SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.18 número4Colonización de recién nacidos prematuros y de sus madres por Ureaplasma urealyticumSituación epidemiológica de la infección por virus de inmunodeficiencia humana/síndrome de inmunodeficiencia adquirida en Chile Diciembre de 2000 índice de autoresíndice de materiabúsqueda de artículos
Home Pagelista alfabética de revistas  

Servicios Personalizados

Revista

Articulo

Indicadores

Links relacionados

Compartir


Revista chilena de infectología

versión impresa ISSN 0716-1018

Rev. chil. infectol. v.18 n.4 Santiago  2001

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182001000400003 

  Comparación de reacción de polimerasa en cadena,
látex y antibiograma para detección de

Staphylococcus aureus meticilina resistente

M. TERESA ULLOA F.1, LORENA PORTE T.1,2, ALEJANDRA CARMI K.3,
CARMEN VARELA A.2 y ALBERTO FICA C.4

COMPARISON OF POLYMERASE CHAIN REACTION,
LATEX AND DISK DIFFUSION FOR DETECTION OF
METHICILLIN-RESISTANT Staphylococcus aureus

1 Programa de Microbiología-Micología, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile.
2 Laboratorio de Microbiología, Hospital Parroquial de San Bernardo.
3 Estudiante de Medicina, Universidad de Chile.
4 Unidad de Infectología, Departamento de Medicina, Hospital Clínico Universidad de Chile.

Rapid, accurate discrimination of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is essential for appropriate therapeutic management and timely intervention in infection control. The most important mechanism of methicillin resistance in S. aureus is based on the production of PBP2a, which is encoded by the mecA gene. Most laboratories use disk diffusion to detect MRSA. At present, commercially available slide latex agglutination tests for the detection of PBP2a and PCR for the mecA

gene allow faster diagnosis. The purpose of this study was to compare an MRSA screen test (Denka Seiken Co., Ltd.) and the disk diffusion techniques with the gold standard PCR for the detection of methicillin resistance. A total of 73 S. aureus isolates were tested, 34/73 were methicillin resistant strains by the three methods. Two isolates were negative for the mecA gene and PBP2a, but showed resistance by the disk diffusion technique, due to a ß-lactamase. All the susceptible isolates (37/73) were negative by PCR and latex tests. Sensitivity value was 100% for slide latex agglutination and disk diffusion tests while specificity was 100% and 94,9%, respectively. The MRSA screen test is a highly sensitive and specific test for detection of methicillin resistance. However, negative strains should be tested by disk diffusion.

Key words: Staphylococcus aureus, Methicillin resistance, Polymerase chain reaction, Latex agglutination techniques, Disk diffusion test, Rapid laboratory diagnosis.

Desde su aislamiento por primera vez en Londres en 1961 y, a fines de esa década en nuestro país, Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SAMR) se ha transformado en uno de los principales agentes de infección nosocomial tanto en Chile como en el mundo1-3. En nuestro medio, SAMR representa el 55,6% de las cepas de S. aureus aisladas de infecciones intrahospitalarias, lo que da cuenta de su impacto en la morbilidad y mortalidad hospitalaria y en el aumento de costos de la atención4. El control de la situación de alta endemia de este patógeno se basa fundamentalmente en la implementación de aislamiento de contacto, búsqueda activa de portadores y su tratamiento (en brotes), y el uso de vancomicina en pacientes infectados5. Para la puesta en marcha de estas medidas resulta esencial disponer de métodos confiables de detección rápida de SAMR1,5. Más aún, la posibilidad de disponer en forma rápida de la susceptibilidad antimicrobiana de S. aureus, permite el inicio oportuno y documentado del tratamiento con cloxacilina, fármaco de elección en el caso de cepas sensibles. Este hecho evita el uso innecesario de vancomicina y favorece el control del surgimiento de resistencia a este antibacteriano en otras especies asociadas a infecciones intrahos-pitalarias.

El mecanismo más importante de resistencia a meticilina (oxacilina) es la expresión de una proteína ligadora de penicilina (PBP) denominada PBP2a, la cual es codificada por el gen cromosomal mecA y se caracteriza por presentar muy baja afinidad por los ß-lactámicos6-9. La expresión fenotípica de esta resistencia suele ser heterogénea, es decir, a pesar de que todas las células de una población posean el gen, sólo 1 en 104 a 1 en 108 la manifiestan, dificultando su detección en el laboratorio8. Varios factores influyen en la expresión del fenotipo resistente, los que deben considerarse al realizar pruebas de susceptibilidad antimicrobiana tales como el agar screening para oxacilina y el antibiograma. Estas condiciones se refieren al uso de oxacilina incluida en el agar (6 µg/ml), la incorporación de NaCl al medio de cultivo (4%), la incubación a 30 ó 35º C y la incubación por 24 horas completas5,8.

Este último hecho, sumado a las 16 a 18 horas necesarias para obtener crecimiento bacteriano en el cultivo de la muestra clínica, implica aproximadamente 48 horas antes de disponer de la susceptibilidad antimicrobiana, retardándose el inicio de la terapia antibacteriana más adecuada.

En la búsqueda de metodologías sensibles y específicas que reduzcan el tiempo diagnóstico, se han desarrollado diversas técnicas rápidas. Entre éstas destacan los sistemas automatizados de microdilución, tales como, la tarjeta Vitek GPS-SA (bioMérieux Vitek, Inc., Hazelwood, Mo.), el sistema Rapid ATB Staph (bioMérieux, La Balme-Les Grottes, France) y el sistema Rapid Microscan Panel (Baxter Microscan, West Sacramento, Calif.), los que entregan resultados en 3,5- 15, 5 y 5 a 11 horas, respectivamente5. Otro método rápido es el sistema Cristal MRSA ID (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany), que detecta resistencia a oxacilina en 4 a 5 horas. El kit utiliza un indicador de fluorescencia que es sensible a la presencia de oxígeno en un caldo con la bacteria, 4mg de oxacilina y NaCl al 2%. Cuando hay oxígeno, no se detecta fluorescencia. En cambio, al consumirse el oxígeno mediante el proceso de respiración bacteriana, aparece la fluorescencia1,10.

La principal limitación de los métodos antes mencionados es que son técnicas fenotípicas, por lo que pueden verse afectadas por la heterogeneidad en la expresión de resistencia propia de SAMR. Debido a esto, se considera a la reacción de la polimerasa en cadena (RPC) como el gold standard para la detección de este tipo de resistencia. Sin embargo, la mayoría de los laboratorios asistenciales en nuestro medio no disponen aún de esta técnica ni del personal entrenado para realizarla. En este contexto, la existencia de un método que detecte el producto del gen mecA, constituiría una alternativa más confiable clínicamente que los métodos estándares de que se dispone actualmente5.

En 1998, autores japoneses describieron el desarrollo de una técnica de látex para la detección rápida (20-30 minutos) de la PBP2a5,11,12. El ensayo consiste en partículas de látex sensibilizadas con anticuerpos monoclonales y se encuentra disponible en forma comercial desde el año pasado en nuestro país. El uso de este método facilita el reconocimiento de SAMR en pocos minutos, adelantando el resultado en al menos 24 horas y permitiendo la indicación terapéutica adecuada en la gran mayoría de los casos.

El objetivo del presente trabajo fue comparar el rendimiento diagnóstico para la detección de SAMR, de un kit comercial de aglutinación por látex (Denka Seiken Co., Ltd.) y del antibiograma versus la detección del gen mecA por RPC.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se analizaron 73 cepas de S. aureus aisladas en forma consecutiva entre mayo y agosto de 2000, de pacientes hospitalizados en la Fundación Hospital Parroquial de San Bernardo. Se incluyó sólo una cepa por paciente. La identificación de género y especie se realizó mediante las técnicas reconocidas internacional-mente (catalasa y coagulasa en tubo)8. En el estudio de susceptibilidad antimicrobiana para detección de SAMR se utilizó el método de antibiograma (NaCl 4%, incubación a 35º C por 24 horas), la aglutinación por látex (MRSA-Screen, Denka Seiken Co., Ltda.) y la amplificación del gen mecA mediante RPC. La técnica de antibiograma y los puntos de corte para la interpretación de los halos observados fueron los señalados por el NCCLS13. Las pruebas de aglutinación por látex y antibiograma se realizaron en una primera etapa entre junio y julio de 2000 y la detección del gen mecA por PCR se efectuó en julio del 2001. En ambas etapas las pruebas fueron realizadas en doble ciego por los investigadores. Las cepas fueron mantenidas a -70º C entre ambos períodos.

La prueba MRSA-Screen es una técnica de aglutinación con partículas de látex sensibilizadas con anticuerpos monoclonales dirigidos contra la PBP 2a de S. aureus. La prueba se realizó según las instrucciones del fabricante. En breve, las colonias se obtuvieron de cultivos de 18 a 24 horas, sembrados en agar sangre de cordero al 5% e incubados a 37º C en atmósfera ambiental. Para efectuar la extracción de la PBP 2a, se tomó una asada cargada de colonias, la que se suspendió en 4 gotas del reactivo de extracción 1. Luego, la suspensión bacteriana fue sometida a ebullición por tres minutos y se la dejó enfriar a temperatura ambiente (aproximadamente 10 minutos). Posteriormente, se adicionó una gota del reactivo de extracción 2. La mezcla se centrífugó a 1.500 x g (3.000 rpm) por 5 minutos. Finalmente, se realizó la aglutinación colocando 50 µl del sobrenadante en la lámina plástica incluida en el kit, donde se mezcló con una gota del látex sensibilizado y se rotó manualmente por 3 minutos. Como control negativo se utilizaron 50 µl del sobrenadante, mezclado con una gota del látex de control negativo.

Se realizó la detección del gen mecA por RPC a todas las cepas incluidas en el estudio. Como ADN blanco se utilizó una suspensión bacteriana preparada a partir de una colonia en 100 µl de H2O destilada. Luego, la suspensión fue sometida a ebullición por 15 minutos y mantenida en hielo seco por 5 minutos. Para la amplificación del gen mecA se emplearon los partidores descritos por Ryffel C et al14 que permiten obtener un segmento de 161 pares de bases (pb). El volumen final de la reacción fue de 50 µl (buffer 10 x 4 µl, Mg 50 nM 1,2 µl; dNTPs 200 nM 1 µl; 1 µl de cada uno de los partidores; Taq polimerasa 1 U, ADN blanco

3 µl y agua bidestilada csp 50 µl). Las reacciones de amplificación fueron realizadas en un termociclador Gen Amp PCR system 2.400 Perkin Elmer. El programa empleado para la amplificación de mecA fue el siguiente: 94° C por 5 minutos, y 25 ciclos de denaturación a 94° C 20 segundos, apareamiento de los partidores a 55° C por 20 segundos y extensión a 72° C por 50 segundos. La extensión final fue de 72º C por 5 minutos. Los productos amplificados fueron analizados por electroforesis empleando geles de agarosa al 2%, corridos a 60 volts aproximadamente por 1 hora. El tamaño del amplicón fue comparado con ADN ladder 100 pb Gibco BRL. El ADN fue visualizado utilizando un transiluminador de luz UV después de la tinción con bromuro de etidio. Para la implementación de la técnica y como controles positivo y negativo, se empleó una cepa SAMR local y la cepa ATCC S. aureus 29.213, respectivamente.

RESULTADOS

Se incluyó un total de 73 cepas de S. aureus, correspondiendo 36 (49,3%) de ellas a SAMR y 37 (50,7%) a S. aureus sensibles a meticilina (oxacilina) por técnica de difusión en agar.

Mediante la técnica de RPC se investigó la presencia del gen mecA (Figura 1) en 73 cepas de S. aureus. En 34 de ellas se evidenció la presencia de un fragmento de 161 pb, similar al amplicón obtenido en la cepa meticilina resistente utilizada como control positivo.

De las 36 cepas resistentes por antibiograma, 34 resultaron PBP2a y mecA positivas (94,4%) y dos cepas fueron negativas por RPC y látex (5,6%) (Tabla 1). Ninguna de las 37 cepas sensibles por antibiograma presentó el gen mecA ni aglutinó con la prueba de látex. Se observó una correlación de 100% entre las técnicas de látex y RPC (Tabla 2).

Las dos cepas resistentes a oxacilina que no presentaron aglutinación con la prueba de látex ni evidenciaron presencia del gen mecA, manifestaron un perfil de resistencia al antibiograma compatible con la hiperproducción de ß-lactamasa. Este tipo de resistencia se caracteriza porque la cepa es resistente a oxacilina y susceptible a una asociación de ß-lactámico/inhibidor de ß-lactamasa, tal como amoxicilina/ácido clavulánico (Tabla 3). Además, generalmente no se observa asociación con resistencia a otros antimicrobianos, a diferencia de lo que ocurre con las cepas que poseen el gen mecA8.

De acuerdo a los resultados obtenidos, la prueba de látex presentó valores de sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo de 100%. Por su parte, el antibiograma mostró una sensibilidad de 100% y una especificidad de 94,9%, mientras que sus valores predictivo positivo y negativo correspondieron a 94,4 y 100%, respectivamente.

DISCUSIÓN

La técnica de aglutinación por látex demostró excelente rendimiento para la detección de resistencia a meticilina en S. aureus, destacando su facilidad de uso y 100% de concordancia con la técnica gold standard (la RPC). La prueba de aglutinación entregó resultados en 20 minutos, constituyendo el método más rápido de los tres ejecutados. Aunque la mayoría de las cepas de SAMR aglutinó en los primeros treinta segundos de agitación, algunas cepas requirieron completar los tres minutos recomendados por el fabricante antes de mostrar una reacción de aglutinación positiva, la que fue clara y evidente. Cabe destacar que ninguna cepa de SAMR presentó aglutinación positiva luego de 3 minutos.

Por su parte, el antibiograma presentó menor especificidad (94,9%) y valor predictivo positivo (94,4%), además de requerir 24 horas de incubación previo a su lectura e interpretación. No obstante lo anterior, cabe señalar que estos valores corresponden a la comparación con el gold standard (RPC para el gen mecA), el que si bien detecta el tipo de resistencia más frecuentemente encontrado entre las cepas de S. aureus, no incluye todos los mecanismos de resistencia a meticilina que pueden encontrarse en estos microorganismos. Existen cepas de S. aureus resistentes a meticilina que no poseen el gen mecA y que deben su resistencia a la modificación de los genes que codifican las

PBP normales, a la sobre-expresión de las PBP normales o a la hiperproducción de ß-lactamasa estafilocóccica7,8. Estas cepas presentan un nivel de resistencia "borderline" a oxacilina (4 a 8 µg/ml) y no producen PBP 2a5. En este estudio se analizaron dos cepas pertenecientes a este grupo, las que resultaron resistentes a oxacilina por técnica de difusión, pero mecA y PBP 2a negativas. La inclusión del disco de amoxicilina-ácido clavulánico en el antibiograma, reveló un fenotipo correspondiente a cepas hiperproductoras de ß-lactamasa, por lo que se las clasificó como portadoras de ese mecanismo de resistencia.

Resulta importante mencionar la ocurrencia de este fenómeno, tanto por sus implicancias terapéuticas como de laboratorio. En el primer caso, estudios clínicos e in vitro, indican que infecciones por este tipo de cepas responden al tratamiento con ß-lactámicos y que los pacientes afectados pueden no requerir medidas de aislamiento5. En el aspecto técnico, cabe destacar la capacidad del método MRSA-Screen para discriminar entre distintos mecanismos de resistencia, confirmando su alta especificidad y la importancia del antibiograma, subrayando su rol en aquellos casos en que las técnicas de látex y/o RPC para mecA resulten negativas.

RESUMEN

Un adecuado control de las infecciones por Staphylococcus aureus meticilina resistente requiere de un diagnóstico microbiológico rápido y confiable. El mecanismo más importante de resistencia a meticilina (oxacilina) en este agente es la expresión de PBP2a, codificada por el gen mecA. Nuevas técnicas como la aglutinación por látex para la detección de PBP2a y la reacción de la polimerasa en cadena (RPC) para la detección del gen mecA (gold standard), permiten su identificación con mayor rapidez que mediante el antibiograma (ATB). Objetivo: Comparar el rendimiento para la detección de SAMR del kit comercial de aglutinación por látex (Denka Seiken Co., Ltd.) y del ATB versus el gold standard (RPC). Material y métodos: Se analizaron 73 cepas de S. aureus de pacientes hospitalizados en el Hospital Parroquial San Bernardo. Resultados: 34/73 cepas resultaron positivas para mecA y PBP2a y resistentes por ATB. Dos cepas fueron negativas por RPC y látex, pero resistentes por ATB, comprobándose otro mecanismo de resistencia. El resto, 37/73 (50,6%) correspondió a cepas sensibles, que resultaron negativas por técnica de látex y RPC. Se obtuvo sensibilidad de 100% para ATB y látex y especificidades de 94,9 y 100%, respectivamente. Conclusión: La técnica comercial de aglutinación por látex presenta excelente rendimiento para la detección de resistencia mediada por PBP2a. Las cepas negativas requieren ATB.

BIBLIOGRAFÍA

1.- Kampf G, Lecke C, Cimbal A, Weist K, Rüden H. Evaluation of the BBL Crystal MRSA ID System for detection of oxacillin resistance in Staphylococcus aureus. J Clin Pathol 1999; 52: 225-7.         [ Links ]

2.- Yungue M, Barraza P, Enríquez N. Infecciones por Staphylococcus aureus meticilino resistente Hospital Roberto Del Río 1991-1992. Rev Chil Infect 1994; 11: 176-81.         [ Links ]

3.- Chávez A, Bahamondes D, Payá E, Mendoza C, Papic Z. Infecciones por Staphy-lococcus aureus meticilino resistente. Experiencia clínica. Rev Chil Infect 1995; 12: 152-6.         [ Links ]

4.- Otaíza F, Brenner P. Informe de las Infecciones Intrahospitalarias Chile 1993. Departamento de Epidemiología, División Programas de Salud, Ministerio de Salud 1996.         [ Links ]

5.- Van Griethuysen A, Pouw M, Van Leeuwen et al. Rapid slide latex agglutination test for detection of methicillin resistance in Staphylo-coccus aureus. J Clin Microbiol 1999; 37: 2789-92.         [ Links ]

6.- Vannuffel P, Laterre P, Bouyer M et al. Rapid and specific molecular identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in endotracheal aspirates from mechanically ventilated patients. J Clin Microbiol 1998; 36: 2366-8.         [ Links ]

7.- Waldvogel F. Staphylococcus aureus (Including Staphylococcal Toxic Shock). Mandell, Douglas and Bennet's Principles and Practice of Infectious Diseases. Fifth edition 2000, Mandell GL, Bennett JE and Dolin R, eds. Churchill Livingstone, Philadelphia, pp: 2070-92.         [ Links ]

8.- Quintiliani R, Sahm D, Courvalin P. Mechanisms of resistance to antimicrobial agents. Murray PR, Baron EJ, Pfaller M A, Tenover F C, Yolken RH. Manual of Clinical Microbiology. 7th edition. Washington DC ASM Press 1999, pp. 1505-25.         [ Links ]

9.- Kitagawa Y, Ueda M, Ando N et al. Rapid diagnosis of methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteremia by nested polymerase chain reaction. Ann Surg 1996; 224: 665-71.         [ Links ]

10.- Nicola F, Bantar C, Canigia LF, Relloso S, Bianchini H, Smayevsky J. Comparison of several methods to determine methicillin-resistance in Staphylococcus aureus with focus on borderline strains. Diagn Microbiol Infect Dis 2000; 36: 91-3.         [ Links ]

11.- Cavassini M, Wenger A, Jaton K, Blanc D, Bille J. Evaluation of MRSA-Screen, a Simple Anti-PBP 2a slide latex agglutination kit, for rapid detection of methicillin resistance in Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 1999; 37: 1591-4.         [ Links ]

12.- Jafri A K, Reisner B S, Woods G L. Evaluation of a latex agglutination assay for rapid detection of oxacillin resistant Staphylococcus aureus. Diagn Microbiol Infect Dis 2000; 36: 57-9.         [ Links ]

13.- National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; Eleventh Informational Supplement. NCCLS Document M100-S11. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, Pa. 2001.         [ Links ]

14.- Ryffel C, Tesch W, Birch-Machin I et al. Sequence comparison of mecA genes isolated from methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Gene 1990; 94: 137-8.         [ Links ]

Correspondencia a:
María Teresa Ulloa Flores
E-mail: mtulloa@machi.med.uchile.cl

Creative Commons License Todo el contenido de esta revista, excepto dónde está identificado, está bajo una Licencia Creative Commons