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Revista chilena de infectología

versión impresa ISSN 0716-1018

Rev. chil. infectol. v.17 n.4 Santiago  2000

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182000000400006 

Diarrea asociada a Clostridium difficile:
Evaluación de varios métodos de diagnóstico

Isabel Briceño L.1, Patricia Garcia C.1, Manuel Alvarez L.2, Marcela Ferres G.3 y
Teresa Quiroga G.1

DIARRHEA ASSOCIATED TO Clostridium difficile: EVALUATION OF
SEVERAL DIAGNOSTIC METHODS

Clostridium difficile is the principal pathogen related to antibiotic associated diarrhea and/or pseudomembranous colitis in hospitalized patients. The diagnosis is based on the clinical suspicion and the presense of a positive laboratory test for the detection of toxin of C. difficile, but the confirmation is based on the cytotoxicity test. Recently vartious immunoassays have been introduced that allow a rapid diagnosis of this disease, but they have different sensibility and specificity and that is why the need to be evaluated with respect to the reference method. The objective of this study was to evaluate correlation between 5 immunoassays and this confirmatory cytotoxicicty method. The stool samples of 60 patients with clinical suspicion of C. difficile associated diarrhea were studied by 4 immunoasssays: 3 ELISA (Tox A Meridian TM, Tox A Becton Dickinson TM and Tox A+B Tech Lab TM) and one immunochromatographic card type: Immunocard Tox A Meridian TM. Forty-six out of sixty samples were tested by a recently introduced card: C. difficile Tox A Oxoid TM. The cytotoxicity assay was considered the confirmatory test.The sensitivity and specificity observed for Tox A Meridian TM was 95.7% and 78,8% respectively, for Tox A Becton Dickinson TM it was 100% and 94.4% for Tox A+B Tech Lab TM it was 91.3% and 86.5%, for Immunocard Tox A Meridian TM it was 87% and 94.6% and for C. difficile Tox A Oxoid TM it was 94.7% and 96.3%. According to the results we found, the most recommended tests are Tox A Becton Dickinson TM and C. difficile Tox A Oxoid
TM. Which of these to choose depends on the equipment of the laboratory and necessity of a rapid result.
Key words: Clostridium difficile, Diarrhea; Toxin detection; Toxin A; Toxin B.

INTRODUCCION

Clostridium difficile es un bacilo Gram posi-tivo, anaerobio estricto, esporulado, con potencial de producir toxinas y excepcionalmente invasor, responsable de 90% de los casos de colitis pseudomembranosa y de aproximadamente 20% de los casos de "diarrea asociada al uso de antibióticos".1-5 Los casos clínicamente significativos se asocian con cepas de C. difficile productoras de toxinas A y B, que se cree actuarían sinérgicamente en la generación del cuadro.3, 4, 6 Bajo condiciones normales, alrededor de 10% de la población adulta porta C. difficile en el intestino.1, 6 La condición de portador asintomático se describe en 10 a 33% de los adultos hospitalizados y en los neonatos entre 60 y 70%. La transmisión nosocomial a través del contacto directo paciente-paciente es frecuente y de difícil control, contribuyendo a un significativo aumento de la morbilidad y de los días de hospitalización.3, 7

El principal factor de riesgo para el desarrollo de esta patología corresponde al uso de antibióticos, asociándose con mayor frecuencia a tratamientos con clindamicina, ampicilina y cefalosporinas.8, 9 El antibiótico sería el responsable de la alteración de la flora bacteriana colónica normal, permitiendo la infección por C. difficile, cuyas toxinas serían las responsables finales del daño a la mucosa intestinal y del proceso inflamatorio1. Revisiones recientes muestran que los componentes esenciales para la aparición de la infección son la ya mencionada exposición al antibiótico y el contacto con la cepa toxigénica de C. difficile. Factores adicionales son la susceptibilidad o inmunidad del huésped y la virulencia del microorganismo. Se postula que la condición de portador asintomático no aumentaría el riesgo de desarrollar la patología8 y el uso de tratamiento específico en ellos no se justifica, ya que no permite erradicar el agente causal.

El diagnóstico de la enfermedad asociada a C. difficile es usualmente difícil desde el punto de vista clínico, debido a que no hay acuerdo en los exámenes a obtener y en la estrategia diagnóstica ni en los criterios clínicos para la selección de los pacientes en que se solicitará el estudio. Dadas estas dificultades, para definir los casos de diarrea asociada a C. difficile (DACD) en los estudios publicados, se han utilizado criterios clínicos y de laboratorio. Los más útiles han resultado ser: 1) 6 emisiones de deposiciones líquidas en las últimas 36 horas o 3 episodios en las últimas 24 horas, 2) antecedente de uso de antibióticos en un período de hasta 8 semanas previas al inicio del cuadro, 3) observación de pseudomembranas en el estudio endoscópico de intestino bajo, 4) muestra de deposiciones con hallazgo de C. difficile toxigénico, 5) respuesta favorable a tratamiento específico y 6) ausencia de otra etiología para la diarrea.

El diagnóstico de laboratorio de la infección por C. difficile busca demostrar la presencia de sus toxinas (A y/o B) en las deposiciones, pero aún no existe un test ideal para tales efectos, por lo que las recomendaciones generales para realizar el diagnóstico son el uso de criterios clínicos unidos a un test de laboratorio positivo que demuestre la presencia de estas toxinas. El test de mayor especificidad (97 a 100%) en el diagnóstico es la detección del efecto citopático de la toxina B en cultivos celulares (test de citotoxicidad) y ha sido considerado durante mucho tiempo como la técnica de referencia.1, 8, 10-12 Sin embargo, sus desventajas son numerosas, ya que se trata de un test no estandarizado, requiere experiencia en la técnica del cultivo celular, infraestructura adecuada y un tiempo de procesamiento prolongado (48 a 72 horas). Por todas estas razones, desde 1990 se han introducido en el mercado un número importante de enzimo inmunoensayos (EIA) para la detección de la toxina A y para las toxinas A y B de C. difficile. Estos ensayos se correlacionan con el test de citotoxicidad en más de 90% de los casos, lo que indica que poseen una muy buena especificidad, pero es posible observar una importante variación en la sensibilidad descrita en la literatura, entre 53 y 100%,1-4, 8, 13, 14, 16 además de un alto porcentaje de resultados indeterminados, hasta 19%.2 De reciente desarrollo, las técnicas de biología molecular permiten detectar cantidades muy bajas de toxinas presentes en las deposiciones; sin embargo, requieren mayores estudios que permitan su estandarización y validación.
La presencia de leucocitos fecales en las muestras con sospecha de DACD, ha sido utilizada en muchas ocasiones por los clínicos como un primer paso en el diagnóstico dada su amplia disponibilidad en los laboratorios clínicos hospitalarios; sin embargo, esta técnica ha demostrado tener un pobre valor predictivo,2 con una sensibilidad descrita en la literatura inferior al 40%. Mejores resultados se han obtenido con la determinación de lactoferrina fecal con ensayos de aglutinación por látex (75% de sensibilidad).15 La lactoferrina es un marcador leucocitario por lo que su detección por técnicas de látex sería menos subjetiva que la observación microscópica de leucocitos.

Basados en las divergencias que persisten en el diagnóstico de laboratorio de la DACD, la escasa información de experiencia nacional publicada al respecto y el número importante de inmunoensayos disponibles y utilizados en los laboratorios clínicos del país, en este estudio se evaluó la correlación entre cinco inmunoensayos y el test confirmatorio de citotoxicidad en el diagnóstico de laboratorio para la DACD, y la utilidad de los leucocitos fecales por microscopia y determinación de lactoferrina fecal para el diagnóstico de esta patología.

MATERIAL Y METODO

Entre septiembre de 1997 y enero de 1998, se estudiaron en forma prospectiva las muestras de deposición de 60 pacientes internados en el Hospital Clínico de la Pontificia Universidad Católica de Chile. Todos los pacientes presentaban un cuadro clínico compatible con diarrea por C. difficile (diarrea y antecedente de uso reciente de antibióticos) ya que fueron evaluados por uno de los autores, seleccionándose a aquellos pacientes con una alta probabilidad pre-test de presentar diarrea por antibióticos. Las muestras se estudiaron mediante cuatro inmunoensayos, 46 de ellas fueron estudiadas por un test adicional de reciente introducción (Clostridium difficile Tox A Oxoid â).

• ELISA Toxina A Meridianâ: test de enzimoinmunoanálisis realizado en micropocillos. Utiliza un anticuerpo policlonal de captura anti toxina A de C. difficile y un segundo anticuerpo monoclonal anti toxina A de C. difficile unido a un conjugado enzimático.

• ELISA Toxina A Becton Dickinsonâ: test de enzimoinmunoanálisis realizado en micropocillos. Utiliza un anticuerpo policlonal de captura anti toxina A de C. difficile y un segundo anticuerpo monoclonal anti toxina A de C. difficile unido a un conjugado enzimático.

• ELISA Toxina A y B TechLabâ: test de enzimoinmunoanálisis realizado en micropocillos que utiliza un anticuerpo de captura policlonal anti toxina A y B. Los anticuerpos de detección corresponden a una mezcla de anticuerpo monoclonal anti toxina A y anticuerpo policlonal anti toxina B conjugados con peroxidasa.

• Immunocard Tox A Meridianâ: ensayo tipo tarjeta, que utiliza un anticuerpo monoclonal específico para toxina A de C. difficile.

Clostridium difficile Tox A Oxoidâ: ensayo tipo tarjeta, que utiliza un anticuerpo monoclonal específico para toxina A de C. difficile. El procesamiento es sencillo, rápido y los controles de la reacción están incluidos en la misma tarjeta. Sólo 46 muestras pudieron ser procesadas por este método, ya que el volumen de muestra fue insuficiente.

La determinación de leucocitos fecales se realizó por microscopia convencional y la detección de lactoferrina fecal por un test de aglutinación en látex (Leukotest TechLabâ). La lactoferrina es una proteína estable que sirve como marcador de los leucocitos presentes en las muestras de deposición. El test cuenta con partículas de látex recubiertas con anticuerpos anti lactoferrina que producen una reacción de aglutinación en presencia de muestras de deposición que contengan leucocitos.

Todas las muestras fueron procesadas antes de 24 horas, basado en las recomendaciones de cada fabricante.

El test de citotoxicidad busca detectar el efecto citopático de la toxina B de C. difficile sobre cultivos de fibroblastos humanos y la neutralización de tal efecto tras la incubación con la correspondiente antitoxina. En nuestro estudio se utilizó toxina y antitoxina disponible comercialmente (Clostridium difficile Toxin/Antitoxin Kit. TechLabâ) para el montaje de la técnica. Las muestras de deposiciones fueron refrigeradas a 4°C y procesadas antes de 24 horas (dilución en buffer fosfato salino, centrifugación y filtración). Las muestras fueron inoculadas en monocapas de fibroblastos humanos y se observaron a las 24 y 48 horas. El test positivo fue definido como la aparición de los efectos citopáticos característicos en más del 50% de la monocapa de células y todos los resultados positivos fueron verificados por la demostración de la neutralización del efecto citopático al agregar antitoxina específica.

RESULTADOS

De las 60 muestras, 23 (38%) fueron positivas por el test de referencia de citotoxicidad para toxina B de C. difficile. La sensibilidad y especificidad para cada inmunoensayo fue calculada en relación a los resultados de test de citotoxicidad, pero para cada test se excluyeron los resultados indeterminados que son expresados en un porcentaje adicional (Tablas 1 a 5).


Tabla 1. Rendimiento del test ELISA Toxina A Meridianâ versus el test de
citotoxicidad

  Citotoxicidad (+) Citotoxicidad (-)

Total


ELISA A (+) 22 07 29
ELISA A (-) 01 26 27
       
Total000000 23 33 056*
       

* Hubo 4 (6,7%) muestras indeterminadas por el test ELISA Toxina A Meridianâ.



Tabla 2. Rendimiento del test ELISA Toxina A Becton Dickinsonâ versus
el test de citotoxicidad


  Citotoxicidad (+) Citotoxicidad (-) Total

ELISA A (+) 23 02 25
ELISA A (-) 00 34 34
       
Total000000 23 36 059*
       
* Hubo 1 (1,7%) muestra indeterminada por el test ELISA A Becton Dickinsonâ.


Tabla 3. Rendimiento del test ELISA Toxina A y B TechLabâ versus
el test de citotoxicidad

  Citotoxicidad (+) Citotoxicidad (-) Total

ELISA A+B (+) 21 05 26
ELISA A+B (-) 02 32 34
       
Total000000000 23 37 60


Tabla 4. Rendimiento del test Immunocard Tox A Meridianâ versus el
test de citotoxicidad

  Citotoxicidad (+) Citotoxicidad (-) Total

Immunocardâ (+) 20 02 22
Inmunocardâ (-)0 03 35 38
       
Total0000000000 23 37 60


Tabla 5. Rendimiento del test Clostridium difficile Tox A Oxoidâ
versus el test de citotoxicidad

  Citotoxicidad (+) Citotoxicidad (-)

Total


ELISA (+) 18 1 19
ELISA (-) 1 26 27
       
Total00000 19 27 46*

* Sólo fue posible estudiar 46 muestras para este inmunoensayo.

La sensibilidad y especificidad observada fueron respectivamente: para Toxina A Meridianâ 95,7 y 78,8%, Toxina A Becton Dickinsonâ 100 y 94,4%, Toxina A/B TechLabâ 91,3 y 86,5%, Immunocard ToxA Meridianâ 87 y 94,6% y C. difficile Tox A Oxoidâ 94,7 y 96,3% (Tabla 6).


Tabla 6. Sensibilidad y especificidad para los 5 inmunoensayos evaluados*

Test Sensibilidad (%) Especificidad (%)

Toxina A Meridianâ 95,7 78,8
Toxina A Becton Dickinsonâ 100000 94,4
Toxina A/B TechLabâ 91,3 86,5
Toxina A Immunocard-Meridianâ 87,0 94.6
Toxina A C. difficile Oxoidâ 94,7 96,3
     
* En comparación con el test de referencia de citotoxicidad.

Los test de ELISA para Toxina A Meridianâ y ELISA Toxina A Becton Dickinsonâ presentaron resultados indeterminados, en 6,7 y 1,7%, respectivamente.

En relación a la determinación de leucocitos fecales por microscopia y de lactoferrina fecal, la sensibilidad y especificidad calculada para los test se describen en la Tabla 7.


Tabla 7. Sensibilidad y especificidad de los leucocitos fecales por microscopía y
test de latex en relación al test de referencia de citotoxicidad

Test Sensibilidad (%) Especificidad (%)

Leucocitos fecales (microscopia) 57,1 53,3
Lactoferrina fecal TechLabâ 69,6 61,1

DISCUSION

C. difficile es una de las principales causas de diarrea en pacientes hospitalizados con una importante morbilidad asociada. Es el responsable de 15 a 20% de las diarreas asociadas al uso de antibióticos y de la mayoría de los casos de colitis pseudomembranosa. La diarrea nosocomial debido a infección por C. difficile es un problema real y de magnitud desconocida en nuestro país; de acuerdo a la literatura médica, es causal de 20 a 30% de las diarreas intrahospitalarias y afecta a 8% de los pacientes hospitalizados. En nuestra serie el porcentaje de positividad fue alto (38%) porque hubo una selección clínica de las muestras, escogiendo aquellas con una alta probabilidad pre-test: pacientes de mayor edad, mayor frecuencia y severidad de la diarrea y fiebre.

El diagnóstico de enfermedad asociada a C. difficile es habitualmente difícil, ya que no se ha logrado acuerdo sobre los criterios clínicos a usar que tengan el mejor valor predictivo y tampoco existe un test de laboratorio lo suficientemente sensible, específico y rápido para su diagnóstico.

La detección del efecto citopático de la toxina B de C. difficile en cultivos celulares tiene un alto valor predictivo en pacientes con características epidemiológicas y manifestaciones clínicas sugerentes. Ha sido considerada y utilizada ampliamente como la técnica de referencia; sin embargo, el tiempo de procesamiento que requiere, el costo, la experiencia del operador y sus dificultades en la estandarización, la hacen una técnica difícil de implementar en un laboratorio de rutina. Por ello se han desarrollado nuevos tests, entre los cuales los EIA han mostrado un concordancia mayor al 90% con el test de citotoxicidad. El problema se presenta al analizar el amplio rango de sensibilidad descri-ta en la literatura para los distintos inmunoensayos disponibles en el mercado. Consideramos relevante estudiar la correlación entre cinco inmunoensayos disponibles en Chile y el test de citotoxicidad en muestras de deposición de pacientes con sospecha clínica de DACD, junto con la utilidad de la determinación de leucocitos fecales por microscopia convencional en comparación con la determinación de lactoferrina fecal en el diagnóstico de esta patología.

En base a los resultados obtenidos los tests más recomendables son Toxina A Becton Dickinsonâ y C. difficile Tox A Oxoidâ. El primero es un test de ELISA que requiere un control positivo y uno negativo cada vez que se realiza la técnica, un lector espectrofotométrico para disminuir los resultados indeterminados y un tiempo de procesamiento de 100 minutos. El segundo es un ensayo tipo tarjeta de fácil procesamiento y lectura, con controles incluidos para cada determinación (permite el procesamiento uno a uno), que requiere de una microcentrífuga para la preparación de la muestra y de 45 minutos para su procesamiento. Por lo tanto, según el equipamiento, volumen de muestras a procesar y requerimientos de tiempo de respuesta de cada laboratorio, se debe establecer el tipo de inmunoensayo a utilizar.

La especificidad y sensibilidad que se observó para la determinación de leucocitos fecales resultó ser superior a la descrita en la literatura y para lactoferrina fecal similar. Metodológicamente, la determinación de lactoferrina fecal es más simple y fácil de determinar. Ambas determinaciones sólo indican el carácter inflamatorio de la diarrea, sin relación con el agente etiológico por lo tanto no se recomienda su uso como test discriminatorio en esta patología.

Dado que existen numerosos inmunoensayos para la detección rápida de toxina de C. difficile con sensibilidad y especificidad variables, es necesaria su evaluación por un método de referencia. Surge por lo tanto la necesidad de disponer de este método confirmatorio (test de citotoxicidad) para muestras positivas y/o indeterminadas cuando la clínica no es altamente sugerente de infección por C. difficile. El diagnóstico de DACD requiere entonces, de un complemento entre criterios clínicos con un alto valor predictivo y demostración, a través de un test de laboratorio, de la presencia de C. difficile toxigénico.

A las dificultades diagnósticas planteadas se agrega información reciente de caracterización de cepas de C. difficile Toxina A -negativa Toxina B- positiva, a través de técnicas de biología molecular, responsables de brotes nosocomiales de DACD.17, 19, 21 ,23 Aunque anteriormente se había descrito su existencia, no se observó asociación clínica de importancia como la analizada en los casos más recientes. Estas cepas no son detectadas por los inmunoensayos para toxina A disponibles, pero sí por los tests para detección de toxina A + B. Ante estos hallazgos cabe plantearse la necesidad de realizar estudios epidemiológicos a través de técnicas de biología molecular18, 22, 23 que permitan conocer nuestra realidad en relación a este patógeno y establecer medidas de control para evitar su transmisión nosocomial en pacientes con factores de riesgo o evitar el alto porcentaje de recurrencias (48,4%)20 y reinfecciones observado. Para el diagnóstico de rutina a través de inmunoensayos, a la luz de estos casos, probablemente sea necesario el uso de tests que detecten la presencia de toxinas A y B paralelamente. En nuestro estudio no hubo muestras positivas por el test de citotoxicidad (toxina B) y por el inmunoensayo que detecta ambas toxinas (A + B) y negativas por los otros inmunoensayos que detectan sólo toxina A, por lo que creemos que al momento del presente estudio, este no sería un problema adicional en nuestro medio.

RESUMEN

Clostridiun difficile es el principal patógeno asociado a diarrea por uso de antibióticos y/o colitis pseudomembranosa en pacientes hospitalizados. El diagnóstico se basa en la sospecha clínica y presencia de un test de laboratorio positivo para la detección de toxina de C. difficile, considerándose como confirmatorio el test de citotoxicidad. Recientemente se han introducido variados inmunoensayos que permiten el diagnóstico rápido; sin embargo, presentan sensibilidad y especificidad variables por lo que requieren ser evaluados por el método de referencia. El objetivo de este trabajo fue evaluar la correlación entre cinco inmunoensayos y el test confirmatorio de citotoxicidad. Para esto se estudiaron las muestras de deposiciones de 60 pacientes hospitalizados con sospecha clínica de diarrea por C. difficile mediante 4 inmunoensayos: 3 ELISA (ToxA Meridianâ, Tox A Becton Dickinsonâ y Tox A + B TechLabâ) y 1 ensayo inmunocromatográfico tipo tarjeta: Inmunocard Tox A Meridianâ.

Cuarenta y seis muestras de las 60 se evaluaron por un test tipo tarjeta de reciente introducción: C. difficile ToxA Oxoidâ. Como test confirmatorio se consideró el test de citotoxicidad. La sensibilidad y especificidad observadas fueron respectivamente: para ToxA Meridianâ 95,7 y 78,8%, Tox A Becton Dickinsonâ 100 y 94,4%, Tox A + B TechLabâ 91,3 y 86,5%, Inmunocard Tox A Meridianâ 87 y 94,6% y C. difficile ToxA Oxoidâ 94,7 y 96,3%. De acuerdo a los resultados, los test más recomendables serían Tox A Becton Dickinsonâ y C. difficile ToxA Oxoidâ. Según el equipamiento y requerimientos de tiempo de respuesta de cada laboratorio, se debe establecer el tipo de inmuno-ensayo a utilizar.

Facultad de Medicina. Pontificia Universidad Católica de Chile.
1 Unidad Docente Asociada de Laboratorios Clínicos.
2 Departamento de Gastroenterología.
3 Departamento de Pediatría.

Correspondencia a:
Patricia García Cañete
Laboratorio de Microbiología
Centro Médico San Joaquín
Universidad Católica de Chile
Av. Vicuña Mackenna 4686, Macul
Santiago, Chile
e-mail:pgarcia@med.puc.cl

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