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Revista chilena de pediatría

Print version ISSN 0370-4106

Rev. chil. pediatr. vol.90 no.2 Santiago Apr. 2019

http://dx.doi.org/10.32641/rchped.v90i2.674 

ARTÍCULOS ORIGINALES

Hormona de crecimiento en sangre de papel filtro para el diagnóstico de deficiencia de hormona de crecimiento

G. Domínguez-Menéndez1 

L. Cifuentes1  2 

C. González3  5 

M. Lagos1  4 

T. Quiroga1  4 

H. Rumié1  5 

C. Torres6 

A. Martínez-Aguayo1  5 

1 Pontificia Universidad Católica de Chile, Chile.

2 Programa de Salud basada en Evidencia, Chile.

3 Tecnólogo Médico, Chile.

4 División de Laboratorios Clínicos, Chile.

5 Sección de Endocrinología, División de Pediatría, Escuela de Medicina, Chile.

6 Endocrinología Pediátrica, Hospital Guillermo Grant Benavente, Concepción, Chile.

Resumen:

Introducción:

El diagnóstico de deficiencia de hormona de crecimiento (DHC) es difícil de estable cer, y se puede asociar a serias complicaciones, especialmente en el período neonatal. La prueba de estímulo de secreción de hormona de crecimiento (HC) se considera de elección para el diagnóstico, pero presenta complicaciones metodológicas y se asocia a efectos adversos. Los neonatos presentan aumento de la secreción de HC de forma fisiológica, siendo una ventana diagnóstica.

Objetivo:

Eva luar si la muestra de sangre en papel filtro tomada en el período neonatal, en contexto del tamizaje neonatal de hipotiroidismo congénito y fenilcetonuria, permite diferenciar pacientes con DHC, de los que no la presentan.

Pacientes y Método:

Estudio de casos y controles mediante determinación de concentración de HC en sangre de papel filtro extraída en período neonatal, comparando controles con DHC con casos con deficiencia descartada. Se realizó extracción de la muestra del papel filtro, obteniendo dos discos de 0,125 pulgada por cada uno de los pacientes desde el centro de la mancha de sangre del papel, para un ELISA de HC humana altamente sensible basado en el uso de anticuerpos policlonales dirigidos contra la HC humana recombinante de 22kDa de peso molecular.

Resulta dos:

Se obtuvo un total de 7 casos de DHC y 10 controles. La mediana de concentración de HC de papel filtro en los casos es 2,0 ng/ml (Rango intercuartil 3,6 ng/ml) y controles 2,05 ng/mL (RIC 2,0 ng/ml), U de Mann-Withney 30,5 (p = 0,68). Los dos casos con deficiencia de hormonas hipofisarias múltiples (DHHM) presentan concentraciones menores a 1 ng/ml.

Conclusión:

La muestra de papel filtro no permitió diferenciar a los pacientes con DHC de los casos controles, aunque los casos con DHHM presentaron concentraciones mucho menores, en comparación a la deficiencia de hormona de crecimiento aislada (DHCA).

Palabras clave: Déficit hormona de crecimiento; glándula pituitaria; muestra de sangre en papel filtro; enanismo

Introducción

La deficiencia de hormona de crecimiento (DHC) es una causa poco frecuente de talla baja, pero pue de asociarse a alteraciones metabólicas graves, dentro de ellas la hipoglicemia, especialmente en el período neonatal. Se estima una prevalencia de 1 en 4.000 a 1 en 10.0001. El diagnóstico de DHC en la infancia y la adolescencia presenta múltiples controversias. Los métodos de diagnóstico utilizan elementos clínicos y auxológicos, pruebas bioquímicas del eje de la hormo na de crecimiento y el factor de crecimiento insulino simil tipo 1 (IGF-1, por sus siglas en inglés), elementos radiológicos y en algunos casos incluyen estudios gené ticos. Para la confirmación del diagnóstico se utilizan distintas pruebas de estímulo farmacológicas (clonidina, arginina, levodopa, glucagón, entre otras) y fisioló gicas (prueba de ejercicio y determinación de hormona de crecimiento durante el sueño) para la secreción de hormona de crecimiento (HC). Existen distintos pro tocolos para el estudio de la producción de hormona de crecimiento mediante fármacos que estimulan su secreción. Las pruebas de estímulo no están estandarizadas, y muchas de ellas se asocian a efectos adversos, por lo que en algunos centros están contraindicadas en niños menores de 2 años. Por lo tanto, es necesario encontrar nuevos métodos diagnósticos más estanda rizados y confiables.

Actualmente no contamos con métodos más es pecíficos y reproducibles para realizar el diagnóstico definitivo de DHC, especialmente en los pacientes lac tantes y preescolares. Se han buscado métodos alternativos para realizar el diagnóstico en estos pacientes, entre ellos el uso de muestras de papel filtro tomadas para el tamizaje neonatal de hipotiroidismo congénito y fenilcetonuria. Esto se fundamenta en base a que en los primos días de vida hay una secreción aumentada de HC de forma espontánea3, siendo un período de ventana de diagnóstico de la suficiencia de producción de HC, concentración que se mantiene aumentada por mayor tiempo en los recién nacidos de pretérmino. Los casos con DHC deberían presentar una secreción disminucida de HC en este período, no produciendo el aumento fisiológico de HC de todos los recién nacidos. Se ha planteado determinar la concentración HC en la muestra de papel filtro neonatal como un elemento más en el estudio de la función del eje somatotropo. Binder et al.4 demostraron la utilidad de este método en pacientes con DHHM, no así en pacientes con defi ciencia de HC aislada (DHCA).

El objetivo de nuestro trabajo es determinar si la muestra de sangre de papel filtro extraída en el período neonatal permite discriminar a los pacientes que tie nen deficiencia congénita de hormona de crecimiento, tanto aislada como asociada a deficiencia de otras hor monas hipofisarias, de los pacientes a los que se les ha descartado ésta patología.

Pacientes y Método

Sujetos y controles

Se realizó un estudio de casos y controles. Como casos se seleccionaron pacientes con diagnóstico de DHC, nacidos en la Red UC-Christus entre los años 2010 y 2017, basados en al menos una prueba de estí mulo alterada de secreción de HC; con una concentra ción plasmática menor o igual a 7,0 ng/ml (punto de corte utilizado como referencia en la guía del Ministe rio de Salud de Chile para el tratamiento de deficiencia de HC, no publicado)1, asociados a criterios auxológicos (longitud o talla < -2 DE) y/o perdida de velocidad de crecimiento (< -1 DE), estudios bioquímicos y ra diológicos altamente sugerentes de deficiencia de hor mona de crecimiento (hipoglicemia, ictericia neonatal, micropene, alteración anatómica hipofisaria, IGF-1 e IGFBP-3 disminuida, HC disminuida en muestra crí tica tomada en hipoglicemia (< 15,0 ng/ml en periodo de recién nacido; o < 7,0 ng/ml fuera del periodo de recién nacido).

Como controles se seleccionaron a pacientes con talla baja y con una prueba de estímulo para HC con un resultado > 7,0 ng/ml.

Los candidatos fueron identificados mediante la revisión de la base de datos de las fichas clínicas, y mediante contacto directo con los médicos endocrinólogos pediatras en la red de salud UC-Christus. Se solicitó consentimiento informado a los padres o tu tores legales de cada paciente, con este firmado se ac cedió a la ficha clínica para obtener datos clínicos y de laboratorio correspondientes para cada uno de ellos. Se incluyeron a todos los niños que se encontraran en control en nuestro centro. Se excluyeron a todos los que no contaran con la muestra de sangre de papel fil tro o sin información clínica y de laboratorio necesaria para clasificarlos como DHC. Se recopilaron datos in cluyendo fecha de nacimiento, edad actual (tiempo de conservación del papel filtro), diagnóstico, sexo, edad gestacional, peso de nacimiento, elementos clínicos sugerentes de deficiencia de hormona de crecimiento, pruebas de laboratorio del eje somatotropo, prueba de estímulo de secreción de HC, edad al diagnóstico y compromiso de otros ejes hipofisarios.

Condiciones de toma de la muestra en papel filtro y almacenamiento

Ambos grupos debían contar con muestra de san gre en papel filtro tomada en el período neonatal, almacenada en el laboratorio clínico de nuestro centro. Se analizaron muestras de sangre de papel filtros conservadas a temperatura ambiente5,6. Se consideró como una probable variable confundente la antigüedad del papel filtro, que fue definida como el periodo de con servación comprendido desde la toma de muestra hasta el análisis realizado en nuestro estudio.

Ensayo y técnica de laboratorio

Se realizó extracción de la muestra del papel filtro, obteniendo dos discos de 0,125 pulgada por cada uno de los pacientes desde el centro de la mancha de san gre del papel, mediante el método indicado por el fabricante del papel filtro (Whatman, Reino Unido). Se diluyó la muestra obtenida con buffer comercialmen te disponible de dilución específico para la prueba de ELISA de HC humana, entregado por el fabricante. El contenido de la HC en el eluído fue medido por un método de ELISA altamente sensible (Mediagnost, Reutlingen, Germany). El ensayo está basado en el uso de anticuerpos policlonales dirigidos contra la HC humana recombinante de 22kDa de peso molecular. El ensayo está calibrado contra el Estándar Internacional 98/574. Los resultados obtenidos fueron expresados en ng/ml. Las determinaciones fueron realizadas en duplicado. Se realizó el análisis con todas las muestras disponibles.

Estadística

Los datos recolectados fueron tabulados en Mi crosoft Excel®. Para el análisis estadístico se utilizaron los softwares SPSS® y Prism® GraphPad. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney para el análisis, informando mediana y rango intercuartil. Para correlación se utili zó prueba de Spearman. Se consideró significativo un valor p < 0,05.

Ética

El estudio fue aprobado por el comité de ética de la Facultad de Medicina de la Pontificia Universidad Católica de Chile, número de proyecto 16-121. A todos los padres o representantes legales se les solicitó firma de una carta de consentimiento informado.

Resultados

Características de la muestra

Se reclutaron un total de 20 sujetos durante el periodo analizado, diez con deficiencia de hormona de crecimiento, de los cuales sólo siete contaban con muestra de sangre de papel filtro del período neonatal almacenadas en el laboratorio de la red UC-Christus (Tabla 1), y diez sujetos controles.

Tabla 1 Descripción de casos. 

En la (Figura 1) se comparan las características del periodo de recién nacido de los sujetos con DHC y los controles, respectivamente. Ambos grupos fueron si milares en edad gestacional (Figura 1A), puntaje Z del peso de nacimiento (Figura 1B) y puntaje Z de la longi tud de nacimiento (Figura 1C).

Figura 1 (A) Edad gestacional, (B) Peso de nacimiento, (C) Talla de crecimiento. Círculos rojos: deficiencia múltiple de hormonas hipofisarias. Círculos negros: deficiencia aislada de hormona de crecimiento. HC: Hormona de Crecimiento. 

Resultados de HC en muestras de papel filtro

En los sujetos con diagnóstico de DHC , las con centraciones de HC fluctuaron entre un mínimo de 0,2 a 7,1 ng/mL; comparados con los sujetos sin deficien cia de HC donde las concentraciones de HC fluctuaron entre un mínimo de 1,0 a 6,6 ng/mL. Si bien no se observaron diferencias entre las medianas de la con centración de HC entre ambos grupos, es importante destacar que los dos sujetos con DMHH presentan una concentración bajo el límite inferior observado en los sujetos sin deficiencia (menor a 1,0 ng/mL) (Figura 2B).

Figura 2 (A) HC al diagnóstico; (B) HC en muestra de papel filtro. 

La antigüedad del papel filtro tuvo una mediana de 18 meses (RIC = 3-52 meses) en los casos y 67 meses para los controles (RIC = 56,5-83,75 meses); Mann- Whitney U = 3,0; P = 0,02 bilateral. No hubo asocia ción entre la antigüedad de papel filtro y el resultado de la concentración de hormona de crecimiento en ésta muestra (Rho de Spearman = -0,1; p = 0,704; Figura 3).

Figura 3 Correlación tiempo de conservación de muestra de papel filtro y concentración de hormona de crecimiento ([HC]) en sangre de papel filtro. 

Discusión

Los sujetos con deficiencia de hormonas hipofisarias múltiples tienen concentraciones de HC en papel filtro neonatal significativamente más bajas que las ob servadas en los con DHCA o sin deficiencia. La deter minación de HC en papel filtro almacenada a tempe ratura ambiente5,7 no fue útil para distinguir entre los sujetos con deficiencia aislada o sin deficiencia.

Binder et al.7,8 demostraron la factibilidad de de terminar HC en sangre de papel filtro, validando los ensayos de laboratorio para su análisis, pero en éstos casos el almacenamiento se realizó de forma refrigera da, a 6° Celsius. En nuestro centro, el almacenamiento de las muestras de papel filtro se realiza a temperatura ambiente, en un lugar protegido de la humedad y la luz solar. Como vemos en los resultados, no existe una correlación directa entre el tiempo de almacenamiento de las muestras en estas condiciones, con los resultados obtenidos en la concentración de HC.

A partir de nuestros resultados podemos observar que no existe una diferencia significativa entre la concentración de HC obtenida de papel filtro de los pa cientes que presentan un diagnóstico de DHCA y los sujetos controles.

Los dos sujetos con DHHM tuvieron concentracio nes de HC menor al rango mínimo observado tanto en los sujetos con DHCA como los controles, con una concentración de HC en papel filtro < 1 ng/ml. Estos resultados son concordantes con lo expuesto en un es tudio previo7. Cabe destacar que uno de los pacientes con DHHM fue diagnosticado a la edad de 44 meses, con todas las repercusiones que esto podría tener en el mayor riesgo de hipoglicemias y compromiso del desa rrollo neuronal.

El Caso 1 fue diagnosticado en el período neona tal en contexto de una muestra crítica por presentar hipoglicemias grave (glicemia 17 mg/dl) y la presen cia de malformaciones craneofaciales. El estudio con Resonancia Magnética muestra aplasia hipofisaria. Por otro lado, el Caso 7 fue diagnosticado a los 44 meses de edad, estudio fue realizado por presentar hipoglicemias cetósicas a los 3 años de edad asociado a con vulsión, con glicemia de 18 mg/dl. Se completa estudio con test de estímulo de secreción de HC con clonidina, mostrando deficiencia de HC.

Los pacientes con DHHM constituyen un espec tro clínico amplio, donde se han descrito fenotipos simples, sin alteraciones anatómicas cerebrales y que corresponden a variantes patogénicas de los genes tar díos en la formación de la hipófisis. Por otro lado, hay sujetos con DHHM con un fenotipo complejo, secun dario a variantes patogénicas de genes involucradas en el desarrollo temprano del cerebro, como es el caso de la displasia septo-ótica, holoprosencenfalia y otros. Los pacientes con DHHM suelen tener hipoglicemias severas por la ausencia de cortisol y HC, dos hormo nas fundamentales para mantener la homeostasis de la glucosa. No realizar el diagnóstico en forma oportuna en el periodo neonatal podría asociarse a secuelas neu rológicas irreversibles por hipoglicemias a repetición.

El Ministerio de Salud sugiere que las muestras de papel filtro del tamizaje neonantal se almacenen de preferencia de forma refrigerada, pero pueden ser almacenados a temperatura ambiente, pero no hay claridad del máximo tiempo que pueden ser almace nadas de esta forma9. Sin embargo, el almacenamien to a temperatura ambiente de las muestras pareciera afectar directamente el resultado obtenido en la prue ba de laboratorio, disminuyendo la concentración de hormona de crecimiento en todas las muestras. Esto podría explicar por qué los resultados reportados pre viamente en la literatura, donde los papeles filtros son almacenados a 6°C, son completamente diferentes a los nuestros.

Como ya fue mencionado en otros reportes, el al macenamiento de las muestras de papel filtro refrigeradas a 6°C, la concentración detectada en el papel filtro disminuía en menor magnitud8. Cabe destacar que los pacientes controles, en los que se esperaría una con centración mayor de HC, tienen papeles filtros alma cenados por un mayor tiempo, lo que podría incidir directamente en los resultados obtenidos en nuestra investigación.

Se requiere mayor evaluación de la viabilidad de la muestra de sangre de papel filtro almacenada por largos periodos de tiempo para ser utilizado como mé todo diagnóstico de DHC u otras patologías, conside rando especialmente el efecto que tiene las condiciones de almacenamiento sobre la estabilidad de la muestra.

La muestra de sangre en papel filtro es fácil de ob tener, con una punción mínimamente invasiva, de fácil acceso, requiriendo una cantidad limitada de sangre, permitiendo ser realizada incluso en los recién nacidos más pequeños5. La determinación de HC en sangre al macenada en papel filtro, podría ser útil en identificar aquellos casos severos de DHC o con DHHM. Espe cialmente en lactantes y preescolares donde en ausen cia de muestra crítica en hipoglicemia, realizar una prueba de estímulo farmacológico para liberar hormo na de crecimiento podría tener reparos. Se requiere un nuevo estudio con papel filtro almacenado en forma refrigerada y no a temperatura ambiente, para validar esta hipótesis.

Los resultados de nuestro estudio pueden estar limitados dado el insuficiente tamaño de la muestra, ya que tenemos un número limitado de personas en control en nuestro centro que tenían su papel filtro disponible. Además, no se logró acceder a las muestras disponibles en otros centros.

Nosotros sugerimos cambiar el almacenamiento actual del papel filtro con sangre obtenida en el perio do de recién nacido, por lo que queremos proponer que sea refrigerada y guardada en bolsas individuales para evitar humedad, por lo menos a 6° C y por un periodo de 5 años.

La determinación de HC y de otras hormonas, como cortisol, de la muestra en papel filtro realizada durante el tamizaje neonatal podría ser útil en aquellos pacientes en los cuales no se dispone de muestra crítica durante su hipoglicemia y así poder tener un elemen to más que apoye el diagnóstico de DHHM que puede conllevar riesgo vital.

Responsabilidades Éticas

Protección de personas y animales: Los autores decla ran que los procedimientos seguidos se conformaron a las normas éticas del comité de experimentación hu mana responsable y de acuerdo con la Asociación Mé dica Mundial y la Declaración de Helsinki.

Confidencialidad de los datos: Los autores declaran que han seguido los protocolos de su centro de trabajo sobre la publicación de datos de pacientes.

Derecho a la privacidad y consentimiento informa do: Los autores han obtenido el consentimiento in formado de los pacientes y/o sujetos referidos en el artículo. Este documento obra en poder del autor de correspondencia.

Conflicto de intereses: Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Agradecimientos:

Agradecemos la colaboración de nuestros pacientes, y la excelente disposición de la Sra. Rosario Muñoz, técnico paramédico de la Sala Metabólica de la Chritus-UC.

Referencias:

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9. Cornejo V. Normas para el óptimo desarrollo de programas de búsqueda masiva de Fenilquetonuria (PKU), Hipotiroidismo congénito (HC) y otros errores congénitos del metabolism. Ministerio de Salud: Chile. http://web.minsal.cl/portal/url/item/dd7c4cf4c184c58de040010165016b2a.pdf , última visita 05-03-2018. [ Links ]

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Recibido: 28 de Marzo de 2018; Aprobado: 05 de Noviembre de 2018

Correspondencia: Alejandro Martínez Aguayo alemarti@med.puc.cl.

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