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Parasitología al día

versão impressa ISSN 0716-0720

Parasitol. día v.21 n.3-4 Santiago jul. 1997

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-07201997000300004 

TRABAJOS DE INVESTIGACION

INFECCION EXPERIMENTAL CON Trypanosoma cruzi EN
MACHOS Y HEMBRAS DE TRES CEPAS DE RATONES

 

CLAUDIO ZUÑIGA, RAMON VARGAS, MARIA TERESITA COURCELLES y ULISES VERGARA

 

Trypanosoma cruzi: EXPERIMENTAL INFECTION IN MALES
AND FEMALES FROM THREE MOUSES STARINS

 

 Males and females fron three different strains of mice have been experimentally infected with 2000 bloodstream trypomastigotes from clon DM 28c of Trypanosoma cruzi, in order to evaluate the role of sex difference in the evolution of parasitic infection. Males and females from HTI (H-2) strain were resistant (100% survival), while males and females from Asn (H2a) and AKR (H-2k) starins were highly susceptible with 100%mortality between days 34 and 54 post experimental infection. In all these strains of mice males showed significally higher levels of parasitemia than the corresponding females. Serum samples from all infected mice were then tested by dot immunoradiometric assay, for reactivity against recombinant antigens 1, 2, 13, 26, 30, 36, 54 and SAPA of T. cruzi. Males and females from Asn and AKR susceptibles strains only showed reactivity against clones SAPA and 13. Mice from HTI resistant strain not only reacted with clon SAPA and 13, but also with clones 1 and 36. In conclusion, in this present study we showed no sex difference in susceptibility or resistance to T. cruzi infection in mice. Although males showed higher levels of parasitemia than females, this phenomenon has no effect in mortality of the infected mice. We also found that there were no dyfferences in the reactivity against the recombinant DNA clones from T. cruzi.

Key words: Trypanosoma cruzi; Experimental trypanosomosis; Sex difference; Protozoan.

 

INTRODUCCION

La enfermedad de Chagas causada por el protozoo hemoflagelado Trypanosoma cruzi, es una zoonosis que afecta alrededor de 24 millones de personas en la zona central y sur del continente americano.1, 2 Esta enfermedad esta asociada principalmente a condiciones de ruralidad y marginalidad socio-cultural y económica. En Chile, los estudios serológicos indican que el rango de infección promedio en el hombre alcanza un 19% con un máximo de 41,2% en áreas de alta endemia.2, 3

En el estudio de la fase aguda de la infección con T. crizi , se ha utilizado diversos modelos experimentales. En el modelo murino, distintas cepas de ratones difieren en la susceptibilidad o resistencia a la infección y se ha planteado un complejo control génico de los niveles de parasitemia y la sobrevida de los animales infectados.4-6 Está claro que una variedad de factores, dependientes tanto del hospedador como del parásito, están involucrados en determinar la resistencia o susceptibilidad a la infección. En relación al hospedador, los genes del Sistema Mayor de Histocompatibilidad (SMH) parecen importantes para determinar el desarrollo de la infección,6-7 pero el sexo es un factor cuya influencia no ha sido claramente establecida.8, 9

En el presente trabajo se estudia el desarrollo de la infección con T. cruzi en hembras y machos de tres cepas de ratones, y se analiza la respuesta humoral determinando la reactividad contra un panel de antígenos recombinantes del parásito.

MATERIAL Y METODOS

Ratones: Se utilizaron ratones machos y hembras de dos meses, de las cepas AKR (H-2k), A/Sn (H-2ª ) y HTI (H-2i ).10

Parásitos: Se usaron tripomastigotes sanguíneos del clon Dm 28c de T. cruzi.11 Los parásitos se mantienen en nuestro laboratorio por traspasos sucesivos en ratones C3H.

Evaluación de parasitemias: Grupos de 10 ratones se infectaron con 2.000 tripomastigotes sanguíneos de T. cruzi. El nivel de parasitemia se determinó cada 3 días a partir del día 4 post infección(p.i.), hasta que las parasitemias fueran negativas. Simultáneamente los ratones se sangraron cada 10 días conservando muestras de suero para el análisis de su reactividad contra antígenos recombinantes de T. cruzi. El estudio de parasitemia se realizó según el método de Arias y Ferro,12 tomando en tubos de hematocrito heparinizado una muestra de alrededor de 60 ul de sangre de cada ratón. Luego de centrifugar los tubos a 5.000 rpm por 5 minutos se analizó la región leucoplaquetaria para detectar la presencia y cuantificar tripomastigotes sanguíneos. Se estudiaron 50 campos por placa con aumento 40X. Los niveles de parasitemia se expresaron como número de parásitos/ml. El análisis estadístico fue evaluado con la prueba de Student.

Grupo control: Se inocularon ratones de distintas cepas con glóbulos rojos de ratones C3H. Se procedió a efectuar la sangría de los animales control paralelamente a la de los ratones experimntales. Se pretende definir así que la posible muerte de los ratones problema se deba a la infección con T. cruzi y no a variables como la eventual anemia producida por las sucesivas sangrías. Por otro lado, los sueros de estos ratones se usaron como control negativo en las pruebas serológicas.

Antígenos recombinantes: Se utilizó un panel de 8 antígenos recombinantes aislados de una genoteca de T. cruzi, contenidos en un fago lamda gt11 y expresados en E. Coli Y1090. Estos antígenos recombinantes han sido denominados clon, 1, 2, SAPA, 13, 26, 30, 36 y 5413-15 y han sido gentilmente proporcionados por el Dr. Carlos Frasch, del Instituto de Investigaciones Bioquímicas «Fundación Campomar», Buenos Aires, Argentina. La reactividad de las muestras de suero de los ratones infectados con T. cruzi se realizó mediante un ensayo inmunodot en filtros de nitrocelulosa.

Ensayo inmunoradiométrico DOT. IRMA: Los filtros de nitrocelulosa se prepararon según el métododescrito por Frasch.14, 16 Se lavaron en TBS (150 mM Na Cl, 50mM tris HCL, pH 7.6) por 5 minutos. Luego se bloquea con leche descremada al 3% y glicina al 2%. Se incuba por 30 minutos, en agitación y a temperatura ambiente. Luego se realizó la incubación, en agitación, con los respectivos sueros diluidos al 1:100 en leche por 90 minutos. Posteriormente se lavaron los filtros 3 veces con TBS y se agregó el segundo anticuerpo, cabra anti-IgG de ratón radiomarcado con l125 y se incuba en agitación por 90 minutos. Después de lavar con TBS (3 veces por 10 minutos), una vez con NP-40 al 0,1% y luego con TBS (2 veces por 10 minutos), los filtros se secan y se exponen a una placa autoradiográfica (película Kodak X-OMAT) por 48 horas a -20ºC. La reactividad con cada antígeno recombinante se expresó arbitrariamente con cruces, de acuerdo a la mayor intensidad de reacción comparada con el fago control.

RESULTADOS

Los ratones machos y hembras de la cepa Asn y AKR se comportan como susceptibles a la infección con trypomastigotes sanguíneos del clon Dm 28c de T. cruzi, presentando 100% de mortalidad entre los 34 y 54 días post-infección (Tabla 1). Los ratons de HTI son en cambio resistentes y sobreviven más allá de los 7 meses post-infección (p.i.).

La prepatencia no es significativamente distinta entre las distintas cepas de ratones, pero los niveles de parasitemia fueron claramente más elevados en la cepa resistente HTI (Tabla 1). Al mismo tiempo al comparar la evolución de las parasitemias entre los distintos ratones (Figura 1), se observaron diferencias significativas en los niveles máximos de parasitemias entre machos y hembras de las cepas Asn (p < 0,001), AKR (p < 0,01) y HTI (p < 0,001), siendo en los tres casos más altas en los machos.

 

En la Tabla se muestra la reactividad IgG contra antígenos recombinantes de los sueros de ratones AKR. Tanto machos como hembras AKR presentan un reconocimiento preferencial de las proteínas SAPA y 13, y prácticamente no hay reactividad con el resto de los antígenos recombinantes.

En relacióbn a los sueros de los ratones HTI (Tabla 3), se puede ver una fuerte reactividad con SAPA y 13, que aparece temprano durante la infección y se mantiene pasadas los 4 meses p.i. También se puede observar una reactividad menor con el antígeno 36, la cual aparece antes en las hembras. La reactividad con el antígeno 1 aparece taedíamente a partir de los 37 días p.i. en los machos y a los 50 días p.i. en las hembras.

En el caso de los sueros de los ratones Asn sólo se pudo observar una leve reactividad con SAPA y 13 al día 30 p.i. (datos no mostrados).

DISCUSION

En el presente trabajo hemos mostrado que los resultados de las cepas A/Sn y AKR se comportan como susceptibles a la infección con 2.000 trypomastigotes sanguíneos del clon Dm 28c de T. cruzi, mientras los ratones HTI se comportan como resistentes. Los factores genéticos asociados a la resistencia a una serie de infecciones se encuentran habitualmente ligados al Complejo Mayor de Histocompatibilidad, que está involucrado en la inducción y regulación de la respuesta humoral y celular contra diversos antígenos.17, 18 La cepa HTI es un recombinante (H-2ª/H2b) del haplotipo B1010, el cual es resistentes a la infección con la mayoría de las cepas de T. cruzi.6 Las subregiones K e I del complejo que comparten HTI con B10 podrían ontener él o los genes involucrados en el fenómeno de resistencia (manuscrito en preparación).

Estudios previos han sugerido que en el modelo murino los machos son más susceptibles que las hembras a la infección con T. cruzi, pero nuestrs resultados sugieren que aún cuando los niveles de parasitemia son más altos en los machos que en las hembras, no se llega al extremo que las hembras sean resistentes y los machos susceptibles, como ocurre en las ratas de la cepa F344, donde la infección con T. cruzi produce la muerte sólo de los machos.19 En nuestros experimentos, a pesar que los ratones machos de la cepa A/Sn presentaron niveles máximos de parasitemia casi seis veces más elevados que el de las hembras, el 100% de machos y hembras murieron en el mismo período de tiempo post infección. En los ratones AKR aún cuando las hembras tuvieron niveles más bajos de parasitemia y sobrevivieron casi tres semanas más que los machos, igual sucumbieron a la infección con el parásito. Al analizar lo ocurrido con los ratones de la cepa resistent HTI, se observa que a pesar que los machos presentaron el doble de parasitemia que las hembras, el 100% de machos y hembras sobreviven a la infección. Se demuestra así que los niveles de parasitemia son sólo un parámetro más a considerar en la infección con T. cruzi, pero no parece un factor determinante en la sobrevida o muerte de los individuos infectados.

 

Al analizar la reactividad, contra proteínas recombinadas de T. cruzi, de las muestras de suero de los ratones infectados se observó que los antígenos más fuertemente reconocidos fueron SAPA, 13 y 36, tanto por sueros de machos como de hembras, mientras que las proteínas 2, 26, 30 y 54, presentaron un escaso o nulo reconocimiento. Esta situación en el modelo murino es diferente a la descrita con sueros de pacientes chagásicos que habitualmente reconocen todas estas proteínas recombinantes.20 Sólo los sueros HTI mostraron buena reactividad con el antígeno 1. A diferencia de SAPA que está presente durante todo el período de infección, la reactividad con 1 parece caracterizar la etapa crónica de la infección en este modelo, pero sin mostrar grandes diferencias de reactividad entre machos y hembras. Aparentemente la reactividad con la proteína SAPA no estaría asociada con la susceptibilidad o resistencia a la infección con T. cruzi puesto que se presenta tanto en animales resistentes como susceptibles. Sin embargo, no se puede descartar la posibilidad que los sueros de animales susceptibles y resistentes reconozcan epítopes diferentes en la protína SAPA y que la resistencia o susceptibilidad a la infección esté asociada a la capacidad de desarrollar una respuesta inmune humoral contra estos epítopes. LA proteína SAPA ha sido descrita como un antígeno de liberación de la fase aguda,13 como una neuraminidasa y más resientemente como una trans-sialidasa.21 Dada la importancia de SAPA-TS en el proceso de infección,22 la generación de anticuerpos capaces de inhibir a esta enzima pueden ser importantes para controlar la infección. SAPA-TS presenta un dominio amino terminal con actividad catalítica y el extremo carboxilo es el dominio antigénico.23 HA sido sugerido que como la respuesta conta el dominio repetido de SAPA es incapaz de neutralizar la actividad transsialidasa, este dominio inmunodominante juega un papel de distracción o de «cortina de humo» para el sistema inmune, de modo de dilatar la inducción de una respuesta humoral capaz de neutralizar el dominio catalítico de la proteína, que evidentemente favorecería la sobrevida del parásito.23 Estudios recientes han demostrado que la infección con T. cruzi es en realidad capaz de inducir la síntesis de anticuerpos contra la región amino terminal enzimática de SAPA, pero ello sólo ocurriría en los animales capaces de sobrevivir la fase aguda de la infección,24, 25 como podría ser el caso de nuestros ratones HTI. En nuestros resultados la reactividad contra la región inmunodominante de SAPA no muestra diferencias entre ratones susceptibles y resistentes, ni entre machos y hembras, pero podría sugerirse que la reactividad contra el dominio catalítico puede mostrar diferencias, este último no está representado en nuestro clon recombinante SAPA, que contiene sólo el dominio repetido de la proteína nativa.

Nuestros resultados apoyan la idea que el desarrollo de la infección con T. cruzi pareciera tener una modalidad diferente en machos y hembras en el modelo murino, pero que el sexo no pareciera ser determinante en la sobrevida o muerte de los animales infectados.

RESUMEN

Se inocularon 3 cepas de ratones, machos y hembras, con 2.000 trypomastigotes sanguíneos del clon Dm 28c de Trypanosoma cruzi.

Los ratones HTI de ambos sexos se comportaron como resistentes, en cambio, murió el 100% de los animales de las cepas A/Sn y AKR entre los 30 y 50 días post-infección, respectivamente. En las tres situaciones se observaron diferencias significativas en los niveles máximos de parasitemia entre machos y hembras, teniendo los primeros niveles más altos. Los sueros de los ratones infectados obtenidos a distintos tiempos post-infección, se probaron con una batería de antígenos recombinantes de T. cruzi. Los sueros de los ratones A/Sn y AKR mostraron reactividad preferencial. Con los antígenos recombinantes SAPA y 13. Los sueros de los ratones HTI reconocieron además de SAPA y 13, al antígeno recombinante 36 y tardíamente al antígeno 1. En cuanto al sexo, la única diferencia parece ser los niveles de parasitemias, pero este hecho no se refleja en diferencias a nivel de susceptibilidad o resistencia, como tampoco en el reconocimiento de los antígenos recombinantes.

 

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Agradecimientos: Este trabajo fue financiado SAREC/SIDA Proyecto 1960949 FONDECYT/Chile.

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