ANÁLISIS DE LA FRACCCIÓN LIPÍDICA DE LA YEMA DE HUEVOS
POR AMD-HPTLC.

Carolina E. Figueroa¹, Mario H. Vega¹, Roberto F. Saelzer¹,
Gisela G. Ríos¹, Hernán Rodríguez².

¹Departamento de Bromatología, Nutrición y Dietética, Facultad de Farmacia, Universidad de Concepción, Chile.

²Departamento de Producción Animal, Facultad de Agronomía, Universidad de Concepción, Chile.

(Recibido: Diciembre 4, 2001 - Aceptado: Enero 3, 2002)

RESUMEN

Se desarrolló y validó un método por cromatografía planar instrumental (HPTLC) empleando una cámara de desarrollo múltiple automático (AMD), para la determinación de colesterol libre en yema de huevos con bajo contenido de colesterol. Se estableció el gradiente que permitió la separación, identificación y cuantificación simultánea de colesterol, fosfatidilcolina y trioleina. Se evaluó el porcentaje de recuperación a través de un procedimiento de adición estándar de colesterol con un rendimiento de 99,4%. La Repetibilidad y Repetibilidad intermedia resultaron adecuadas sobre la base del análisis de diferencia de medias a un nivel del 95% de confianza.

Palabras claves: Colesterol, fosfatidilcolina, trioleína, HPTLC-AMD, densitometría.

SUMMARY

An Instrumental Planar Chromatographic Method (HPTLC) with Automatic Multiple Development Chamber (AMD) for the cholesterol analysis in egg yolk obtained from hens fed with diet to reduce the cholesterol content, was set up and validated. The gradient to achieve the simultaneous separation, identification and quantification of cholesterol, phosphatidylcholine and triolein was established. Recovery was evaluated through a standard addition procedure with a yielding of 99,4%. Repeatability and Intermediate Repeatability resulted adequate on the ground of Media Difference analysis at a confidence limit of 95%.

Key words: Cholesterol, phosphatidylcholine, triolein, HPTLC-AMD, densitometry

INTRODUCCIÓN

El incremento de las patologías generadas por el consumo de dietas ricas en grasas saturadas, ha significado un incremento en las investigaciones orientadas a la producción de alimentos de tipo; "bajos", "livianos", o "reducidos" en grasas, calorías, sodio o colesterol (1-5).

Todas las formas para enfrentar la problemática planteada hacen necesario contar con procedimientos analíticos que permitan el análisis de los componentes en cuestión. En el caso de los lípidos, específicamente ácidos grasos, la cromatografía de gases ha sido el método de elección (6-8). En el caso del colesterol hay una mayor variedad de metodologías, incluidas la espectrofotometría directa o asociada a los métodos enzimáticos y la cromatografía líquida, tanto en columna (HPLC) como planar (TLC y HPTLC) (9-14), además de la cromatografía de gas (15-16).

En el presente trabajo, la versatilidad de la cromatografía en capa fina instrumental (HPTLC), unida a la alta resolución que le otorga el empleo de la cámara de desarrollo múltiple automático (AMD), permitió desarrollar un método para separar, identificar y cuantificar fosfolípidos (fosfatidilcolina), triglicéridos (trioleína) y colesterol total en un solo procedimiento de extracción y purificación desde una matriz compleja como lo es la yema de huevos. En este caso particular, se aplica a huevos obtenidos de ponedoras alimentadas con dietas conducentes a disminuir el contenido del colesterol.

PARTE EXPERIMENTAL

Materiales y Reactivos

Estándares de fosfatidilcolina, colesterol, trioleína y androstenediona de procedencia Sigma Chemical Co. (St. Louis, M.O.-USA).

Solución de revelado: 0,2 g de Cloruro de Manganeso + 30 ml de Agua + 30 ml de Metanol + 2 ml de Ácido Sulfúrico concentrado.

Cromatoplacas extra delgadas de Silicagel 60 F₂₅₄, HPTLC 20 X 10 cm, Merck. (Alemania).

Todos los reactivos fueron de grado analítico. Merck. (Alemania).

Instrumental

Aplicador de muestra Linomat IV y ATS III, Cámara de Desarrollo Múltiple Automático (AMD), Revelador por inmersión (Dipping Device III), Espectrofotodensitómetro HPTLC Scanner 3 con Software CATS 4.05. Todos los equipos indicados son de procedencia, Camag. (Muttenz, Suiza).

Preparación de soluciones estándar y muestras

Estándares

Las soluciones de los estándares se prepararon a una concentración de 1 mg / ml en Ciclohexano + Etanol, (50+50; v/v.) y a partir de estas se obtuvo las soluciones de trabajo a una concentración entre 25 y 300 ng/m l para fosfatidilcolina y trioleína. Para el colesterol las concentraciones de trabajo se prepararon entre 25 y 150 ng/m l.

Muestras

Separada la yema de la clara, se homogeneizó con ayuda de una barra de ultrasonido Cole-Palmer Instrument Co. Se pesaron 150 mg de yema homogeneizada en un tubo de ensayo con tapa rosca de 22 ml de capacidad. La extracción de los lípidos se realizó por el procedimiento de Bligh and Dyer (17), para lo cual se agregaron 4 ml de Metanol que contenía 0,75 mg / ml de Androstenediona como estándar interno. Al homogeneizado se agregaron 2 ml de cloroformo y se agitó por dos minutos en el agitador de tubo (Maxi Mix II, Thermolyne.) A continuación se agregaron 2 ml de agua y se agitó por dos minutos más. Posteriormente se agregaron 3 ml adicionales de cloroformo y después de agitar se dejaron separar las fases. Finalmente se tomó una alícuota de la fase clorofórmica la que se diluyó quince veces para realizar la separación cromatográfica. La Figura 1, muestra el esquema del procedimiento de extracción de los lípidos de la yema de huevo.

Fig. 1 Esquema del procedimiento de extracción para lípidos de yema de huevo.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Gradiente para la separación de las fracciones lipídicas

El gradiente optimizado que permitió la separación de fosfatidilcolina, androstenediona, colesterol y trioleína se muestra en la Figura 2.

Una vez terminado el desarrollo cromatográfico, la visualización de los lípidos se realizó por inmersión de la placa en el reactivo de cloruro de manganeso con posterior calentamiento en estufa a 110°C por 10 minutos. Los lípidos aparecen en la placa como manchas fluorescentes en un fondo oscuro, cuando se observan a luz UV de 366 nm. La Figura 3, muestra los densitogramas del barrido de una pista de muestra y una de estándares. La Figura 4 muestra las curvas de calibración para los tres tipos de lípidos estudiados.

Fig. 2 Gradiente de Separación optimizado para los lípidos de la Yema de Huevo.

 

Fig. 3 Densitogramas de una pista de estándar (a) y una muestra (b).

Fig. 4 Curvas de calibración para la determinación de Fostatidilcolina (a), colesterol (b) y Trioleina (c).

Límite de detección y de cuantificación del método

Los límites de detección y cuantificación del método para colesterol y fosfatidilcolina se determinaron de acuerdo al procedimiento de Quattrocchi (18) por una estimación a partir de la curva de regresión, por extrapolación a concentración cero. La Tabla 1 indica los limites detección y cuantificación del método propuesto.

Tabla 1. Limites de Detección y Cuantificación para fosfatidilcolina, colesterol y trioleina.

ANALITO	Limite de Detección ng/mancha	Limite de Cuantificación ng/mancha
Fosfatidilcolina	6,9	21,2
Colesterol	2,6	4,0
Trioleina	3,4	8,7

Repetibilidad y Repetibilidad Intermedia

Para determinar la precisión del método se realizaron estudios de Repetibilidad (ensayos realizados el mismo día) y Repetibilidad intermedia (ensayos realizados en diferentes días). Para ello se analizaron diez extractos, los que se aplicaron en triplicado para su cuantificación. Este procedimiento se repitió en un lapso de dos semanas por dos veces.

La Tabla 2 muestra los resultados del estudio de Repetibilidad y Repetibilidad intermedia del método.

Tabla 2. Repetibilidad y Repetibilidad intermedia de fosfatidilcolina, colesterol y trioleina, expresados como mg/g de yema.

Primer Ensayo				Segundo Ensayo
	Fosf-colina mg/g	Colesterol mg/g	Trioleina mg/g	Fosf-colina mg/g	Colesterol mg/g	Trioleina mg/g
1	67,6	23,8	138,1	65,4	24,5	142,1
2	64,6	23,6	142,0	60,3	23,9	131,4
3	64,7	23,6	140,5	67,4	24,4	133,4
4	64,9	24,5	152,5	68,1	24,8	149,5
5	68.9	25,1	150,9	68,5	25,0	142,3
6	69.9	24,6	148,6	60,2	23,6	139,7
7	67.5	24,2	144,8	64,7	24,3	150,7
8	66.5	22,5	141,6	65,5	24,7	141,2
9	64.2	22,3	139,3	65,2	23,2	144,2
10	--------	---------	---------	60,0	23,4	139,8
C	66,5	23,8	144,3	64,5	24,2	141,4
D.E	2,1	0,94	5,26	3,3	0,62	6,1
CV	3,1	3,9	3,6	5,1	2,6	4,3

Evaluación del Método de Extracción.

El método Bligh and Dyer utilizado para la extracción de la fracción lipídica del huevo, es un método reconocido por su simpleza y efectividad para la extracción de lípidos en alimentos. La base de este método se utilizó para analizar las muestras de la investigación, evaluando el porcentaje de extracción para colesterol libre. Esto se realizó mediante una adición estándar de este analito en la solución extractante. La cantidad de colesterol adicionada a la muestra fue equivalente a una concentración de 30,13 mg de colesterol por gramo de yema. Los resultados obtenidos en la evaluación del método de extracción se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. Evaluación del método de extracción de colesterol en yema de huevo.

Muestra	Nivel Base mg/g	Muestra con sobrecarga mg/g
1 2 3 4 5	26,07 23,95 26,56 26,96 26,62	57,26 57,00 54,96 54,43 55,59
Promedio	26,02	55,85
Diferencia	29,83
% Extrac.	99,4 %

Evaluación Estadística de los ensayos para determinar la Reproducibilidad del Método.

La Reproducibilidad del método para los análisis fosfatidilcolina, colesterol y trioleína se determinó con los datos obtenidos en el análisis de Repetibilidad y Repetibilidad intermedia del método, mediante un análisis de diferencia de medias para los tres analitos con un 95 % de confianza. Para este análisis, se asumió que la varianza poblacional entre los datos obtenidos el primer día de análisis son iguales con las del segundo día. Los resultados obtenidos son los que se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4. Intervalos de Confianza para las medias de los diferentes analitos.

Analito	Diferencia entre Medias con 95% de nivel de Confianza
Fosfatidilcolina	- 0,57 y 4,77
Colesterol	-1,14 y 0,38
Trioleina	-2,69 y 8,34

Como las tres diferencias entre medias pasan por cero, esto indica que no existiría diferencia significativa con un 95 % de confianza entre las medias de las réplicas entre el primer y segundo día de análisis.

CONCLUSIONES

El método propuesto para la separación, identificación y cuantificación de colesterol, fosfatidilcolina y trioleína en yema de huevo por HPTLC - AMD, resultó eficiente y versátil con límites de detección y cuantificación acordes con la concentración de los analitos a determinar en las muestras.

El método de extracción presenta un porcentaje de recuperación para el Colesterol de un 99,6 %.

El método demostró tener una Repetibilidad y Repetibilidad intermedia adecuada expresada a través del análisis de diferencia de medias.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue respaldado por el Proyecto Fontec 97-0995.

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