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Boletín de la Sociedad Chilena de Química

versión impresa ISSN 0366-1644

Bol. Soc. Chil. Quím. v.45 n.4 Concepción dic. 2000

http://dx.doi.org/10.4067/S0366-16442000000400015 

DESARROLLO DE UN METODO POR CROMATOGRAFIA EN CAPA
FINA INSTRUMENTAL PARA ANALISIS CUANTITATIVO DE
ACIDO
ACETILSALICILICO.

S.MENNICKENT1*, M.VEGA2, C.G.GODOY1, T.YATES1

1Departamento de Farmacia, Facultad de Farmacia, Universidad de Concepción, Casilla
237, Concepción, Chile.
2Departamento de Bromatología, Nutrición y Dietética, Facultad de Farmacia, Universidad
de Concepción, Casilla 237, Concepción, Chile.
(Recibido: Octubre 14, 2000 - Aceptado: Agosto 14, 2000)

RESUMEN

Se desarrolló y validó un método por cromatografía en capa fina instrumental (HPTLC) para cuantificar ácido acetilsalicílico.

La validación del método indicó que éste es lineal entre 100 y 600 ng/mancha, con un coeficiente de regresión de 0,996. Presentó buena repetibilidad y reproducibilidad (desviación estándar relativa entre 2,1 y 3,5% y entre 4,8 y 6,0%, respectivamente) y una exactitud promedio de 99%. Además, demostró ser selectivo para el principio activo ensayado, lo que lo hace adecuado para su análisis cuantitativo.

Palabras claves: HPTLC (cromatografía en capa fina instrumental), análisis cuantitativo, ácido acetilsalicílico, validación, medicamentos.

ABSTRACT

A High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC) method was developed and validated to determine quantitatively acetylsalicylic acid.

The results proved that the method is linear between 100 and 600 ng/spot, with repeatability (RSD = 2,1-3,5%), reproducible (RSD = 4,8-6,0%), accurate (99%) and selective for tested sustance. In conclusion, it is an adequate method for its quantitative analyses.

Keywords: HPTLC (High performance thin layer chromatography), quantitative analysis, acetylsalicylic acid, validation, drugs.

INTRODUCCION

El ácido acetilsalicílico es el analgésico-antiinflamatorio-antipirético más usado en todo el mundo. Se estima que la cantidad de este fármaco consumida solo en los Estados Unidos es del orden de las 200.000 toneladas al año.1)

Producto de su estructura química es estable en aire seco, pero en contacto con la humedad se hidroliza lentamente 1,2,3,4), degradación que depende principalmente de la presión de vapor de agua y de la temperatura (factores medioambientales).4)

Por esto es importante cuantificar el ácido acetilsalicílico presente en sus especialidades farmacéuticas, como modo de asegurar una terapia adecuada.5,6)

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es el método de elección para la mayoría de los protocolos de análisis de medicamentos.7) Sin embargo, ya que se requiere analizar un gran número de especialidades farmacéuticas del principio activo, y, por ende numerosas muestras, sin que ello demande un tiempo considerable y un alto costo, es que en el presente trabajo se valida y propone un método analítico por HPTLC para cuantificar ácido acetilsalicílico. Esta técnica posee importantes ventajas sobre otros métodos cromatográficos, pues no requiere de purificaciones exhaustivas, utiliza cantidades mínimas de solventes, es una metódica rápida y, además, por ser un sistema abierto, permite analizar distintas muestras y diferentes analitos en forma simultánea, lo que se traduce en economía de tiempo, materiales y reactivos. 8)

PARTE EXPERIMENTAL

MATERIALES Y REACTIVOS:

Para el estudio se utilizó ácido acetilsalicílico estándar USP. Todos los reactivos fueron de calidad proanálisis.

Las soluciones de ácido acetilsalicílico se prepararon en acetonitrilo/ácido fórmico (99:1) como solvente. 2)

CROMATOGRAFIA:

La cromatografía se realizó en placas HPTLC de sílica gel F254, previamente lavadas con metanol y activadas a 130ºC por 30 minutos.

La siembra de las muestras se realizó en bandas de 3 mm mediante el uso de un aplicador semiautomático Linomat IV.

Se probó como fase móvil acetato de etilo + metanol + ácido acético glacial (80+19+1, v/v)9), y ciclohexano +cloroformo + ácido acético glacial (60+5+5, v/v)10). Los Rf fueron de 0,8 y de 0,15, respectivamente. La longitud de desarrollo fue de 5 cm, en un tiempo aproximado de 10 minutos para la primera y de 2 cm, en un tiempo aproximado de 17 minutos para la segunda fase móvil. Se eligió la segunda, ya que ésta permite visualizar mejor las manchas, las cuales quedan más separadas del frente de solvente. Se utilizaron cámaras de desarrollo verticales.

Las lecturas se realizaron por densitometría. Para esto se utilizó un espectrodensitómetro Scanner Camag III acoplado a un computador con software CATS versión 4,05, y como fuente de radiación una lámpara de deuterio.

ESPECTROGRAMA DE ABSORCION:

La longitud de onda de máxima absorción (231 nm) se determinó realizando un espectrograma in situ del compuesto cromatografiado.

VALIDACION DEL METODO:

Los parámetros analíticos que se validaron fueron linealidad, límites de detección y de cuantificación, precisión, exactitud, selectividad y robustez.

La validación se llevó a cabo según normas internacionales 2,11,12) y utilizando estimadores estadísticos apropiados (desviación estándar relativa, t de student, análisis de varianza).11,13)

LINEALIDAD:

Para establecer el rango de linealidad del método se elaboró una curva de calibración mediante la aplicación de concentraciones del estándar entre 100 y 600 ng por mancha. Las siembras se hicieron en triplicado.

LIMITES DE DETECCION Y DE CUANTIFICACION:

Para su obtención se trabajó con concentraciones de analito que estuviesen en la parte inferior del rango lineal de la curva de calibración. Para esto se prepararon soluciones de concentraciones de 50, 75 y 100 ng/uL, cada una de las cuales se sembró tres veces (1 uL cada vez).

PRECISION:

Para este estudio se utilizaron soluciones de ácido acetilsalicílico de 100, 300 y 500 ng/uL. Estas cubren el rango lineal determinado (siembra: 1uL).

Para evaluar la repetibilidad del método se prepararon cinco soluciones de cada concentración, cada una de las cuales se sembró tres veces.

Para evaluar la reproducibilidad se trabajó con una solución de cada concentración, cada una de las cuales se sembró tres veces y durante cinco días.

EXACTITUD:

Se evaluó utilizando comprimidos comerciales de ácido acetilsalicílico. Se prepararon seis soluciones, de las cuales a tres se les hizo recarga basal con ácido acetilsalicílico estándar, para calcular el porcentaje de recuperación.

SELECTIVIDAD:

Para evaluar la selectividad del método se preparó una solución de ácido acetilsalicílico más ácido salicílico. Se utilizó el ácido salicílico por tratarse del principal producto de degradación del ácido acetilsalicílico. La solución se preparó a una concentración de 300 ng/uL de ácido acetilsalicílico y 150 ng/uL de ácido salicílico. Se sembró cinco veces, obteniéndose un Rf de 0,22 para el ácido acetilsalicílico y de 0,27 para el ácido salicílico. Las concentraciones obtenidas fueron de 304,3 ng/uL para el ácido acetilsalicílico y de 149,6 ng/uL para el ácido salicílico.

ROBUSTEZ:

La robustez del método se evaluó cambiando la proporción de los componentes de la solución para diluir muestras, y la proporción de los solventes de la fase móvil. Se trabajó con soluciones de 100, 300 y 500 ng/uL.

Como se mencionó, la solución para diluir las muestras fue de acetonitrilo/ácido fórmico (99:1, v/v). Se estudió el efecto que tenía en los resultados el cambio de esta proporción a 90:10, v/v. La proporción de los solventes de la fase móvil se cambió de 60:5:5 a 50:10:10, v/v.

RESULTADOS Y DISCUSION

El método resultó lineal entre 100 y 600 ng/mancha, con un coeficiente de regresión de 0,996 y un p de 0,0001. (Fig. 1.)


Para la determinación de los límites de detección y cuantificación se graficó la cantidad de analito por mancha versus respuesta (área del pico) promedio y se determinó la ecuación de esta recta, obteniendo de ella una estimación de la respuesta del blanco: ybl11) (Fig. 2).


El valor de ybl corresponde al intercepto de la curva, y resultó ser de 6,48. El coeficiente de regresión fue de 0.999.

Posteriormente se obtuvo una segunda curva, graficando cantidad de analito por mancha versus desviación estándar de las respuestas. De la ecuación de esta recta se obtuvo una estimación de la desviación estándar del blanco: sbl.11) que corresponde al intercepto de esta curva, que resultó ser de 5,92.

Los límites de detección y de cuantificación se calcularon mediante las ecuaciones: 11)límite de detección = (ybl + 3sbl)/b; límite de cuantificación = ( ybl + 10sbl)/b donde "b" es la pendiente de la curva de calibración obtenida en el estudio de linealidad.
El límite de detección resultante fue de 3 ng/mancha, y el de cuantificación de 9 ng/mancha.

Los resultados del estudio de precisión fueron una desviación estándar relativa entre 2,1% y 3,5% (n=5) para la repetibilidad, y entre 4,8% y 6,0% (n=10) para la reproducibilidad.

El porcentaje promedio de recuperación fue de 99%, con una desviación estándar de 5,01 y una desviación estándar relativa de 5,06% (n=15).

El intervalo de confianza del 95% fue de 96,271- 101,823. El test de student permitió concluir que no existen diferencias significativas entre recuperación media y 100 (tobservado= 0,76; ttabulado (grados de libertad=14, alfa = 0,05) = 1,76).

El método permite la separación del ácido acetilsalicílico y del ácido salicílico con una resolución de 1,5, lo cual indica que bajo las condiciones establecidas, es selectivo para el principio activo estudiado. (Fig.3).

Para estudiar la influencia del cambio de los parámetros considerados en la robustez del método se realizó análisis de varianza de los resultados obtenidos, mediante el diseño de experimento factorial.13)

El cambio de proporción de los componentes de la solución para diluir muestras dió un Fc = 1,03 y un Ftab. = 9,33 (alfa =0.01), lo que permitió concluir que no existen diferencias significativas en los resultados al usar una u otra proporción. Por tanto, ante esta variación de condiciones, el método es robusto (Fc: valor F calculado; Ftab : valor F tabulado. Distribución F).

Sin embargo, el cambio de proporción de los solventes de la fase móvil arrojó diferencias significativas entre los resultados, al emplear una proporción u otra (Fc = 37,89; y Ftab = 9,33) (alfa = 0,01). Esto indica que se debe ser muy riguroso en las medidas de los volúmenes de los solventes de la fase móvil, de modo de garantizar óptimos resultados.


CONCLUSIONES

El método validado presentó una buena linealidad entre las concentraciones empleadas en el estudio, como así mismo resultó preciso, exacto y selectivo para el principio activo ensayado.

Estos resultados permiten postular que es una buena alternativa al método oficial (USP) por HPLC para análisis cuantitativo de ácido acetilsalicílico.

AGRADECIMIENTOS

Se agradece a los Departamentos de Farmacia y de Bromatología, Nutrición y Dietética, como también a la decanatura de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Concepción, Concepción, Chile, por el apoyo financiero y de equipos y materiales para la realización de este trabajo. Se agradece a la Dirección de Investigación de la Universidad de Concepción, por su apoyo a través de los proyectos nº 957420-1.1 y 97071022-1.0; y al profesor Víctor Hugo Jaramillo Mena (Q.E.P.D) por su asesoría en el estudio de validación estadística.

*Este trabajo forma parte de la tesis de Magister en Ciencias Farmacéuticas de la profesora Sigrid Mennickent Cid.

REFERENCIAS

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4. The Pharmaceutical Society of Great Britain. "The Pharmaceutical Codex". 11ºEd. The Pharmaceutical Press, London, (1979)        [ Links ]

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