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Parasitología al día

versão impressa ISSN 0716-0720

Parasitol. día v.24 n.3-4 Santiago jul. 2000

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-07202000000300002 

Tripomastigotes de sangre y de cultivo celular de Trypanosoma cruzi Y.  II.- Patologíade la enfermedad de Chagas en ratones Balb/c

RAIZA ARAGORT DE ROSSELL*, ANA MARIA RODRIGUEZ*, ROSA DE JESUS *MARINA CALCAGNO*, ZULAY MAIZO DE SEGNINI * y SILVERIO DIAZ*

BLOOD AND CULTURE TRYPOMASTIGOTES FORMS OF Trypanosomacruzi Y. II PATHOLOGY OF CHAGAS' DISEASE IN BALB/C MICE

The histopathology and humoral response of BALB/c mice survivors after the infection with blood and culture forms of Trypanosoma cruzi was evaluated. The animals studied included those that survived the acute form of infection denominated Susceptible and those in which the parasite presence was detected only after an immune-suppresive treatment with cyclophosphamide called Less Susceptible. The autopsy of the animals revealed in all of them different grades of dilation of the colon while the miocardium was apparently of normal size. The histopathological studies of the gastrointestinal tract revealed miositis, miolisis and destruction of the mioenteric plexus. These alterations increased in intensity along the tract being slight to moderate from the cardias to the small intestine and intense in colon and rectum. Parasites were detected in only three cases. Pancreas alterations conducted to the loss of the gland architecture and consisted of intense oedema and inter-spaced inflamatore infiltrated between acinous cell and necrosis of the Langerhans' Islets. The histologic changes at the myocardium were slight. Small inflamatory foci of mononuclear cells were observed in the great vessels of the atriums and right ventricle. Parasites were not seen. Hight titles of specific IgG were detected in all animals. This histopathological study did not reveal differences relate to the origin of the trypomastigotes form.
Keywords: Trypanosoma cruzi, Protozoan, Difference of infectivity.

INTRODUCCION

La enfermedad de Chagas es causada por el protozoario hemoflagelado Trypanosoma cruzi. Este parásito comprende poblaciones altamente heterogéneas, las cuales circulan en la naturaleza entre humanos, vectores y reservorios.1

Tanto en humanos como en modelos experimentales, la infección presenta una fase aguda con tripomastigotes circulantes y una fase crónica con control rígido de la parasitemia, la cual en el humano persiste por muchos años después de la infección.1-4

Estudios anatomopatológicos e histopatológicos de la infección, demuestran miocardiopatía de severidad variable, infiltrado mononuclear asociado a miocitólisis del tejido cardíaco, en el cual rara vez se observan parásitos1, 5-8 y megasíndromes con daño del tejido gastrointestinal, en los cuales se observa infiltrado de leucocitos e hipertrofia de las capas musculares de la mucosa y la lámina propia.7, 9,-11Estos estudios también muestran destrucción de células neuronales cardíacas y gastrointestinales.1, 8, 12

El propósito de este trabajo es estudiar las posibles patologías del corazón y del tracto gastro intestinal, en los ratones BALB/c sobrevivientes de la infección experimental con T. cruzi Y de sangre y de cultivo celular que reportamos en la experiencia anterior13. También haremos referencia a los niveles de IgG específica presentes en la fase crónica de la enfermedad justo antes del sacrificio de los animales.

MATERIAL Y METODOS

Animales. Ratones BALB/c inoculados con tripomastigotes de sangre (Tr.s) o de cultivo celular (Tr.cc), en fase crónica de la enfermedad de Chagas.13

El grupo de ratones BALB/c inoculados con 104 Tr.s y clasificado como Susceptibles (sobrevivieron a la fase aguda de la enfermedad, con negativización progresiva de la parasitemia al examen microscópico, determinándose luego la presencia del parásito por xenodiagnóstico), estuvo conformado por 6 hembras de 12 semanas de edad.

El grupo de ratones BALB/c inoculados con Tr.cc y clasificados como Poco Susceptibles (no presentaron parasitemias al examen microscópico, pero si al ser inmunosuprimidos 38 días post-inoculación), estuvo conformado por ratones machos de 14 semanas de edad inoculados con 8x105 (n = 5), 4x105 (n = 5), 105 (n = 1) y hembras de la misma edad inoculados con 8x105 (n = 5), 4x105 (n = 2), 2x105 (n = 4). Los animales se observaron durante 8 meses post-inoculación, y se sacrificaron. Ratones controles fueron mantenidos en las mismas condiciones experimentales.

Estudio de la Respuesta Inmune Humoral. El estudio serológico se efectuó con la finalidad de detectar la presencia de inmunoglobulina específica en los animales. Las muestras de sangre para la obtención del suero fueron colectadas inmediatamente antes del sacrificio.

Se utilizó la técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI).14 El antígeno correspondió a formas de cultivo de T. cruzi cepa "Y", crecidos en medio LIT y cosechados durante la fase estacionaria del crecimiento. Los parásitos obtenidos fueron lavados 3 veces con solución amortiguadora de fosfato salino EDTA/albúmina15 y suspendidos en la misma solución a una concentración de 1x107 parásitos por ml. Alícuotas de la solución fueron colocadas sobre los pozos de un cubreobjeto especialmente diseñado (Hendley LTD Essex, England) y una vez seca la preparación fue fijada con acetona durante 5 minutos. Las láminas así fijadas y completamente secas, fueron colocadas en cámara húmeda a temperatura ambiente, procediéndose a colocar sobre los pozos con antígeno las diluciones seriadas del suero (desde 1:50 hasta 1:12.800) por espacio de 30 min. Seguidamente se realizaron tres lavados de 10 min cada uno con solución amortiguadora de fosfato salino (PBS) y luego de removido el exceso de líquido se colocó el conjugado IgG anti-ratón conjugada con fluoresceina obtenida en cabra F/P radio molar 4.3 (Sigma, Corp.) diluido 1:120 en PBS conteniendo albúmina de bovino fracción al 5%. El conjugado estuvo en contacto con la preparación durante 30 min procediéndose luego a lavar 3 veces con PBS. La preparación fue cubierta con cubre- objeto utilizando glicerina tamponada con PBS (9 partes glicerina-1 parte PBS) como medio de montaje. La observación se realizó en un microscopio ZEISS equipado para inmunofluorescencia indirecta, con lámpara de mercurio de alta presión HBOx200 W, condensador III RS con filtros estándar anticalórico, KGL, supresor de rojo BG38 y juego de filtro estándar azul para FITC, compuesto de filtro excitador BP450-490 FT510 y filtro supresor LP520.

La reacción se evaluó en una escala visual desde negativo hasta una positividad de tres cruces, en comparación con el suero negativo de ratones sanos y el suero control positivo de ratones infectados con T. cruzi cepa "Y". Además se incluyeron controles para detectar autofluorescencia y falsos positivos, el primero consistió en cubrir el antígeno solo con PBS y el segundo en sustituir el suero problema por PBS procediendo a completar la técnica como se explicó anteriormente.

Los títulos correspondieron a la máxima dilución donde se pudo apreciar fluorescencia en el citoplasma equivalente a dos cruces.

Estudio Anatomopatológico. Los ratones fueron necropsiados y la anatomía macroscópica de los órganos estudiada en relación a controles normales mantenidos en las mismas condiciones que el grupo experimental.

Estudio Histopatológico. Se llevó a cabo en muestras del aparato digestivo (esófago; estómago; duodeno; yeyuno; íleon; colon ascendente, transverso y descendente; ampolla rectal) y corazón. Las muestras fueron fijadas en formalina neutra 10%.16 Una vez fijado el tejido fue lavado en agua de chorro, deshidratado por pases sucesivos en concentraciones ascendentes de alcoholes (70-80-90-100%), clarificado en xilol e incluido en parafina mediante el pase del tejido en 3 baños del medio de inclusión. Los cortes entre 5 y 8 µ fueron realizados en un microtomo American Optical Spencer "820" USA y coloreados con hematoxilina-eosinay giemsa- colofonio17.

RESULTADOS

Estudio de la Respuesta Inmune humoral

El 100 por ciento de los sueros estudiados presentaron reactividad serológica positiva a la presencia de inmunoglobulina G -específica mostrando para todos los casos títulos de 1:12.800. Los controles con suero procedente de animales sanos como los efectuados para control de autofluorescencia y falsos positivos no mostraron ninguna reactividad.

Estudios Anatomopatológicos

Durante el período de observación se detectó prominencia abdominal en los animales, lo cual entorpecía la locomoción y parecía favorecer la micción. A pesar de que no se realizaron mediciones para determinar el calibre de los órganos, la comparación con los controles normales reveló para todos los animales autopsiados distensión del intestino grueso la cual varió en intensidad y cuya máxima manifestación se representa en el megacolon desarrollado en el ratón de las Figuras 1a y 1b. La observación macroscópica del miocardio no reveló hipertrofia.


Figura 1a. Megacolon en ratón BALB/c hembra inoculado con 1x104 tripomastigotes sanguícolas T. cruzi "Y". 8 meses post-inóculo.

 


Figura 1b. Megacolon del mismo ratón comparado con ratón normal.

Estudios histopatológicos del Aparato
Digestivo

El examen histopatológico demostró que las alteraciones microscópicas variaron de intensidad en los diferentes animales y abarcaron todos los órganos estudiados, siendo de ligeras a moderadas desde la región del cardias (Figura 2) a intestino delgado e intensas en el intestino grueso y recto (Figuras 3, 5 y 6).


Figura 2. Región del cardias. Infiltrado mononuclear que abarca desde la mucosa hasta la muscular (HE 165).


Figura 3. Colon transverso. Intenso infiltrado inflamatorio de toda las capas del intestino con excepción del epitelio.


Figura 5. Infiltrado inflamatorio y vasculitis en ampolla rectal. Nótese la presencia de abundantes eosinófilos en el infiltrado (Giemsa 500X).


Figura 6. Ampolla rectal. Foco de proliferación de fibroblastos. Destrucción parcial del epitelio (Giemsa 500X).

Los estudios sugieren que no existiría relación entre las alteraciones encontradas y la procedencia del parásito (sangre o cultivo), el inóculo utilizado y el sexo del hospedador.

Un hallazgo constante lo constituyó la miositis y miolisis del músculo liso y las alteraciones del plexo mioentérico.

La miositis se caracterizó por la presencia de células mononucleares con predominio de linfocitos que infiltraron haces musculares que lucían adelgazados y de aspecto hialino.

El edema fue prominente en algunas áreas mostrando un infiltrado laxo y extenso (Figura 4). En el sigmoide y recto donde las alteraciones fueron intensas, el infiltrado se extendió hacia el epitelio, la submucosa, capas musculares externas y la adventicia. En estos casos, además de linfocitos y macrófagos, se observaron eosinófilos en cantidad moderada, neutrófilos y algunos mastocitos (Figuras 3 y 5).


Figura 4. Proceso inflamatorio crónico de la muscular externa en colon transverso. Infiltrado mononuclear con predominio de linfocitos. Nótese en la parte inferior y derecha infiltración del tejido (HE 500X).

A nivel de la ampolla rectal se observó además necrosis del epitelio, infiltrado con predominio de células epiteloides, fibroblastos, neoformación de vasos y algunos granulomas (Figura 6).

Amastigotes solo se observaron en el colon de 3 animales, en dos de ellos los parásitos se dispusieron formando "pseudoquistes" en las fibras musculares de la capa longitudinal externa (Figura 7), uno de ellos fue un ratón de los que no desarrollaron parasitemias luego de la inoculación, pero que posteriormente fue evidenciada al inmunosuprimirlo (Poco Susceptible), otro de los que superaron la fase aguda (Susceptible). En el tercer ratón (Poco Susceptible) visualizamos amastigotes dentro de un macrófago ubicado en la submucosa.


Figura 7. Nido de amastigotes constituyendo seudoquistes. Nótese la vacuolización y edema en las fibras musculares (HE 800X).

A través de todo el aparato digestivo, en especial en el colon, se observaron áreas de exudado inflamatorio alrededor de las células ganglionares del plexo de Auerbach, los cuales en muchos casos se vieron invadidos por macrófagos con desaparición parcial y/o vacuolización de las neuronas (Figura 8). Es de hacer notar que en segmentos de una misma región se observaron ganglios sin lesión aparente seguidos por ganglios con diferentes grados de alteraciones.


Figura 8. Infiltrado inflamatorio del plexo de Auerbach con inicio de degeneración de las neuronas del ganglio. (HE 400X)

El examen del peritoneo y grasa adyacente reveló a partir del estómago la presencia de infiltrado inflamatorio crónico formado por células mononucleares y abundante vascularización (Figura 9).


Figura 9. Proceso inflamatorio crónico de la adventicia, mostrando abundante vascularización y necrosis del tejido adiposo (HE 165X).

En algunos casos el páncreas fue removido junto al intestino, observándose que mientras parte de la glándula lucía aparentemente normal o con discretas alteraciones, otras regiones presentaron intenso edema inter-acinar, infiltrado inflamatorio y destrucción de los islotes de Largenhans (Figuras 10 y 11).


Figura 10. Páncreas. Edema de los islotes de Langerhans y separación de los acinos glandulares (HE 165X).


Figura 11. Páncreas. Pérdida total de la arquitectura de la glándula, extenso edema, lisis de los islotes de Langerhans y necrosis (HE 165X).

 

Estudio Histopatológico del corazón

Las alteraciones histopatológicas del corazón fueron discretas. Observamos áreas de inflamación de carácter local de naturaleza infomonocitaria con presencia de eosinófilos y uno que otros mastocitos ubicados en la base de los grandes vasos a nivel de aurículas, alrededor de pequeños vasos en el ventrículo derecho y en ocasiones en la punta. En ningún caso detectamos la presencia del parásito.

DISCUSION

La producción de megasíndromes luego de la infección crónica por T. cruzi en condiciones naturales y experimentales es referida ampliamente en la literatura.4, 11En nuestro estudio nos referimos al hallazgo de megacolon típico en ratones BALB/c infectados crónicamente con Tr.s. y Tr.cc, hecho este que es difícil de reproducir en la infección experimental por este parásito que para nuestro conocimiento es uno de los pocos casos reportados.

Los estudios en ratones albinos machos infectados crónicamente con T. cruzi Y refieren que inóculos intraperitoneales de 2x104 Tr.s produjeron dilatación moderada en el 20% de los casos sin obtención de megas típicos. Por otra parte, inóculos de Tr.cc en el orden de 1x106 y 2x106 produjeron claros megaestómagos y megavejigas.18 Megaestómagos fueron reproducidos en ratones suizos hembras inoculados con 2x104 a 6x104 T. cruzi aislados de pacientes con megacolon y megaesófago.19 Estos autores evidencian los megas mediante radiografía de contraste utilizando bario mezclado con el alimento a ser ingerido por los ratones, ya que en experiencias preliminares demostraron que la sola presión de inyección de bario por vía oral o rectal originaba megas artificiales. Comentan que esto pudo ser un factor de error importante en un estudio similar20donde los autores reportan la obtención de megacolon.

Los estudios histopatológicos muestran como características principales la miositis y alteraciones del plexo mioentérico con destrucción de los mismos en la mayoría de los casos. Estos hallazgos concuerdan con los de otros autores21y se señalan como determinantes en las alteraciones anatomofuncionales observadas en la enfermedad.22 Apoyan estos señalamientos la obtención de magaíleon artificial23con destrucción del plexus mioentérico luego de la aplicación tópica de Cloruro de Benzalconio en el intestino de la rata.

Es de hacer notar que en nuestro estudio, el grado extremo de dilatación como el mostrado en la Figura 1a, fue la excepción siendo la regla la distensión en diferentes grados, hecho este, que se reflejó en el estudio histopatológico, en donde observamos el mismo patrón de alteraciones con variaciones en intensidad. Se conoce que tanto en casos humanos24 como experimentales,25 ningún segmento del tracto gastro intestinal está exento de algún grado de denervación intrínseca del plexo parasimpático.

Llama la atención las alteraciones en páncreas, en donde observamos que mientras parte de la glándula luce aparentemente normal o con discretas alteraciones, otra parte presenta grados extremos de edema con la consecuente separación de acinos, infiltrado inflamatorio y destrucción de los islotes de Langerhans. La invasión de este órgano por T. cruzi en la fase aguda es conocida,26 del mismo modo, se observa pancreatitis en ratones en fase crónica de la enfermedad.21 La hiperglicemia e hipolipemia son signos presentes en pacientes con megacolon que se han relacionado con alteración de la absorción intestinal hablándose de un "síndrome paradógico", se observa hiperabsorción de glucosa y mala absorción de grasas que constituyen lo que se ha denominado enteropatía chagásica.27

Los niveles elevados de glicemia en pacientes chagásicos han sido interpretados como debidos: 1) a una hiperabsorción aguda de glucosa, 2) a una hipersecresión de glucagón con el consiguiente aumento de la glicogenólisis hepática y/o 3) a la denervación del parasimpático ya que se ha observado hiperglicemia y mala absorción de grasas luego de vagotomía.11No obstante lo antes mencionado, las serias alteraciones pancreáticas aquí referidas relacionadas con pérdida de la estructura lobulillar por edema inflamatorio interacinar y destrucción de los islotes de Langerhans muy bien podrían explicar el "síndrome paradógico" de hiperglicemia con mala absorción de grasas.

En relación a las alteraciones miocardíacas, estas son negligibles. Nuestra experiencia revela que mientras las alteraciones en los intestinos son intensas, en miocardio son ligeras o inexistentes. Estudios de miocardiopatía chagásica crónica realizados en cepas de ratones homocigotos,28 refieren que las cepas BALB/c, DBA/1 y DBA/2, entre otras, inoculadas con la cepa brasilera de T. cruzi (BFT) presentaron los grados de miocardiopatía crónica más severas.  

Sin embargo, en estudios experimentales se ha observado que diferentes aislados de T. cruzi presentan diferente tropismo, se habla de cepas miotropas y reticulotropas29, 30 y también de cepas productoras de cardiopatías o de megas.20También se dice que la asociación de megas con cardiopatías es baja.31De hecho en Brasil que es hasta ahora el país donde más se ha observado esta patología, la prevalencia de megas con cardiopatía chagásica es del 2,6 al 20%.30, 32 En Venezuela y Centro América no se han reportado megas.

Los estudios histopatológicos que referimos no muestran diferencias en las alteraciones observadas en relación a la procedencia del parásito. Recientemente se ha referido que los patrones patológicos observados en ratones BALB/c no están relacionados ni a la frecuencia de la infección, ni a la carga parasitaria ni a un clon particular del parásito utilizado.33

Nuestra experiencia no nos permite concluir respecto al tropismo o a la relación miocardiopatía megas, pero parecería que la interacción BALB/c- T. cruzi Y en las condiciones presentadas en este trabajo, podría constituir un modelo crónico de la enfermedad con expresión de alta patogenicidad a nivel digestivo.

Los altos títulos de anticuerpos detectados en todos los casos pone en evidencia la constante estimulación antigénica producto de la presencia del parásito demostrado mediante las experiencias de inmunosupresión y xenodiagnóstico.13

RESUMEN

Se evaluó la histopatología y respuesta humoral de ratones BALB/c que sobrevivieron después de la infección con formas tripomastigotes de sangre y de cultivo celular de T. cruzi Y.

Los animales estudiados fueron los ratones que superaron la fase aguda de la infección, denominados Susceptibles13 y los ratones en los cuales la presencia del parásito se detectó después de haber sido inmunosuprimidos, denominados Poco Susceptibles.13

La autopsia en todos los animales reveló distensión del intestino grueso, mientras el tamaño del miocardio fue aparentemente normal.

Los estudios histopatológicos del tracto gastrointestinal mostraron miositis, miolisis y destrucción del plexo mioentérico. Estas alteraciones incrementaron en intensidad a lo largo del tracto gastrointestinal, apareciendo ligeras y moderadas entre la región del cardias y el intestino delgado e intensas en el colon y recto. Solo en tres casos fueron detectados parásitos.

Las alteraciones del páncreas condujeron a la pérdida de la arquitectura de la glándula, presentando intenso edema e infiltrado inflamatorio entre los acinos glandulares y necrosis de los Islotes de Langerhans.

Los cambios histológicos del miocardio fueron moderados. Observándose pequeños focos inflamatorios de células mononucleares cerca de los grandes vasos del atrium y el ventrículo derecho. No se observaron parásitos.

En todos los animales se detectaron títulos altos de IgG específica.

El estudio no reveló diferencias relacionadas con la procedencia de los tripomastigotes.

Trabajo financiado por el CDCHT-ULA bajo el Código No. C-868-97.
* Laboratorio de Inmunología de Parasitosis, Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de Los Andes, Mérida - Venezuela.

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