo total de estudio, genotipo positivo que no necesariamente refleja una producción de la toxina.

Tabla 1 Frecuencia fenotípica para ensayos de catalasa, coagulasa y enterotoxina tipo A 

Fenotipo Catalasa Coagulasa Enterotoxina Tipo A p-value* OR [95% Conf. interval]
(+) 38 38 10 p < 0,0001 5.516 2.559-11.89
(-) 62 62 90

*El análisis de frecuencia fue realizado por Chi-square test.

Figura 1 Caracterización de los sujetos estudiados. (A) Foto representativa de la amplificaciónde los ADN de las muestras nasofaríngeas mediante PCR convencional con partidores específicos para la enterotoxina A. Los pacientes positivos (+) corresponden a una banda de 270 pb, y a la derecha se puede observar el estándar de peso molecular (St). (B) Edades promedios de los manipuladores negativos y positivos por ensayos bioquímicos para S. aureus. (C) Frecuencia de ensayos bioquímicos y de PCR para individuos de 18-37 años y 38-64 años. 

En los sujetos negativos y positivos para S. aureus, no había diferencias significativas en la edades promedios, 39 ± 11,6 y 42 ± 13,2, respectivamente (Figura 1B). Además, se pudo observar una tendencia a una mayor prevalencia de S. aureus en individuos mayores de 38 años, tal como se observa en la Figura 1C, donde se puede apreciar las frecuencias de los ensayos bioquímicos positivos para coagulasa y catalasa.

Dos tercios de las empresas de alimentación colaboradores de este estudio (84% de la muestra total de sujetos) no tenía como requisito de ingreso la realización de examen nasofaríngeo para detección de S. aureus, y su política interna establecía que este solo realizará si la empresa que contrata su servicio lo establece como exigencia. Tan solo una empresa (correspondiente a 16% de la muestra), exigía un examen nasofaríngeo para la detección de S. aureus como un requisito de ingreso y establecía como política interna la repetición de este examen cada 6 meses.

Discusión

Los resultados de prevalencia obtenidos de esta investigación se relacionan con los detectados en un estudio realizado por Figueroa et al., 20028, donde se evidenció que 34% de los individuos analizados estaban colonizados por S. aureus y 58% de las cepas aisladas de S. aureus producía enterotoxina A. En nuestro estudio, observamos un aumento de 4% en la portación de la bacteria en la población estudiada, y de estos, 26,3% son productores de la enterotoxina A, caracterización genotípica que va de la mano con la producción de la proteína enterotoxigénica en 100% de los casos, según estudio de Kérouanton et al., 200719. Este aumento se puede deber a la contaminación cruzada entre manipuladores de alimentos, por inadecuado uso de la mascarilla o eventualmente a un aumento en la portación de esta bacteria en la población.

La contaminación de los alimentos por S. aureus está asociada a una incorrecta manipulación de alimento por parte de aquellos portadores que no emplean las medidas higiénicas adecuadas para realizar este tipo de actividad. Por lo señalado, es preocupante que las empresas de alimentación no tengan establecido como política interna, la realización de examen que asegure que el manipulador de alimentos no es portador de S. aureus productor de enterotoxina. Ello es más relevante aun considerando que la portación nasofaríngea de este patógeno es un hallazgo común en la población, al menos 80%, entre portadores persistentes e intermitentes, según el estudio de Kanafani et al., 200617. Puesto que al ser estos individuos los que intervienen en la elaboración de productos alimentarios generan un potencial riego de IAE para la población. No obstante lo anterior, durante el período de esta investigación no se observaron brotes de ETA en los servicios de alimentación involucrados.

La normativa chilena vigente (D.S. N° 977) señala que cualquier persona que trabaje en manipulación de alimentos deberá mantener un estado de salud que garantice que no representa riesgo de contaminación de los alimentos que manipule20, pero no establece exámenes a realizar ni su periodicidad. Sumado a lo anterior, la Norma Técnica para los Servicios de Alimentación y Nutrición año 2005 expresa que: “el personal operativo deberá a su ingreso y posteriormente una vez al año, realizarse un examen de salud completo, el que deberá certificar que el funcionario no es portador de enfermedades que puedan contagiarse a través de los alimentos, tales como fiebre tifoidea, hepatitis, S. aureus, ni enfermedades de la piel; en forma activa”21.

El aumento en la prevalencia de S. aureus detectado en nuestra investigación sugiere la necesidad de incrementar los estudios de la prevalencia en la portación de SAE en manipuladores de alimentos, generando políticas que permitan reducir progresivamente los indicadores entregados por el Instituto de Salud Pública de Chile, donde se señala que del total de cepas confirmadas de S. aureus con enterotoxinas (Boletín Instituto de Salud Pública de Chile, 2011-2012), las toxinas más frecuentes fueron la A y B.

Financiamiento: DIUBB 1438202/l.

Referencias

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Recibido: 17 de Marzo de 2017; Aprobado: 07 de Noviembre de 2017

Los autores no declaran conflictos de interés.

a

Nutricionista. Magíster.

b

PhD.

c

Biólogo. Magíster.

d

Bioquímico. PhD.

Correspondencia a: Mg María Paula Alarcón Lavín mpalarcon@ubiobio.cl

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