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Parasitología al día

versão impressa ISSN 0716-0720

Parasitol. día v.24 n.1-2 Santiago jan. 2000

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-07202000000100003 

Criopreservación de Plasmodium (Novyella)
juxtanucleare con glicerol

 

CRYOPRESERVATION OF Plasmodium (Novyella) juxtanucleare WITH
GLYCEROL

 

PAULO C A SOUZA*, CARINA ELISEI****, CLEBER O SOARES** y CARLOS L MASSARD**

The cryopreservation of Plasmodium juxtanucleare by glycerol at four concentration (20%, 16%, 12% and 8%) was evaluated. Three fowls, per glycerol concentration (GC), were inoculated with warmed blood after storage at -196°C for six month. Daily blood smear for 35 days were done. The biological parameter showed that the parasitaemia was directly proportional to GC, the prepatent period was of 12.4 ± 2.7 days, the maximum peak of parasitaemia (MPP) was of 23.5 ± 3.5 days and, the average duration of parasitaemia was of 33.6 ± 1.0 days. The rate of hemolysis varied of 12.45% to 40% and, was inversely proportional to GC. There was significant difference (P < 0.05) regarding to MPP, which the inoculum with 12% concentration differed of the others concentration, showing the highest MPP (30.5 ± 0.5). The parasitaemia, average of the groups, began between the seventh and eighth day post-inoculation (DPI) and, lasted to 35o DPI. The group that received inoculum with 20% glycerol had the highest and farthest parasitaemia. The 20% glycerol was the more efficient concentration to cryopreservation of P. juxtanucleare.
Key words: Plasmodium juxtanucleare; Gallus gallus; Freezing; Glycerol.

INTRODUCCION

La criopreservación es un método que a producido grandes progresos en las ciencias biológicas. Todas las células, tejidos y organismos sometidos a bajas temperaturas tienen sus actividades metabólicas suprimidas. En estas circunstancia los procesos de envejecimiento y

deterioro celular disminuyen o cesan y el tejido puede ser conservado, por un largo período de tiempo en un estado de "animación suspendida".1

Los microorganismos hidratados poseen la capacidad de soportar temperaturas bajas. Bacterias, algas, hongos y muchas especies de protozoarios, pueden ser congelados en nitrógeno líquido (-196° C) o freezer biológico (-80° C) y descongelados sin daños indeseables, siempre y cuando esas fases se realicen en condiciones óptimas.1, 2

Existen varias substancias crioprotectoras, siendo las más utilizadas para el almacenamiento de células el glicerol, dimetil sulfóxido (DMSO) y polivinil-pirrolidona.2, 3, 4 Estos productos protegen a las células, revistiéndolas lo cual diminuye el punto de congelamiento del medio celular y altera el padrón de cristalización en la formación del hielo extracelular.2, 4

El almacenamiento de parásitos por medio de congelamiento en bajas temperaturas a sido ampliamente utilizado. Esto, reduce varios inconvenientes como, principalmente, el costo de la mantención de patógenos en animales o en medios de cultivo y la mantención de las características biológicas del organismo que podría ser perdida con sucesivos pasajes.5 Diversas especies de parásitos maláricos han sido mantenidos bajo ultracongelamiento;5, 6, 7 no obstante, pocos son los estudios para los plasmodios de aves.

Plasmodium (Novyella) juxtanucleare Versiani & Gomes, 1941 es un hemoproto-zoario que posee alta especificidad para Gallus gallus. Posee amplia distribución mundial y es responsable por altos índices de morbilidad y mortalidad en gallinas de crianza rústica y morbilidad en crianzas industriales.8 El presente estudio tuvo como objetivo evaluar una metodología para la criopreservación de P. juxtanucleare en glicerol, observando algunas variables biológicas.

MATERIAL Y METODOS

Se utilizó una muestra de P. juxtanucleare (MSS 47) colectada de una gallina mestiza, procedente de una crianza rústica del município de Seropédica, estado de Río de Janeiro. Una ave adulta fue utilizada como donadora del inoculo luego de cuatro pasajes e inmunodeprimirla con 20 mg de acetato de metilprednisolona. La sangre fue colectada, en frascos conteniendo EDTA al 10%, para exámenes de laboratorio. El examen hematológico del ave donadora reveló: hematócrito = 20%, Nº de eritrocitos/ml = 1,705 x 106 y parasitemia = 8,46%. La sangre utilizada para la criopreservación fue colectada con citrato fosfato dextrosa al 3,8%.

El ensayo fue conducido, utilizando cuatro diferentes diluciones de glicerol (100%, 80%, 60% y 40%) adicionado a la sangre citratada; formando cuatro grupos experimentales (A, B, C y D) (Tabla 1).

Las muestras fueron acondicionadas en tubos para criopreservación y, mantenidas por 15 min a temperatura ambiente, después por más 30 min a temperatura de refrigeración (4° C) y 15 horas a temperatura de -20° C. En seguida los tubos fueron colocados en nitrógeno líquido (-196° C) y almacenados durante seis meses.

Fueron utilizados 15 pollos sin raza definida, con 17 días de edad, las cuales fueron separadas en cuatro grupos de tres animales, conforme la dilución de glicerol (Tabla 1), y un grupo testigo compuesto, también, de tres pollos. Los pollos de los grupos experimentales (A, B, C y D) recibieron un inoculo, por vía abdominal, de 0,3 ml de sangre criopreservada con 2,94 x 104 eritrocitos parasitados/µl. El grupo testigo no recibió inoculo. A partir del día de la inoculación, fueron realizados frotis sanguíneos diarios, de las aves, durante un período de 35 días.

Los frotis sanguíneos fueron fijados en metanol, coloreados con Giemsa el cual fue diluido en tampón Sorensen pH 6,8 y observados en microscopio óptico bajo objetivo de inmersión.

Para evaluar la eficiencia de la criopreservación, se procedió al análisis estadístico de las variables biológicas relativas a parasitemia, el período pre-patente (PPP), el pico máximo de parasitemia (PMP) y duración media de la parasitemia (DMP), para los cuatro grupos experimentales. También se realizó, el análisis de los inóculos antes y después de la criopreservación. El análisis estadístico de los datos fue realizado utilizando la prueba de Tukey con grado de confianza de 95%.

RESULTADOS

El inoculo de P. juxtanuclerare, tenía una parasitemia de 5,7%, equivalente a 9,7x104 eritrocitos parasitados/µl, antes de ser criopreservado. Posterior a la criopreservación la parasitemia y el número de eritrocitos parasitados sufrieron una disminución directamente proporcional a la concentración de glicerol, las cuales fueron: parasitemia de 4,99% y 8,5x104 eritrocitos parasitados/µl, parasitemia de 4,55% y 7,7x104 eritrocitos parasitados/µl, parasitemia de 4,01% y 6,8x104 eritrocitos parasitados/µl, parasitemia de 3,42% y 5,8x104 eritrocitos parasitados/µl, para las concentraciones de glicerol 20%, 16%, 12% y 8%, respectivamente (Tabla 1).

Tabla 1. Análisis del inoculo de P. juxtanucleare, muestra MSS 47, pre-criopreservación y
post-criopreservación bajo cuatro diferentes concentraciones de glicerol

          Evaluación del inóculo
Preparación del inóculo
Pre-criopreservación Post-criopreservación
  Volumen Volumen de Concentración Concentración         Tasa de
Grupo de sangre glicerol (µl) inicial de final de Parasitemia N° erotrocitos Parasitemia N° erotrocitos hemólisis
  (µl)   glicerol (%) glicerol (%) (%) parasitados/µl (%) parasitados/µl (%)

A 800 200 100 20 5,70 9,7 x 104 4,99 8,5 x 104 12,45
B 800 200 80 16 5,70 9,7 x 104 4,55 7,7 x 104 20,17
C 800 200 60 12 5,70 9,7 x 104 4,01 6,8 x 104 29,65
D 800 200 40 08 5,70 9,7 x 104 3,42 5,8 x 104 40000

Se observó, en los cuatro tratamientos, hemólisis causada por congelamiento, cuya tasa fue inversamente proporcional a la concentración de glicerol. La tasa de hemólisis vario de 12,45% a 40,00% (Tabla 1).

Las variables biológicas de PPP, PMP y DMP, para los cuatro grupos experimentales, tuvo valores medios, en días de 12,4 ± 2,7, 23,5 ± 3,5, 33,6 ± 1,0 respectivamente (Tabla 2). El análisis estadístico reveló diferencia significativa (P < 0,05) sólo en cuanto a PMP; donde el grupo C (glicerol a 12%) difirió de los otros, por presentar el PMP mayor (30,5 ± 0,5) que los otros grupos (Tabla 2).

 

Tabla 2. Evaluación del período pre-patente (PPP), pico máximo de l
parasitemia (PMP) y duración media de la parasitemia (DMP) de P.
juxtanucleare
muestra MSS 47, criopreservada bajo cuatro diferentes
concentraciones de glicerol. Inoculación experimental en G. gallus

Grupo PPP (días) PMP (días) DMP (días)*

A 11,5 ± 3,5ª** 21,5 ± 3,5 a 35,0 ± 0,0 a
B 12,0 ± 2,5ª 20,0 ± 5,0 a 33,3 ± 1,6 a
C 13,6 ± 3,6ª 30,5 ± 0,5 b 33,6 ± 1,2 a
D 12,6 ± 1,2ª 22,0 ± 5,0 a 32,6 ± 1,2 a
Media 12,4 ± 2,7
23,5 ± 3,5
33,6 ± 1,0
 
* Observación en microscopio óptico.
** Valores en media ± desvío padrón. Letras diferentes, en la misma columna, difieren entre si (P < 0,05), según prueba de Tukey.

La parasitemia, para los cuatro grupos experimentales tuvo el inicio entre el séptimo y octavo día post - inoculación (DPI), manteniéndose baja con oscilaciones y perdurando, en media hasta el 35° DPI (Figura 1). Para la evaluación de la parasitemia el grupo A (glicerol a 20%) presentó los mayores y más altos índices de parasitemia.

Figura 1. Parasitemia, media aritmética, de P. juxtanucleare criopreservado bajo cuatro diferentes concentraciones de glicerol. Inoculación experimental en G. gallus.

DISCUSION

Para los cuatro tratamientos, la parasitemia sufrió una disminución directamente proporcional a la concentración de glicerol; ya que la tasa de hemólisis fue inversamente proporcional a la concentración de glicerol. Esta observación también fue relatada por Dalgliesh9 al estudiar los efectos de la baja temperatura, la preservación, las vías de inoculación y la infectividad de Babesia bigemina en sangre diluida en glicerol. También notificó, que el glicerol, como crioprotector, reduce el porcentaje de hemólisis, posterior al congelamiento y descongelamiento.9

A través de la observación de los frotis sanguíneos, el grupo C reveló ser más homogéneo, presentando gran número de eritrocitos íntegros, comparado con los demás grupos. Lo que hace inferir que el glicerol a concentración final de 12%, posee un buen efecto como crioprotector de eritrocitos de aves, pero no es eficaz para la criopreservación de plasmodiideo.

Varios autores que trabajan experimentalmente con muestras de P. juxtanucleare en G. gallus, relatan un período pre-patente de cuatro a 15 días.8, 10 Tales observaciones corroboran las del presente experimento, donde se verificó el PPP, medio, de 12,4 ± 2,7; hecho que sugiere que el glicerol como crioprotetor mantiene la viabilidad y la infectibilidad de P. juxtanucleare.

Evaluando la parasitemia, el grupo A presentó el mayor y más alto índice, sugiriendo que el glicerol a concentración final de 20% fue la mejor dilución como crioprotector para P. juxtanucleare, en las presentes condiciones experimentales. La baja parasitemia verificada en el experimento puede estar asociada a la tasa de hemólisis; que, probablemente, fue como consecuencia del efecto osmótico del glicerol, lo cual aumenta la lísis eritrocítica y, consecuentemente los efectos dañinos sobre el parásito.5, 9

La utilización de glicerol, como protector activo de eritrocitos de mamíferos, disminuyó los efectos dañinos de la criopreservación en los agentes de la malaria, pues se observó que durante el proceso de congelamiento y descongelamiento ocurría un gran porcentaje de lísis eritrocítica y reducción de la viabilidad del parásito.5, 9

Muchas especies de Plasmodium han sido almacenadas y preservadas en nitrógeno líquido, con excelentes resultados.5, 6, 7 La criopreservación en glicerol, la 20% bajo ultracongelamiento se mostró eficiente en la mantención de P. juxtanucleare.

RESUMEN

Se evaluó la criopreservación de Plasmodium juxtanucleare utilizando glicerol bajo cuatro concentraciones (20%, 16%, 12% y 8%). Posteriormente, congelamiento a -196°C, por seis meses, la sangre fue descongelada e inoculada en pollos, tres pollos para cada concentración de glicerol (CG). Se realizó frotis sanguíneos diarios, de las aves, durante 35 días. El análisis de variables biológicas reveló que la parasitemia fue directamente proporcional a CG, el período pre-patente fue de 12,4 ± 2,7 días, el pico máximo de parasitemia (PMP) fue de 23,5 ± 3,5 días y la duración media de la parasitemia fue de 33,6 ± 1,0 días. La tasa de hemólisis varió de 12,45% a 40% y, fue inversamente proporcional a CG. Hubo diferencia significativa (P < 0,05) en cuanto a PMP; donde el inoculo con glicerol a 12% difirió de los demás, presentando el mayor PMP (30,5 ± 0,5). La parasitemia media, de los grupos experimentales tuvo el inicio entre el séptimo y octavo día post-inoculación (DPI), durando, en media, hasta el 35o DPI. El grupo que recibió inoculo con glicerol a 20% presentó la mayor y más alta parasitemia. El glicerol a 20% fue la concentración más eficiente para la criopreservación de P. juxtanucleare.

* Dep. Epidemiología e Saúde Pública, Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ).
** Curso de Pós-graduacao em Medicina Veterinária-Parasitologia Veterinária, UFRRJ, Km 47 Rod, Rio-Sao Paulo, Seropédica-RJ, Brasil, 23890-000, e-mail: csoares@ufrrj.br

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