Rev Chil Infect (2002); 19 (3): 167 - 173

JUAN DÍAZ P.¹, PATRICIA GARCÍA C.¹, RICARDO DE LA BARRA D.¹, JORGE GASEP C.¹,
JORGE LEVICAN A.¹ y TERESA QUIROGA G.¹

The rapid diagnosis of microorganisms found in body fluids is clinically relevant. The Gram stain technique represents the main tool for this diagnosis but its sensitivity varies according to the sample type and the bacterial burden. Concentrating the sample enhances the stain sensitivity but a significant samples volume is required. Cytocentrifugation (CT) is useful because it requires less samples volume, thus obtaining more homogenous and concentrated preparations. To evaluate CT for diagnosis of body fluids, 52 samples obtained from sterile cavities were studied at the Emergency Laboratory at Pontificia Universidad Católica de Chile. The samples were processed with conventional centrifugation (CC) at 3000 rpm for 5 minutes and with CT at 2000 rpm for 10 minutes. From the sediment obtained through CC a smear for Gram staining and culture was done. From the sediment obtained by CT, a cellular monolayer in a 6 mm area was prepared for Gram staining. Both smears were analyzed by the same operator. Of 52 samples studied, 18 suggested clinical infection. Sensitivity for CT was 89 %, whereas sensitivity for CT showed 100%. Specificity was 100% in both methods. An increase in cellular concentration of samples was observed with CT compared to CC. These results confirm the usefulness of CT for a rapid diagnosis of samples with low bacterial burden. Cytocentrifugation has higher sensitivity than CC and enhances bacterial observation in Gram stained samples, especially in samples with a low cellular concentration.

Key words: Cytocentrifugation; Bacterial rapid diagnosis; body fluids.

INTRODUCCIÓN

El diagnóstico rápido de microorganismos presentes en fluidos corporales estériles, como son el LCR, líquido pleural, peritoneal o articular, es de gran importancia para el diagnóstico de infecciones que, en estas localizaciones, son generalmente graves y secuelantes. La tinción de Gram constituye una herramienta de gran utilidad en el diagnóstico etiológico; sin embargo, la sensibilidad de esta técnica es variable según el tipo de muestra y la carga bacteriana presente en ella. La concentración de la muestra, como un paso previo a su tinción mejora el rendimiento, por lo que es recomendable su uso de rutina. Se ha descrito que la citocentrifugación, ampliamente utilizada en citología, podría ser de utilidad en la disciplina microbiológica¹. Esta técnica permite reducir la cantidad de muestra necesaria para centrifugar y obtener preparaciones uniformemente concentradas en un área de 6 mm de diámetro. Con esto, aumenta el rendimiento de la técnica y la sensibilidad en la observación bacteriana y celular.

El objetivo de este trabajo es evaluar la utilidad de la citocentrifugación en comparación con la centrifugación convencional como método de concentración de fluidos corporales estériles, previo a la tinción de Gram, para observar bacterias y células.

MATERIAL Y MÉTODO

Entre octubre de 1997 y junio del 2001 se estudiaron 52 muestras de cavidades estériles provenientes de pacientes hospitalizados en el Hospital Clínico de la Pontificia Universidad Católica de Chile. Las muestras correspondieron a trece LCR, diez líquidos peritoneales, siete líquidos de diálisis peritoneal, ocho líquidos pleurales, ocho líquidos articulares, un líquido pericárdico, un lavado broncoalveolar, una secreción bronquial obtenida a través de cepillo protegido, un líquido biliar, una secreción de flictena y una colección subfrénica.

Todas estas muestras fueron obtenidas con técnica aséptica y derivadas al Laboratorio de Urgencia para su procesamiento, donde fueron separadas para centrifugación convencional (CC) y citocentrifugación (CT). Además se realizó la siembra para cultivo corriente aeróbico en placas de agar sangre de cordero al 5%, agar chocolate, agar Mac Conkey y tubos de caldo corriente. Cuando se solicitó cultivo anaeróbico, la muestra se inoculó en medio de transporte anaeróbico (PortagermÒ, Biomerieux) y se sembró en agar sangre anaerobio y caldo tioglicolato, incubándose en atmósfera anaeróbica. Cuando hubo desarrollo bacteriano, la identificación y susceptibilidad bacteriana se realizaron por procedimientos habituales².

Para la centrifugación convencional se utilizó como mínimo 1 ml de muestra, que se centrifugó a 3.000 rpm durante 5 minutos en una centrifuga Jouan CR3i. Del sedimento se tomó una gota en un portaobjetos para la observación de celularidad y tinción de Gram. Para la citocentrifugación se utilizó una cámara plástica desechable para muestras, compuesta por un Cytofunnelâ donde se carga la muestra; un portaobjetos convencional y un Cytoclipâ que sostiene el sistema (Figura 1). Una vez montado el sistema, se carga la muestra con un volumen máximo de 0,5 ml. El sistema se centrifugó a 2000 rpm durante 10 minutos en una citocentrífuga Cytospin Shandonâ Inc. De la citocentrifugación se obtuvo una mono capa celular concentrada en un área de 6 mm de diámetro, donde se evaluó celularidad y tinción de Gram. Ambos frotis, obtenidos por CC y CT fueron leídos por el mismo observador.

En las muestras con aspecto macroscópico turbio y/o hemorrágico, se realizó una dilución previa de ésta con agua destilada estéril para permitir la lisis de eritrocitos, y una mejor individualización de bacterias y leucocitos. La dilución se realizó agregando 450 µL de agua destilada a 50 µL de muestra.

La celularidad fue evaluada utilizando una escala semicuantitativa con respecto al objetivo de inmersión (aumento total de 1.000x), donde una cruz correspondió al hallazgo de 1 a 5 leucocitos por campo, dos cruces correspondieron al hallazgo de 6 a 10 leucocitos por campo y tres cruces a más de 10 leucocitos por campo de inmersión.

Para los cálculos de sensibilidad y especificidad, se consideró como infección de sitio estéril el cultivo corriente aeróbico y/o anaeróbico positivo con presencia de leucocitos. En los casos con cultivo negativo pero con presencia de leucocitos y con bacterias observables en la tinción de Gram realizada por CT, se realizó una revisión de la ficha clínica considerando como infección de sitio estéril el criterio clínico de inicio de tratamiento antimicrobiano posterior a la obtención de la muestra. Se consideraron muestras no infectadas aquellas con cultivo negativo y sin células inflamatorias en la tinción de Gram.

RESULTADOS

De las 52 muestras provenientes de sitios estériles 18 fueron consideradas sugerentes de infección: 15 de ellas con cultivo positivo y 3 con cultivo negativo De las 18 muestras sugerentes de infección, 10 fueron positivas para ambas técnicas de concentración, 1 positiva sólo por CC, 6 positivas sólo por CT y una negativa por ambas técnicas pero con cultivo positivo para E. coli (Tabla 1).

La sensibilidad y especificidad de CC fue de 61 y 100%, respectivamente. Para CT la sensibilidad y especificidad fue de 89 y 100%, respectivamente (Tablas 2 y 3).

La celularidad en las 18 muestras sugerentes de infección clínica evaluada por CC y CT fue similar para ambas técnicas (en 17/18 muestras se observaron leucocitos por CC versus 18/18 por CT). Sin embargo, al cuantificar la celularidad, se observó un aumento de los leucocitos de CT con respecto a CC (Tabla 4).

La Figura 2 muestra la presencia de diplococos Gram (-) capsulados en una muestra de LCR, cuya extendido fue realizado por CT, observándose la calidad de la morfología celular.

DISCUSIÓN

Nuestros resultados muestran que la citocentrifugación como método de concentración de la muestra para realizar tinción de Gram es más sensible que la centrifugación convencional, lo que puede ser de gran ayuda en el estudio microbiológico de los líquidos de cavidades estériles cuando se sospecha una infección.

Otra ventaja de este método es que requiere un volumen mínimo de muestra (< 0,5 µL) lo que resulta de gran utilidad en punciones de las que se obtiene escaso volumen de líquidos.

Si bien no fue el objetivo de este trabajo evaluar el tiempo requerido para la observación de la tinción de Gram al microscopio, se pudo apreciar un menor tiempo de observación de la preparación, ya que los elementos (células, bacterias y leucocitos) son concentrados en un área de 6 mm, lo que facilita la visualización y caracterización de los leucocitos, permitiendo efectuar recuentos diferenciales de líquidos con escasa celularidad.

Estos resultados son concordantes con los de Ho-Soon et al⁴ la serie más grande publicada en procedimiento citológico. En el área microbiológica, ChapinRobertson¹ y Shanholtzer⁵ concluyeron que la citocentrifugación permite obtener una mayor sensibilidad para la visualización bacteriana y una mejor calidad de la morfología leucocitaria. También se ha descrito la utilidad de la citocentrifugación en la detección de antígenos de Mycobacterium tuberculosis en LCR para técnicas inmunocitológicas⁶, la detección de Pneumocystis carinni en lavado bronquioalveolar⁷, y para el estudio citólogico en líquido articular⁸.

Respecto de las desventajas de este método es necesario mencionar el costo elevado de la citocentrífuga y de los insumos necesarios (Citofunnelâ), que deben ser estériles y desechable, ya que hay referencias en la literatura de un pseudobrote de meningitis en un hospital cuyo laboratorio reutilizaba los Citofunnelâ³. Sin embargo, el ahorro de tiempo y la mejoría en la sensibilidad en la observación microscópica con esta técnica, la hacen recomendable para muestras de cavidades estériles con bajo recuento celular o frente a sospecha clínica de infección severa con tinción de Gram negativa por el método de concentración convencional.

RESUMEN

El diagnóstico rápido de microorganismos presentes en fluidos corporales estériles es de gran importancia clínica. La tinción de Gram constituye la principal herramienta para el diagnóstico de estas infecciones, pero la sensibilidad de esta técnica varía según el tipo de muestra y la carga bacteriana presente en ella. La concentración de la muestra previa a la tinción, mejora el rendimiento pero requiere volúmenes significativos de la muestra. La citocentrifugación resulta útil ya que requiere escaso volumen de muestra y permite obtener preparaciones uniformemente concentradas. Con el objetivo de evaluar la utilidad de la citocentrifugación en el diagnóstico de infecciones de fluidos corporales, se estudiaron 52 muestras de fluidos de cavidades estériles recibidas en el Laboratorio de Urgencia del Servicio de Laboratorios Clínicos de la Red de Salud UC. Las muestras fueron separadas para centrifugación convencional (CC) a 3000 rpm por 5 minutos (centrífuga Jouan CR3i â) y para citocentrifugación (CT) a 2000 rpm por 10 minutos (Citocentrífuga Cytospin Shandon Incâ). Del sedimento obtenido por CC se realizó un frotis para tinción de Gram y cultivo. De la CT se obtuvo una mono capa celular concentrada en un área de 6 mm de diámetro para tinción de Gram. Ambos frotis fueron leídos por el mismo observador. De las 52 muestras analizadas, 18 fueron sugerentes de infección clínica. La sensibilidad para CT v CC fue de 89% y 61%, respectivamente. La especificidad fue de 100% para ambas técnicas. En una evaluación cuantitativa de la celularidad de las muestras, se observó un aumento de los leucocitos en la CT con respecto a CC. Estos resultados muestran que la CT puede ser de gran ayuda en el diagnóstico rápido de las infecciones de fluidos corporales con baja carga bacteriana. Presenta una mayor sensibilidad y facilita la visualización de bacterias, especialmente en muestras con bajo recuento celular.

BIBLIOGRAFÍA

1.- Chapin-Robertson K, Dahlberg S E, Edberg S C. Clinical and laboratory analyses of cytospin-prepared gram stains for recovery and diagnosis of bacteria from sterile body fluids. J Clin Microbiol 1992; 30: 377-80.

2.- Baron E J, Murray P R. Bacteriology. Murray P R; Baron E J; Pfaller M A; Tenover F C; Yolken R H. Manual of Clinical Microbiology. 7th Edition.Washington DC. ASM Press, 1999; Pag 246-830.

3.- Southern P M, Colvin D B. Pseudomeningitis again. Association with cytocentrifuge funnel and Gram-stain reagent contamination. Arch Pathol Lab Med1996; 120: 456-458.

4.- Ho-Soon H C, Anderson P J. Diagnostic cytology of cerebrospinal fluid by the cytocentrifuge methods. Am J Clin Pathol 1979; 72: 931-43.

5.- Shanholtzer C J, Schaper P J, Peterson L R. Concentrated Gram stain smears prepared with a Cytospin centrifuge. J Clin Microbiol 1982; 16:1052-6.

6.- Sumi M G, Mathai A, Reuben S, Sarada C, Radhakrishnan V V. Immunocytochemical method for early laboratory diagnosis of tuberculous meningitis. Clin Diagn Lab Immunol 2002 Mar: 9: 344-7.

7.- Jacobs J A, Dieleman M M, Cornelissen E I, Groen E A, Wagenaar S S, Drent M. Bronchoalveolar lavage fluid cytology in patients with Pneumocystis carinii pneumonia. Acta Cytol 2001 May: 45(3): 317-26.

8.- Moreno M J, Clayburne G, Schumacher H R Jr. Processing of noninflammatory synovial fluids with hyaluronidase for cytospin preparations improves the accuracy of differential counts. Diagn Cytopathol 2000 Apr; 22(4); 256-8.

¹ Servicio de Laboratorios Clínicos, Unidad Docente Asociada de Laboratorios Clínicos. Pontificia Universidad Católica de Chile.

Correspondencia a:
Juan Díaz Peña
E-mail: jdiazpe@puc.cl